Eine schwerkraftgespeiste transkardiale Perfusionsmethode zur histologischen Analyse des zentralen Nervensystems der Maus

Die in diesem Protokoll dargestellten Daten und experimentellen Schritte wurden mit C57BL/6J-Mäusen generiert. Alle Methoden mit Tieren wurden vom State University of New York Upstate Medical University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. 1. Bau von Perfusionsapparatur und Dissektionsplattform Wie in Abbildung 1 gezeigt, schneiden Sie die inneren Strohhalme aus zwei 500-ml-Waschflaschen ab, indem Sie diese bündig mit einer scharfen Rasierklinge auf die Innenseite des Schraubverschlusses schneiden. Schneiden Sie ein 4 cm x 4 cm großes quadratisches Loch in den Boden jeder Pufferflasche. Schneiden Sie ein kleines Loch in den Boden jeder Flasche, um den Durchgang eines gebogenen Edelstahl-Mikrospatels zu ermöglichen. Erstellen Sie eine “S” -förmige Biegung in den Mikrospateln, so dass sie als Haken zum Aufhängen der Pufferflaschen verwendet werden können. Legen Sie die gebogenen Mikrospatel in die entsprechenden Öffnungen in den Pufferflaschen. Schneiden Sie zwei 25 cm lange Schläuche aus und verbinden Sie diese fest mit den äußeren Flaschenstrohauslässen. Verbinden Sie die Enden dieser Rohre mit dem Y-Stecker. Schneiden Sie 2 m Schlauch und verbinden Sie diesen mit dem freien Ende des Y-Steckers. Entfernen Sie den Kolben von der 1 ml Spritze und schneiden Sie die Spritze ca. 6 cm von der Spritzenspitze weg. Schneiden Sie die Spritze ab, indem Sie zuerst den Kunststoff mit einer Rasierklinge ritzen und dann den Spritzenkunststoff scharf schnappen. Führen Sie die geschnittene Vorderseite der Spritze in das freie Ende des Kunststoffschlauchs ein. Einsatz bis zu einer ausreichenden Tiefe, um eine dichte Abdichtung zu gewährleisten.HINWEIS: Es ist wichtig, dass alle Verbindungen innerhalb der Perfusionsvorrichtung ausreichend dicht sind, um Leckagen zu vermeiden. Bei losen Verbindungen können kleine Edelstahl-Schlauchschellen nach Belieben an Kreuzungen platziert und festgezogen werden, um bei Bedarf eine dichte Abdichtung zu gewährleisten. Kennzeichnen Sie eine Pufferflasche als PFA und eine Flasche als PBS (Puffer). Messen Sie etwa 1/3 der Länge weg von der Flaschenöffnung und ziehen Sie an dieser Stelle eine Linie um den Flaschenumfang, um den entsprechenden Füllstandder perfusatierten Lösungen anzuzeigen. Richten Sie sich auf und erstellen Sie dann eine Schlaufe in einer großen Büroklammer, die um den Umfang des Schlauches passt. Platzieren Sie diese Schlaufe um den Schlauch nur proximal zur Spritze. Legen Sie einen Styroporblock in die Glasschale. Legen Sie die Enden der Büroklammer in den Styroporblock, um den Schlauch zu befestigen. Heben Sie mit Papiertüchern das vordere Ende der Glasschale um ca. 2 cm an.HINWEIS: Dadurch wird die Maus in etwa 20° der Trendelenburg-Position (Rückwärtsneigung) platziert, um eine einfachere Visualisierung der Membran während der Dissektion zu ermöglichen und die Drainage von Flüssigkeiten während der Perfusion zu fördern. Abbildung 1: Diagramm der montierten Perfusionsapparatur. Abkürzungen: PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; PFA = Paraformaldehyd. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. 2. Herstellung einer Paraformaldehydlösung (PFA) HINWEIS: PFA-Lösung muss am Tag der Perfusion frisch zubereitet und am Ende der Perfusion in einem dafür vorgesehenen Abfallbehälter vor der Entsorgung durch geschultes Personal entsorgt werden. Dieses Protokoll macht 1 L von 4% PFA-Lösung, die ausreicht, um ungefähr 4 Mäuse zu perfundieren. PFA ist hochgiftig, und es muss darauf geachtet werden, dass Inhalation oder direkter Hautkontakt in pulverisierter oder flüssiger Form vermieden werden. Die meisten Vorbereitungsschritte werden daher mit Handschuhen, Schutzbrillen und einem Laborkittel unter einer Abzugshaube durchgeführt. Spülen Sie ein 1-Liter-Becherglas mit