Применение РНК-интерференции у американского таракана
Summary
Настоящий протокол описывает пошаговые рекомендации по методам эксплуатации РНКи в P. americana.
Abstract
Тараканы, санитарный вредитель, являются важными видами в исследованиях развития насекомых и метаморфических исследований из-за их легкого кормления и гемиметаболических характеристик. В совокупности с хорошо аннотированными последовательностями генома эти преимущества сделали американского таракана, Periplaneta americana, важной моделью гемиметаболических насекомых. Ограниченный нехваткой нокаут-стратегии, эффективный нокдаун генов на основе РНК-интерференции (РНКи) становится незаменимым методом в функциональных генных исследованиях P. americana. Настоящий протокол описывает методы работы РНКи в P. americana. Протокол включает в себя (1) отбор P. americana на соответствующих стадиях развития, (2) подготовку к установке инъекции, (3) инъекцию дцРНК и (4) обнаружение эффективности нокдауна генов. РНКи является мощным обратным генетическим инструментом у P. americana. Большинство тканей P. americana чувствительны к внеклеточной дцРНК. Его простота позволяет исследователям быстро получать дисфункциональные фенотипы под одной или несколькими целевыми инъекциями дцРНК, что позволяет исследователям лучше использовать P. americana для исследований развития и метаморфизма.
Introduction
РНК-интерференция (РНКи), эволюционно сохраненный механизм, постепенно становится важным обратно-генетическим инструментом для ингибирования экспрессии генов во многих организмах1, поскольку Эндрю Файр и Крейг Мелло2 разработали стратегию двухцепочечной РНК (дцРНК), опосредованной генной тишины. дцРНК расщепляется на фрагменты 21-23 нуклеотидов, небольших интерферирующих РНК (siRNAs), ферментом Dicer в клетках для активации пути RNAi. Затем siRNAs включаются в РНК-индуцированный комплекс глушения (RISC), который соединяется с целевой мРНК, вызывает расщепление мРНК и, наконец, приводит к потере функции гена 3,4,5. Среди видов насекомых до сих пор сообщалось о многих системных экспериментах RNAi во многих отрядах насекомых, таких как Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera и Blattodea 5,6,7,8.
Тараканы (Blattaria) являются важным семейством насекомых в исследованиях развития и метаморфизма с их быстрыми циклами роста, сильной приспособляемостью к окружающей среде и высокой пластичностью развития9. Прежде чем обнаружить, что RNAi совместим с тараканами, предыдущие исследования были сосредоточены только на профилактике и контроле тараканов из-за нехватки методов генетических манипуляций у тараканов. Уникальная структура таракана оотеки усложнила выполнение нокаута гена на основе инъекций эмбрионов с помощью системы CRISPR-Cas9. Кроме того, большинство тканей у тараканов (таких как P. americana) демонстрируют устойчивый системный ответ РНКи, что позволяет быстро генерировать дисфункциональные фенотипы путем инъекции одного или нескольких дцРНК 9,10,11. Эти особенности сделали РНКи незаменимым методом в генных функциональных исследованиях у P. americana.
Несмотря на то, что об использовании РНКи в исследованиях функциональных генов у P. americana сообщалось, подробного или пошагового описания не было. В этом отчете представлено одно пошаговое операционное руководство для RNAi у P. americana, полезное для изучения функции генов у других тараканов. Кроме того, это руководство не ограничивается Blattodea и может быть применено ко многим другим насекомым с незначительными изменениями.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящем докладе описана методологическая пошаговая стратегия РНКи в P. americana; Следует отметить, что его также можно применять к другим тараканам (Blattella germanica, например) и многим другим насекомым с незначительными изменениями. Тем не менее, эффективность глушения генов РНКи н…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 32070500, 31620103917, 31330072 и 31572325 C.R., Sh.L.), Фондом естественных наук провинции Гуандун (грант No 2021B1515020044 и 2020A1515011267 к C.R.), Департаментом науки и техники провинции Гуандун (грант NoNo 2019B090905003 и 2019A0102006), Департаментом науки и техники в Гуанчжоу (грант No 202102020110), Шэньчжэньской научно-технической программой (Грант No. KQTD20180411143628272 к Ш.Л.).
Materials
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
References
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431 (2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications. Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).
- Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding. International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels. Frontiers in Physiology. 6, 207 (2015).
- Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine. Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1 (2020).
- Immonen, E. V., et al. EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision. The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).
- Li, S., et al. The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach. Nature Communications. 9 (1), 1008 (2018).
- Zhao, Z., et al. Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica. Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).
- Lozano, J., Belles, X. Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species. Scientific Reports. 1, 163 (2011).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).
- Zheng, Y., et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).
- Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana. Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).
- Jackson, A. L., Linsley, P. S. Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs. Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).
- Patel, M., Peter, M. E. Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses. Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).
- Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches. iScience. 23 (12), 101778 (2020).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).
- Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. interfering RNA: A new tool for gene therapy. Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).
