人爆破模拟胚发育和植入的协议

国际干细胞研究学会（ISSCR）的干细胞研究和临床转化指南建议，只有在通过专门的科学和伦理审查程序进行审查和批准后，才允许对人类胚泡进行研究3，4。所有实验程序均按照奥地利科学院分子生物技术研究所（IMBA）人类研究伦理委员会的指导方针进行，批准Rivron_Stellungnahme_2020-04-22。遵守这些准则对于在科学期刊上发表研究成果是必要的。 1. PXGL条件下人幼稚胚胎干细胞的培养 注意：幼稚的hPSC可以从相关实验室获得。这里使用的线是从Yasuhiro Takashima（目前位于日本京都的CiRA）和Austin Smith（目前位于英国埃克塞特的生命系统研究所）的实验室获得的。或者，朴素的hPSC可以在内部从引物hPSC的行 中 复位，如前所述13，14。对于多个传代，幼稚的hPSCs似乎稳定（>15），但培养的质量可能随时间而变化。如果幼稚 hPSC 的质量降低，请解冻一小瓶新的细胞或从引物的 PSC 中生成 从头 的幼稚 hPSC。对于所有介质成分，请参见 补充表1。 辐照小鼠胚胎饲养层（MEFs）的制备 在传代幼稚的hPSCs的前一天，按照下面描述的步骤制备具有辐照MEF层的6孔细胞培养板。 每孔在PBS中涂有1mL 0.1%明胶的6孔细胞培养板。将板在37°C下孵育30分钟。取出明胶溶液。 在37°C下制备MEF培养基。 在37°C的水浴中解冻MEF，直到只剩下一个小冰块。使用P1000移液器用1mL制备的MEF培养基溶解小瓶的体积。 将细胞悬浮液转移到15 mL管中。以200× g 旋转悬浮液4分钟。吸出上清液并通过加入新鲜的MEF培养基（每孔足以容纳1.5mL）重悬MEF沉淀。 使用细胞计数载玻片计数细胞，每孔加入300，000个细胞，并将板转移到37°C的常氧培养箱中。注意：如果 MEF 随时间推移而分离，则在常规介质更换期间，可以将新的 MEF 添加到 PXGL 介质中。 人类幼稚多能干细胞的传代 在传代hPSC之前，在显微镜下检查其形态。菌落通常具有圆顶形形态，具有明亮，清晰的边界。如果单个菌落表现出更扁平的形态，或者分化的菌落开始出现，请按照步骤1.2.8的说明进行操作。 吸出培养基并用PBS洗涤细胞一次。每孔6孔板加入500μL细胞分离溶液。 将细胞在37°C下孵育5分钟。 使用P1000移液器并将细胞移液几次以将集落解离成单个细胞。 收集细胞并将其转移到含有洗涤缓冲液的15mL管中（每孔6孔板1mL）。以200× g 旋转细胞4分钟。 吸出上清液并将沉淀重悬于新鲜的PXGL培养基中（每孔足以容纳1.5mL）。考虑1：3-1：6的分裂比进行常规传代。注意：每3-4次传代后，或者如果细胞培养质量根据细胞形态降低（例如，群体中出现扁平菌落），则在传代后的前24小时内向培养基中加入10μM Y-27632和生长因子基底膜提取物（5μL /孔）。 在重新电镀hPSCs之前，通过吸出MEF培养基并用PBS洗涤细胞一次来制备具有新鲜MEF的板。然后，使用P1000移液管在含有MEF的6孔板的每孔中转移1.5mLh的hPSCs细胞悬浮液。注意：确保移液导致细胞在整个孔区域均匀接种。这将确保细胞具有均匀大小和相对同步的集落的生长。 在37°C的缺氧条件下在加湿环境中培养hPSCs。24小时后，应连接hPSC。大量非贴壁（或漂浮）细胞反映了传代时的活力或附着问题。 每天用每孔1.5 mL PXGL培养基更换培养基。每3-4天通过一次hPSCs，或将其用于胚泡形成实验。注意：解冻hPSC后，在开始胚层实验之前，将它们传代至少三次。 2. 胚泡的形成 幼稚 PSC 聚集体的形成 在开始实验之前，准备并预热PXGL培养基，N2B27基础培养基，洗涤缓冲液，PBS和聚集培养基。按照下面描述的步骤，从hPSCs悬浮液中排除用于形成胚层的MEF。 对于MEF排除，通过将1mL 0.1%明胶加入6孔板的孔中并在37°C下孵育30-90分钟来制备明胶包被的板。 要收获细胞，吸出培养基并用1mL PBS洗涤细胞。 加入500μL细胞分离溶液（每孔6孔板的孔）并在37°C下孵育5分钟。 在显微镜下检查细胞以跟踪集落解离成单细胞（稍后可以通过温和移液解离一些多细胞团块）。 用1mL洗涤缓冲液稀释细胞分离溶液。通过轻轻移液5至10次从板中收集细胞。