destilliertem Wasser aus und füllen Sie es mit ca. 800 ml 18 mΩ molekularbiologischem H2O. Erhitzen Sie das Becherglas von H2O in einer Mikrowelle für 3 min oder bis die Wassertemperatur 65 °C erreicht. Auf eine Heiz-/Rührplatte legen, die in einem Abzug aufbewahrt wird. Spülen Sie einen Rührstab mit destilliertem Wasser aus und legen Sie ihn in das heiße Wasser. Starten Sie den Rührer und drehen Sie die Kochplatte auf mittlere Hitze. Achten Sie darauf, dass die Wassertemperatur nicht über 70 °C steigt. Tragen Sie eine chirurgische Maske, Handschuhe, Schutzbrille und Laborkittel und messen Sie 40 g PFA-Pulver. Gießen Sie dieses Pulver in das erhitzte Wasser. Verwenden Sie eine Transferpipette und fügen Sie der Lösung einige Tropfen 5 M NaOH hinzu. Lassen Sie das PFA-Pulver vollständig auflösen. Wenn sich das Pulver nach einigen Minuten nicht vollständig aufgelöst hat, fügen Sie nach Bedarf Tropfen von 5 M NaOH hinzu. Sobald sich fast die gesamte PFA aufgelöst hat (erscheint leicht trüb), stoppen Sie das Rühren / Erhitzen und fügen Sie sofort 100 ml 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzu. Zum Schluss das Wasser mit 18 mΩ Molekularbiologie-GradH2 Oauf die 1-L-Markierung auf dem Becherglas auffüllen.Decken Sie das Becherglas mit Plastikfolie ab und legen Sie es in einen -20 ° C-Gefrierschrank, bis die Lösung Raumtemperatur erreicht (ca. 45 min). Kalibrieren Sie ein pH-Messgerät mit den entsprechenden Standards. Während sich das Becherglas auf einer Rührplatte befindet, messen Sie den pH-Wert der Lösung und fügen Sie HCl hinzu, bis der pH-Wert 7,4 erreicht. Falls erforderlich, fügen Sie 5 M NaOH hinzu, um den pH-Wert zu erhöhen, wenn er zu niedrig ist. Schließen Sie einen Isolierkolben an das Vakuum an und legen Sie einen sauberen Büchner-Keramiktrichter mit Filterpapier in den Kolben. Schalten Sie das Vakuum ein und befeuchten Sie das Filterpapier mit einer Transferpipette, die mit der 4%igen PFA-Lösung gefüllt ist. Gießen Sie die 4% ige PFA-Lösung langsam auf das Filterpapier, bis die gesamte Lösung gefiltert ist. Die gefilterte Lösung in einen sauberen, lichtgeschützten Behälter geben und bis zur Verwendung bei 4 °C lagern (nicht länger als 24 h lagern). 3. Transkardiale “pumpenfreie” Perfusion Legen Sie im Abzug einen Styropor-Sezierblock in eine Glasschale. Stellen Sie sicher, dass der Sezierblock 5-6 kurze Nadeln zum Zurückhalten der Maus während der Operation und 2 lange Nadeln zur Unterstützung des Perfusionsschlauchs enthält. Spülen Sie die Perfusionsvorrichtung mit destilliertem Wasser ab. Lassen Sie das gesamte Wasser abfließen, bevor Sie das Perfusionsgerät aufhängen. Hängen Sie die Perfusionsflaschen 1 m über das durchblutete Tier (für eine 20-30 g Maus). Bereiten Sie eine nicht sterile Lösung von 1x PBS mit 10x PBS vor, die mit 18 mΩ H2O molekularbiologischer Qualität verdünnt ist. Wie in Abbildung 2 gezeigt, klemmen Sie die Hauptleitung der Perfusionsapparatur mit einem Hämostat ein. Klemmen Sie die PFA-Linie mit einem anderen Hämostaten.HINWEIS: Eine Okklusion mit mehreren Hämostaten kann pro Leitung erforderlich sein, um den Fluss vollständig zu verhindern. Füllen Sie den Pufferbehälter mit 1x PBS bei Raumtemperatur. Legen Sie das Spritzenende der Perfusionsvorrichtung in ein Becherglas, um Abfallpuffer zu sammeln, und entfernen Sie den Hämostat, der die Hauptleitung verdeckt (Abbildung 2, links). Lassen Sie PBS durch die Leitung strömen, während Sie eingeschlossene Luft entfernen, indem Sie kräftig auf die Wände des Rohrs klopfen. Sobald die gesamte Luft aus dem Puffer und den Hauptleitungen entfernt wurde, schließen Sie die Strömung ab, indem Sie einen Hämostat auf die Hauptleitung legen. Entfernen Sie den Hämostat aus der PFA-Linie und lassen Sie das PBS rückläufig bis zur PFA-Flasche fließen, während Sie alle Blasen in der PFA-Linie anzapfen (Abbildung 2, Mitte). Lassen Sie das PBS weiterhin in die PFA-Linie, bis PBS direkt über der Öffnung der Flasche zu sehen ist. Okkludieren Sie die PFA-Linie mit einem Hämostat, um den Fluss in die PFA-Flasche zu stoppen. Verbinden Sie die Schmetterlingsinfusionsnadel mit der Perfusionsspritze und spülen Sie PBS durch die Leitung (durch Öffnen des Hauptleitungshämostaten), um Blasen aus der Perfusionsspritze zu entfernen. Schließen Sie die Hauptleitung Hämostat. Stellen Sie sicher, dass die PBS-Flasche jetzt ungefähr 1/3voll mit PBS ist. Falls erforderlich, spülen Sie PBS durch die Hauptleitung oder füllen Sie mehr PBS in die Pufferflasche, bis 1/3 ihrer vollen Kapazität erreicht ist. Sobald alle Blasen aus den PBS-, PFA- und Hauptlinien entfernt wurden, füllen Sie die PFA-Flasche mit 4% PFA-Lösung bei Raumtemperatur bis zur schwarzen Markierung auf der Flasche (ca. 1/3der Füllung ) (Abbildung 2, rechts). Abbildung 2: Vorbereitung des Perfusionsapparates für die Perfusionschirurgie. Schließen Sie zuerst die PFA-Linie Hämostat und öffnen Sie die Hämostat auf der PBS-Linie und der Hauptleitung. Füllen Sie PBS und entfernen Sie Blasen von der PBS-Leitung und der Hauptleitung. Als nächstes füllen Sie die PFA-Linie mit PBS, indem Sie den Hämostat auf der PFA-Linie öffnen und den Hämostat auf der Hauptlinie schließen. Entfernen Sie Blasen in der PFA-Linie. Schließen Sie schließlich den Hämostat auf der PFA-Linie, wenn der PBS die Öffnung der PFA-Flasche erreicht. Füllen Sie die PFA-Flasche 1/3voll PFA. Stellen Sie sicher, dass der PBS-Füllstand in der PBS-Flasche 1/3voll ist, und füllen Sie entweder mit PBS oder lassen Sie PBS ab, indem Sie bei Bedarf die Hämostat der Hauptleitung öffnen. Abkürzungen: PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; PFA = Paraformaldehyd. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Bereiten Sie sich auf eine Nicht-Überlebensoperation vor, indem Sie die folgenden Instrumente mit Wasser reinigen, gefolgt von 70% Ethanol: große Schere, feine Sezierschere, Hautzange, feine fenestrierte gebogene Pinzette. Bereiten Sie die Anästhesie vor, indem Sie staubfreie Tücher in einen 50 ml konischen Schlauch legen. In einem Abzug die staubfreien Tücher gründlich mit Isofluran einweichen und das geöffnete Rohr kopfüber in ein 500 ml Becherglas legen. Stellen Sie sicher, dass kein flüssiges Isofluran am Boden des Becherglases vorhanden ist, und entsorgen Sie flüssiges Isofluran, bevor Sie eine Maus in das Becherglas legen. Legen Sie die Maus in das Becherglas und legen Sie Plastikfolie über die Öffnung, um mit der Anästhesie zu beginnen. Führen Sie eine Anästhesie durch, bis die Maus aufhört zu atmen (ca. 1 min und 30 s). Wenn die Atmung aufgehört hat, entfernen Sie sofort die Maus aus dem Becherglas und ersetzen Sie die Kappe auf dem 50 ml konischen Schlauch. Überprüfen Sie, ob die Maus ausreichend betäubt ist, indem Sie den Zehenquetschreflex verwenden. Wenn das Tier nicht ausreichend betäubt ist, verabreichen Sie mehr Isofluran wie in Schritt 3.15 beschrieben. Wenn Sie schnell arbeiten, legen Sie die Maus auf den Styroporblock und stecken Sie die Pfoten mit vier kurzen Nadeln (z. B. 22 G Spritzennadeln) nach außen. Wenn Sie die Bauchhaut mit einer Hautzange anheben, schneiden Sie mit der großen Schere durch die Bauchdecke. Achten Sie darauf, dass keine Bauchorgane durchtrennt werden! Setzen Sie den Bauchschnitt überlegen in Richtung Leber fort. Lösen Sie die Leber von der vorderen Bauchdecke und setzen Sie den anfänglichen Schnitt überlegen in Richtung Zwerchfell fort. Stoppen Sie diesen Schnitt ca. 1 cm tiefer als das Zwerchfell. Achten Sie darauf, dass die Leber nicht geschnitten wird! Setzen Sie den anfänglichen Schnitt seitlich nach oben in Richtung der rechten und linken Seite des Zwerchfells fort, um einen “Y”-förmigen Schnitt zu machen (Abbildung 3A). Wenn der Schnitt das Zwerchfell erreicht, machen Sie mit der feinen Sezierschere ein Loch in die Membran und schneiden Sie durch die Rippen auf der rechten Seite des