将细胞悬浮液转移到15 mL管中。以200× g 旋转细胞4分钟。 吸出上清液，将细胞重悬于1.5mL PXGL培养基（每孔6孔板）中，并将细胞接种在明胶包被的平板上以排除MEF，并在37°C下孵育60-90分钟。 一旦接种幼稚细胞以排除MEF，从微孔中除去PBS并用200μL基底N2B27培养基（每1个微孔芯片）平衡孔，并在37°C下孵育60分钟。 收集含有未连接的幼稚细胞的上清液，将其转移到15mL管中，并以200× g 旋转细胞4分钟。 吸出培养基并将细胞重悬于1mL N2B27基础培养基中。使用细胞计数载玻片对细胞进行计数。以200× g 旋转细胞4分钟。 吸出培养基并加入N2B27培养基中含有的适当量的10μM Y-27632，以获得每50μL30，000个细胞的细胞密度。注意：最佳初始接种细胞数量可能因不同细胞系而异。例如，要接种50-60个细胞/微孔，将30，000个细胞（包括考虑到某些细胞落在微孔外的剩余细胞）接种在包含430个微孔的96孔板的1孔中。不适当的起始细胞数可能导致没有空腔的小聚集体形成或形成达到250μm以上的空化结构。 从平衡的微孔阵列中吸取培养基，并用10μM Y-27632加入25μLN2B27培养基。加入50μL细胞悬浮液并在37°C下孵育15分钟（直到细胞落入微孔底部）。然后，加入125μL补充有10μM Y-27632的N2B27培养基。 胚层发育 在24小时内，可以在微孔芯片上观察到幼稚hPSC的聚集体（第0天）。要启动类卵泡形成，请准备PALLY培养基并按照下面概述的步骤进行操作。 在37°C下预热PALLY培养基30分钟。注意：1-油酰赖氨酸（LPA）和10μM Y-27632需要在使用前添加。LPA的最佳浓度在0.5-5μM之间变化。对于用于胚泡的单个 hPSC 管路，必须对其进行滴定。 吸出聚集培养基。向微孔中加入200μL预热的PALLY培养基。将细胞培养板放回37°C的缺氧培养箱中。 在第 1 天重复更换介质。 在第2天，取出PALLY培养基并加入200μL补充LPA和10μM Y-27632的N2B27培养基。注意：在第2天，大多数聚合继续增长。然而，一些聚集体形成小空腔。从第2天开始，在PALLY中连续培养类卵泡至第4天或在 体外 培养基（IVC1）中培养。然而，在这种培养基变化之后，增强成熟卵泡中PrE的形成。 在第 3 天重复更换介质。在第4天完全形成胚泡。注意：当类胚层基于第7天人类囊胚的形态测量学（例如，直径范围为150-250μm;一个内部簇被滋养外胚层样细胞的上皮包围）并且已经形成极性滋养外胚层样细胞（NR2F2 + / CDX2-）和PrE样细胞（GATA4 +）时，囊状体被认为已经完全发育。这可以通过免疫荧光染色或荧光活化细胞分选（FACS）进行评估。 3. 在96孔超低附着微孔板中形成胚层 按照上述步骤2.1.1 – 2.1.11准备幼稚的hPSCs细胞悬浮液以形成胚泡。 吸出培养基并加入适量含有10μM Y-27632的N2B27培养基，以获得每100μL培养基70个细胞的细胞密度。注意：最佳初始接种细胞数量可能因不同细胞系而异。例如，70个细胞/孔可能是大多数细胞系的最佳细胞数。 在室温下以200× g 离心板2分钟，以将细胞聚集在孔底部。 在缺氧培养条件下在37°C的培养箱中孵育板。在24小时内，可以在孔上观察到幼稚的hPSC的聚集体（第0天）。 准备 2x 帕利培养基。向孔中加入100μL预热的2x PALLY培养基。 将细胞培养板放回37°C的缺氧培养箱中。 24小时后，吸出一半的培养基（100μL）并用100μL预热的PALLY培养基替换它。重复该步骤，直到第4天。确保不要吸出骨料。注意：在第 2 天，大多数聚合继续增长。然而，一些聚集体具有小的充满液体的空腔。在第4天，大多数空化结构经历完全形态发生以形成囊胚样结构。 4. 滋养层的形成 对于滋养层的形成，遵循从步骤2.1.1（MEF排除）到步骤2.1.12（播种方案的最后一步）的胚泡形成方案。 一旦24 h后形成幼稚hPSCs的聚集体，用补充有3μM SC-144的PALY（无LIF）交换聚集培养基，形成代表早期滋养外胚层的滋养层，并用2μM XMU-MP-1补充PALLY形成代表成熟滋养外胚层的滋养层。 每天刷新培养基。