Tieres. Schneiden Sie die Rippen ungefähr zur Hälfte bis zur rechten Achselhöhle. Machen Sie einen ähnlichen, aber längeren Schnitt durch die linke Seite der Membran fast bis zur linken Achselhöhle. Reflektieren Sie die Brustwand und befestigen Sie sie am Styroporblock. Falls erforderlich, zerlegen Sie das Fett um das Herz herum, um den linken Ventrikel freizulegen. Identifizieren Sie den linken Ventrikel anhand der relativ helleren Farbe im Vergleich zum rechten Ventrikel. Nachdem Sie den linken Ventrikel identifiziert haben, halten Sie das Herz mit leichtem Druck mit der fein gekrümmten Pinzette stabil. Öffnen Sie den Hauptleitungshämostat, damit der PBS durch die Nadel fließen kann. Durchstechen Sie sofort den linken Ventrikel und stellen Sie sicher, dass die Nadel nicht mehr als 0,5 cm in den Ventrikel eingeführt wird. Ziehen Sie die Nadel bei Bedarf leicht zurück.HINWEIS: Die genaue Platzierung der Nadel im linken Ventrikel wird durch den retrograden Blutfluss in den Nadelschlauch angezeigt. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Nadel nicht zu tief in den Ventrikel eingeführt wird. Dies kann zu einem retrograden Fluss durch die Lungenvenen oder zum Durchstechen des interventrikulären Septums führen. Legen Sie den Schmetterlingsschlauch mit zwei großen 18-G-Nadeln auf ein X aus Styropor.HINWEIS: Dies ist kritisch, da es eine Bewegung der Schmetterlingsnadel im Herzen während der Perfusion vermeidet. Identifizieren Sie die untere Hohlvene, wenn sie aus der Leber austritt, und transektieren Sie sie mit der feinen Sezierschere (Abbildung 3B). Alternativ öffnen Sie den rechten Vorhof mit einer Schere. Öffnen Sie sofort die Hauptleitung, damit die PBS-Perfusion beginnen kann (Abbildung 3C). Stellen Sie sicher, dass das PBS vom Styroporblock in die darunter liegende Glasschale abfließt. Wenn dies nicht der Fall ist, stellen Sie den Winkel der Schale oder des Styrofoak-Blocks so ein, dass Flüssigkeiten in die Glasschale abfließen können. Fahren Sie mit der PBS-Perfusion fort, bis die Flüssigkeit, die aus der unteren Hohlvene fließt, blutfrei ist (ca. 3 min).HINWEIS: Die richtige Platzierung der Nadel im Herzen führt zur visuellen Reinigung von Blut aus der Leber, die sich von rot zu strohfarben verfärbt. Tritt dies nicht ein, kann Abhilfe geschaffen werden, indem die Infusionsnadel innerhalb des linken Ventrikels neu positioniert wird. Ein kleiner Schnitt kann in der ventralen Schwanzbasis gemacht werden, um die Qualität der Perfusion zu beurteilen. Eine ordnungsgemäße Durchblutung führt zu einem klaren PBS, das aus dem Einschnitt der Schwanzbasis fließt. Wenn Sie schnell arbeiten, schließen Sie die PBS-Leitung mit einem Hämostat ab und öffnen Sie die PFA-Linie. Lassen Sie PFA für einige Minuten perfusionieren, bis sich der Schwanz zu kräuseln beginnt. Sobald sich der Schwanz zu kräuseln beginnt, beginnen Sie einen 50-Minuten-Timer. Wenn sich der Schwanz nach 5 Minuten PFA-Perfusion nicht kräuselt, beginnen Sie einen 50-minütigen Timer für die PFA-Perfusion. Überwachen Sie den PFA-Füllstand in der Flasche kontinuierlich während der gesamten Durchblutung, um sicherzustellen, dass der Füllstand nicht zu niedrig sinkt. Füllen Sie mehr PFA in die Flasche, wenn der Füllstand unter 2 cm über dem Flaschendeckel fällt. Abbildung 3: Diagramm der transkardialen Perfusion. (A) Die Bauchdecke wird zuerst geschnitten, gefolgt von zwei seitlich zeigenden Einschnitten in Richtung Achselhöhle, die ein “Y” bilden. (B) Nach dem Eintritt in die Brusthöhle und der Freilegung des Herzens wird die Nadel in den linken Ventrikel geführt. Als nächstes wird der IVC oder der rechte Vorhof durchbrochen, um die Drainage von Perfusaten zu ermöglichen, nachdem sie durch den Körper zirkuliert sind. Die IVC ist oberhalb der Membran geschnitten. c) Verfahren für die Verabreichung von Perfusaten. Abkürzung = IVC = Hohlvene inferior. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Nach Ablauf von 50 Minuten die Hauptlinie mit einer Hämostat verschließen und die Nadel aus dem linken Ventrikel zurückziehen.HINWEIS: Die gesamte Maus ist an dieser Stelle steif und kann nun über Nacht bei 4 °C in einen beschrifteten Behälter mit 4% PFA gegeben werden. In diesem Stadium ist es möglich, das ZNS-Gewebe zu sezieren und über Nacht einzeln in Fixativ zu legen. Bei dieser Arbeit wird die gesamte Maus fixativ platziert, da dies das Intervall zwischen Fixierung und Platzierung bei 4 °C verkürzt. Dies vermeidet auch eine mögliche mechanische Verzerrung des Nervengewebes, die auftreten kann, wenn Tiere vorseziert werden, bevor die Fixierung über Nacht abgeschlossen ist. 4. ZNS-Sezierung Bereiten Sie die folgenden Instrumente für die Dissektion vor, indem Sie sie mit Wasser waschen, gefolgt von 70% Ethanol: Schere, Hautpinzette, gebogene Fenestar-Pinzette, gebogene feine Pinzette, gerade feine Pinzette, feine Schere. Beschriften Sie vier Röhrchen pro Maus wie folgt und füllen Sie sie mit steriler 20% Saccharose: Maus-ID, Gehirn 1, Maus-ID, Gehirn 2, Maus-ID, Lendenwirbelsäule, Maus-ID, Zervikal. Entfernen Sie die Maus von der PFA-Lösung und tupfen Sie sie mit einem Papiertuch trocken, um überschüssiges PFA zu entfernen. Entfernen Sie mit der großen Schere den Kopf der Maus, indem Sie am Hals schneiden. Geben Sie den Körper in die PFA-Lösung. Behalten Sie den Kopf, um das Gehirn vom Schädel zu trennen. Um das Gehirn zu sezieren, reflektieren Sie zunächst die Schädelhaut nach vorne, um den gesamten Schädel freizulegen (Abbildung 4A). Machen Sie einen flachen Schnitt in den Gehörgang mit der feinen Sezierschere, um Zugang zum Schädel zu erhalten Setzen Sie diesen Schnitt entlang der Querhöhle fort, bis der Schädel den ganzen Weg zwischen beiden Gehörgängen geschnitten ist. Machen Sie einen Schnitt senkrecht zum vorherigen Schnitt entlang der Längsfissur bis zum rostreichsten Teil des Schädels (ungefähr zwischen den Augen). Verwenden Sie die gebogene Pinzette mit Fenestriert, reflektieren Sie den Schädel seitlich, um das Vorderhirn freizulegen. Entfernen Sie den Schädel weiter, bis das gesamte Vorderhirn, einschließlich der Riechkolben, freigelegt ist. Beginnen Sie, die kaudale Region des Schädels zu sezieren, indem Sie einen Schnitt durch den Hinterhauptbein machen und diesen Schnitt langsam in Richtung Foramen magnum fortsetzen. Reflektieren Sie die beiden Schädelteile seitlich, um das Kleinhirn und den Hirnstamm kaudal freizulegen (Abbildung 4B). Verwenden Sie die ultrafein gekrümmte Pinzette, um die Riechkolben vom vorderen Schädel zu trennen und beginnen Sie, das Gehirn von der Schädelbasis weg zu schälen, beginnend bei den Riechkolben. Wenn das Gehirn von der Schädelbasis weggeschält wird, verwenden Sie ultrafeine Pinzetten, um die Hirnnerven zu schneiden und die Entfernung des Gehirns zu ermöglichen. Ziehen Sie das Gehirn weiterhin von der Schädelbasis ab, bis das gesamte intakte Gehirn entfernt ist (Abbildung 4C, D). Schneiden Sie das Gehirn entlang der Längsfissur in zwei Hälften, um die rechte und linke Hemisphäre voneinander zu trennen (Abbildung 4E, F). Platzieren Sie eine Hemisphäre im Gehirn 1 Röhre und die zweite Hemisphäre in der Gehirn 2 Röhre. Lagern Sie diese Röhrchen bei 4 °C, bis die Gehirnhälften absinken (ungefähr über Nacht). Abbildung 4: Entfernung des fixierten Gehirns. (A) Oberseite des Schädels. (B) Freigelegtes Gehirn innerhalb des Schädels. (C) Isoliertes Gehirn (dorsaler Aspekt). (D) Isoliertes Gehirn (ventraler Aspekt). (E) Linke Hemisphäre (lateraler Aspekt). (F) Linke Hemisphäre (medialer Aspekt). Maßstabsstäbe = 1 cm (E und F). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Um das Rückenmark zu sezieren, entfernen Sie den Mauskörper aus dem PFA und tupfen Sie ihn trocken. Legen Sie die Maus auf einen Styropor-Sezierblock in Bauchlage und stecken Sie die Pfoten mit vier Nadeln in den Block. Beginnen Sie die Sezierung, indem Sie die Haut in der Mittellinie der Maus vom Hals bis zum Schwanz abschneiden, um den gesamten Rücken freizulegen. Reflektieren Sie den Muskel und die Faszie auf der Rückseite, um den hinteren Teil der Wirbelsäule freizulegen. Beginnen Sie an den meisten Schädelwirbeln, indem Sie die feine Sezierschere verwenden, um die Lamina zu durchschneiden, während Sie das Rückenmark meiden (Abbildung 5A). Legen Sie die ultrafein gekrümmte Pinzette unter die Lamina und ziehen Sie sie nach oben, um die Wirbel zu brechen, um das Rückenmark freizulegen (Abbildung 5B). Verwenden Sie die gekrümmte Pinzette, um die gebrochenen Wirbel zu reflektieren und die seitlichsten Regionen des Rückenmarks freizulegen. Setzen Sie diesen Prozess für die nächsten Wirbel fort, indem Sie die ultrafein gekrümmte Pinzette unter die Lamina legen und die Wirbel brechen. Brechen Sie die Wirbel weiter, bis die gesamte Halswirbelsäule und die Brustwirbelsäule exponiert sind (Abbildung 5C). Setzen Sie die Freilegung des Rückenmarks bis zum Ende des Lendenwirbelmarks fort (Abbildung 5D). Mit einer scharfen Rasierklinge den ganzen Weg durch das mittlere Rückenmark schneiden. Mit der ultrafein gekrümmten Pinzette transektieren Sie die Spinalnerven seitlich von der Wirbelsäule und der Faszie vor dem Rückenmark, um das zervikale Rückenmark langsam von der Wirbelsäule zu trennen. Sezieren Sie das zervikale Rückenmark weiter, bis es frei von den Wirbeln ist (Abbildung 5E). Legen Sie das zervikale Mittelthorax-Rückenmark in die Röhre mit der Bezeichnung Cervical. Lagern Sie dieses Röhrchen bei 4 °C, bis das zervikale Rückenmark sinkt (ca. über Nacht). Brechen Sie weiterhin die Brustwirbel bis zur Cauda equina, wie in den Schritten 4.22 bis 4.25 beschrieben. Wenn die Cauda equina freigelegt wird, verwenden Sie eine scharfe Rasierklinge, um das Rückenmark 1 cm unterhalb des Lendenrückenmarks zu schneiden (Abbildung 5F). Sezieren Sie das Lendenrückenmark von den Wirbeln weg, wie in den Schritten 4.26-4.27 beschrieben. Legen Sie das Lendenmittel-Cauda equina-Rückenmark in den Schlauch mit der Aufschrift Lendenwirbelsäule. Lagern Sie diesen Schlauch bei 4 °C, bis das Lendenmark sinkt (ca. über Nacht). Wenn alle Gewebe in 20% Saccharose gesunken sind, übertragen Sie sie auf markierte Röhrchen aus 30% Saccharose, bis sie gesunken sind oder für 3 Tage.HINWEIS: Wirbelsäulengewebe sinkt oft nicht bei 30% Saccharose. Abbildung 5: Entfernung von fixierten Rückenmarkssegmenten. (A) Anfänglicher Schnitt in die Lamina der Halswirbel. (B) Platzierung einer gekrümmten Pinzette zur Fraktur einzelner Wirbel. (C) Die exponierte Halswirbelsäule. (D) Freiliegende Hals-, Brust- und Lendenwirbelsäule. (E) Entfernung der Halswirbelsäule nach dem Schneiden der Spinalnerven. (F) Durchschneiden der Sakralwirbelsäule. (G) Isolierte Halswirbelsäule. (H) Isolierte Lendenwirbelsäule. Maßstabsstäbe = 1 cm (G und H). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. 5. OAT-Einbettung und Gewebelagerung Beschriften Sie für jede Maus vier rechteckige Kryoformen: Maus-ID, Rechte Hemisphäre, Datum der Einbettung; Maus-ID, linke Hemisphäre, Datum der Einbettung; Maus-ID, Cervical, Datum der Einbettung; Maus-ID, Lendenwirbelsäule, Datum der Einbettung. Stellen Sie einen Styroporbehälter auf und hängen Sie einen Metallbecher über den Behälter. Füllen Sie den Styroporbehälter etwa zur Hälfte mit flüssigem Stickstoff. Füllen Sie den Metallbecher mit frischem 2-Methylbutan etwa zur Hälfte.HINWEIS: 2-Methylbutan ist giftig, leicht flüchtig und brennbar. Es ist darauf zu achten, dass eine Einatmung vermieden wird, indem nachfolgende Schritte in einem Abzug und weg von Verbrennungsquellen durchgeführt werden. Senken Sie den Metallbecher langsam in den flüssigen Stickstoff und vermeiden Sie ein Spritzen des flüssigen Stickstoffs in den Metallbecher. Lassen Sie das 2-Methylbutan einfrieren. Während das 2-Methylbutan gefriert, nehmen Sie das