在第4天完全形成滋养层。 5. 使用 scRNAseq 分析胚细胞状态及其反射阶段 要拾取胚泡并进行解离，请将振荡培养箱加热至37°C并将其设置为100 rpm。 从初始 96 孔板中收集胚泡，并使用配备玻璃毛细管的口移液管将其转移到 U 型底 96 孔板的多个孔中。注意：胚层（>70%）应根据形态测量标准（尺寸= 150-250μm，具有独特的内部团簇）选择，以避免被非胚层结构污染（<30%）。 使用P200用200μLPBS洗涤一次，方法是在立体显微镜下观察。转移到含有50μL胶原酶的孔中，并在振荡培养箱中孵育30分钟。 将胚芽转移到装有100μL胰蛋白酶-EDTA的孔中并充分混合。在振荡培养箱中孵育20分钟。 使用P200移液器将胚泡解离成单细胞。将细胞转移到具有FACS缓冲液（PBS中1S）的15mL管中。 为了捕获三个谱系的类似物的特定比率，请分别用TROP2和PDGFRa抗体染色TE和PrE类似物。注意：与小鼠囊胚相比，人囊胚中PrE细胞的数量较少，这可能反映了通过 体外 受精（IVF）形成的囊胚的发育缺陷或物种差异。在胚泡中，PrE类似物不如TE和EPI类似物丰富，并且在通过免疫荧光成像计数GATA4 +细胞时占细胞的7.4%。此外，解离过程可能会在类卵样蛋白解离，PDGFRa标记和FACS分析时诱导不同细胞类型的比例偏差，如PrE类似物，代表1%-2%的细胞。 将来自所有三个谱系类似物的FACS细胞分选到384个板中，该板包含用于smart-seq2分析的裂解缓冲液。排除由DAPI染色标记的死细胞（根据制造商的说明进行）。 为了评估细胞状态（细胞类型和发育阶段），将来自blathoid的转录组数据与适当的对照进行比较。 6. 扩大培养以评估胚泡发育进展 在基底膜基质涂层板（玻璃底部）上培养人芽样蛋白。 用基底膜基质涂覆板。 目视检查胚芽体以评估和记录形态。注意：只有具有紧凑型ICM的经典空心球囊胚形态的胚芽才具有进一步生长和发育的潜力。 每孔96孔板中每孔加入100μLCMRL培养基-1，并将板置于培养箱中至少2小时，然后胚泡转移以进行平衡。 使用立体显微镜，目视识别具有良好形态的胚芽，将选定的胚泡转移到含有100μlCMRL培养基-1的96孔板中以除去胚层的痕迹。 将胚泡转移到含有预平衡CMRL介质-1的孔中。将板放入培养箱中并在37°C下孵育过夜。注意：在96孔板的一个孔中可以培养多达5个胚芽。单个井中有太多的胚泡可能导致形成多个胚层的聚集体。 第二天，在显微镜下目视检查胚泡。如果附着了胚泡，则加入100μL预平衡的CMRL培养基-1，并补充5%基底膜基质。将板置于培养箱中并在37°C下孵育过夜。 第二天，在显微镜下监测胚泡。除去一半的培养基（100μL），并用100μL预平衡的CMRL培养基-2代替，并补充5%基底膜基质。 在接下来的几天里，用预先平衡的CMRL培养基-3替换一半的培养基（100μL），并补充5%基底膜基质。将板置于培养箱中并在37°C下孵育过夜。每天重复，进行长达4-6天的 体外 培养。注意：我们在延长培养条件下将类卵泡培养长达6天，相当于 体外 培养人类胚胎的第13天的时间。 7. 免疫染色类卵泡 吸出培养基。用PBS洗涤样品3次5分钟。 在PBS中加入200μL冷的4%多聚甲醛（PFA），并在室温下固定样品30分钟。取出PFA溶液，用PBS洗涤样品3次10分钟。注意：如果在微孔芯片上培养胚泡，则将胚泡从芯片转移到96孔U型底板中，以执行以下步骤。 在每孔100μL封闭溶液（PBS含有0.3%Triton-X 100和10%正常驴血清）中渗透并阻断胚泡60分钟。注意：根据抗体的宿主物种，相应地调整血清。 删除阻止解决方案。加入100μL在新鲜封闭溶液中稀释的一抗，并将样品在4°C下孵育过夜。注意：一抗的浓度必须根据制造商的说明确定。 在PBS（洗涤溶液）中用0.1%Triton-X 100洗涤样品3次10分钟。在封闭溶液中加入100μL二抗以及20μg/ mL Hoechst核染色剂，并在室温下将样品孵育1小时。保护样品免受光照。注意：二抗的浓度必须根据制造商的说明确定。 用洗涤溶液洗涤样品3次10分钟。对于成像，将样品转移到玻璃底μ PBS中。注意：应根据用于成像的物镜选择安装介质。例如，PBS中80%的甘油可用于在使用油物镜时安装样品。