gewünschte Gewebe aus der 30% igen Saccharoselösung und tupfen Sie es auf einem staubfreien Tuch trocken. Legen Sie das Gewebe in ein Kryoplast, wobei die rostrale Region auf den oberen (unbeschrifteten) Teil der Form zeigt. Gießen Sie das optimale Einbettungsmedium (OCT) der Schnitttemperatur sparsam über das Gewebe in der Kryoform, wobei nur so viel verwendet wird, dass das Gewebe vollständig bedeckt ist. Vermeiden Sie die Verwendung einer übermäßigen OAT, da dies zu Rissen führen kann. Entfernen Sie alle Blasen aus dem OAT. Wenn gefrorenes 2-Methylbutan die innere Oberfläche des Metallbechers vollständig bedeckt hat, tauchen Sie das Kryomuld für 12 s vollständig in die darüber liegende flüssige Phase 2-Methylbutan. Nach 12 s legen Sie das Kryomuld zum Abtropfen in ein beschriftetes Aluminiumfolienquadrat und wickeln Sie die gesamte Kryoform ein. Legen Sie das eingewickelte Kryomehl sofort auf Trockeneis und vermeiden Sie das Auftauen. Stellen Sie sicher, dass die gefrorenen OCT/Kryoplaste immer mit Trockeneis bedeckt sind. Wiederholen Sie die Schritte 5.6 bis 5.8 für alle Gewebe. Legen Sie das Gewebe für eine Maus in eine versiegelte kleine Plastiktüte und dann in einen kryosicheren, versiegelten Behälter. Lagern Sie diesen Behälter in der -80 °C Tiefkühltruhe, bis Abschnitte geschnitten sind. 6. Kryosektion Stellen Sie vor der Kryosektion sicher, dass die Temperatur der Kryostatenkammer und der Probenkopf auf die entsprechenden Einstellungen eingestellt sind.HINWEIS: Für das Schneiden von Hirnschnitten werden eine Kammertemperatur von -20 °C, eine Probenkopftemperatur von -20 °C und eine Schnittdicke von 30 μm verwendet. Zum Schneiden von Rückenmarksschnitten werden eine Kammertemperatur von -23 °C, eine Probenkopftemperatur von -30 °C und eine Schnittdicke von 30 μm verwendet. Es ist wichtig zu beachten, dass die Kryostateneinstellungen (insbesondere die Kopftemperatur der Probe) während der Schnittaufnahme angepasst werden müssen, um Probleme mit der Gewebequalität zu beheben. Im Allgemeinen wird die Kopftemperatur der Probe gesenkt, um das Verschmieren des Gewebes zu korrigieren. Umgekehrt wird die Kopftemperatur der Probe erhöht, um ein übermäßiges Einrollen des Gewebes zu korrigieren. Entfernen Sie den gewünschten OCT-Block aus dem -80 °C Gefrierschrank und legen Sie den unverpackten Kryomold/OCT-Block in die Kryostatenkammer. Lassen Sie den OCT-Block 30 Minuten lang an die Kammertemperatur gewöhnen. Reinigen Sie ein Futter mit 70% Ethanol und wischen Sie es mit einem staubfreien Tuch trocken. Legen Sie das gereinigte Spannfutter in die Kryostatenkammer und machen Sie einen münzgroßen Kreis von OCT auf dem Futter. Lassen Sie das OAT einfrieren (ca. 1-2 min). Wenn das OCT eingefroren ist, legen Sie einen erbsengroßen Punkt frischer OCT auf das Futter und legen Sie sofort den OCT-Block des Gewebes auf das Futter. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe perfekt senkrecht zum Futter steht, bevor das OCT vollständig einfriert.HINWEIS: Im Allgemeinen wird die am meisten rostrale Region des Gehirns in Richtung des Chucks platziert, so dass der Schnitt vom Schwanzende aus beginnt. Für das Rückenmark wird im Allgemeinen die am meisten kaudale Region auf dem Futter platziert, so dass die Sektion vom rostralen Ende beginnt. Wenn das OAT gehärtet ist, platzieren Sie mehr OCT um die Basis des OCT-Blocks, um während des Abschnitts als strukturelle Unterstützung zu fungieren. Wenn diese Stütze leicht ausgehärtet ist, legen Sie das Spannfutter auf den Probenkopf und lassen Sie den OCT-Block 30 Minuten lang die Temperatur des Probenkopfes erreichen. Legen Sie eine Mikrotomklinge in den Klingenhalter und reinigen Sie die Antirollplatte. Stellen Sie den Abstand der Antirollplatte ein, um sicherzustellen, dass das Gewebe während des Schneidens knapp unter die Platte fällt. Weitere Informationen zur korrekten Positionierung der Antirollplatte finden Sie im Kryostat-Handbuch. Nachdem sich der OCT-Block an die Kopftemperatur der Probe gewöhnt hat, beginnen Sie mit dem Trimmen des OCT-Blocks, bis das Gewebe erreicht ist. Wenn Gewebe sichtbar ist, wechseln Sie vom Trimmen zum Schneiden und beginnen Sie mit dem Schneiden von 30-μm-Abschnitten. Bewegen Sie die Antirollplatte beiseite und nehmen Sie den Abschnitt mit einem Objektträger auf. Schneiden und sammeln Sie Abschnitte weiter, bis Sie mit der anatomischen Lage der Abschnitte zufrieden sind oder das gesamte Gewebe geschnitten wurde. Legen Sie die Objektträger 1-3 Tage lang zum Trocknen bei Raumtemperatur. Nach dem Trocknen legen Sie die Objektträger in eine Diabox und legen Sie diese Box in einen versiegelten Plastikbeutel. Beschriften Sie den Beutel mit der Maus-ID und den Gewebeinformationen, bevor Sie die Objektträger in die -80 °C Tiefkühltruhe legen. 7. Immunfluoreszierende Färbung Tauen Sie die Dias bei Raumtemperatur 1 h auf. Legen Sie die Dias in ein horizontales Diaglas und waschen Sie die Abschnitte 3 Mal in PBS für 10 Minuten jede Wäsche bei Raumtemperatur auf einem Shaker. Bereiten Sie den Blockpuffer vor (2% BSA + 0,3% Triton-X-100 in 1x PBS). Verwenden Sie ca. 1 ml pro Objektträger. Erstellen Sie eine befeuchtete Kammer, indem Sie dem Boden Wasser hinzufügen. Legen Sie die Dias horizontal nach oben und lassen Sie sie nicht austrocknen. Fügen Sie jedem Objektträger 1 ml Sperrpuffer hinzu und inkubieren Sie mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur. Bereiten Sie primäre Antikörperlösung vor, indem Sie den primären Antikörper in Antikörperpuffer verdünnen (0,7% BSA + 0,3% Triton-X-100 in 1x PBS).HINWEIS: Für den phosphorylierten α-Synuclein-Antikörper wurde ein Verdünnungsfaktor von 1:500 verwendet. Fügen Sie 200-300 μL primäre Antikörperlösung pro Objektträger hinzu. Mit einem Deckglas abdecken, um den Antikörper zu verteilen und bei 4 °C über Nacht zu inkubieren. Entfernen Sie am nächsten Tag die Dias aus der befeuchteten Kammer und legen Sie sie in ein vertikales Coplin-Glas, das mit 1x PBS gefüllt ist, damit das Deckglas abfallen kann. Tun Sie dies für jeden Objektträger einzeln und achten Sie beim Entfernen des Deckglases darauf, den Gewebebereich nicht zu stören. Legen Sie die Dias in ein horizontales Diaglas und waschen Sie die Abschnitte 3 Mal in PBS für 10 Minuten jede Wäsche bei Raumtemperatur auf einem Shaker.HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte müssen bei ausgeschaltetem Licht durchgeführt werden, um ein Photobleichen des Fluorophors zu vermeiden! Bereiten Sie die sekundäre Antikörperlösung vor, indem Sie den sekundären Antikörper im Antikörperpuffer verdünnen.HINWEIS: Für den Nachweis von phosphoryliertem α-Synuclein wurde eine Anti-Kaninchen-Sekundärkonjugation zu Alexa 488 mit einem Verdünnungsfaktor von 1:500 im Antikörperpuffer (0,7% BSA + 0,3% Triton-X-100 in 1x PBS) verwendet. Legen Sie die Objektträger horizontal in die befeuchtete Kammer und fügen Sie 200-300 μL sekundäre Antikörperlösung pro Objektträger hinzu. Mit einem Deckglas abdecken, um den Antikörper zu verteilen. Bei Raumtemperatur für mindestens 2 h inkubieren. Entfernen Sie die Objektträger aus der befeuchteten Kammer und legen Sie sie in ein vertikales Coplin-Glas, das mit 1x PBS gefüllt ist, damit das Deckglas abfallen kann. Tun Sie dies für jeden Objektträger einzeln und achten Sie beim Entfernen des Deckglases darauf, den Gewebebereich nicht zu stören. Legen Sie die Dias in ein horizontales Diaglas und waschen Sie die Abschnitte 3 Mal in PBS für 10 Minuten jede Wäsche bei Raumtemperatur auf einem Shaker. Trocknen Sie die Seite der Objektträger auf einem Handtuch ab und schütteln Sie überschüssiges PBS ab. Fügen Sie 3 Tropfen Montagemedium zu jeder Folie hinzu. Fügen Sie das Deckglas hinzu und drücken Sie die Blasen vorsichtig mit einer Pinzette aus, indem Sie das Deckglas drücken, bevor Sie es mit konfokaler Mikroskopie abbilden.