יישומים של הפרעות RNA במקק אמריקאי
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר קווים מנחים שלב אחר שלב לטכניקות הפעולה של RNAi ב – P. americana.
Abstract
מקקים, מזיק תברואתי, הם מינים חיוניים במחקרים התפתחותיים ומטמורפיים של חרקים בשל האכלתם הקלה ומאפייניהם ההמימטבוליים. בסך הכל עם רצפי גנום מובאים היטב, יתרונות אלה הפכו את הג’וק האמריקאי, פריפלנטה אמריקנה, למודל חרקים המימטבולי חשוב. מוגבל על ידי המחסור באסטרטגיית נוקאאוט, הפרעות RNA יעילות (RNAi) מבוסס גנים נוקאאוט הופך לטכניקה חיונית במחקר גנים פונקציונלי של P. americana. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את טכניקות הפעולה של RNAi ב – P. americana. הפרוטוקול כולל (1) בחירה של P. americana בשלבים התפתחותיים נאותים, (2) הכנה להגדרת ההזרקה, (3) הזרקת dsRNA, ו -(4) זיהוי יעילות נוקאאוט גנים. RNAi הוא כלי גנטי הפוך רב עוצמה P . americana. רוב רקמות P. americana רגישות dsRNA חוץ תאי. הפשטות שלה מאפשרת לחוקרים להשיג במהירות פנוטיפים לא מתפקדים תחת אחד או יותר מיקוד dsRNA זריקות, המאפשר לחוקרים להשתמש טוב יותר P. americana למחקרים התפתחותיים מטמורפיים.
Introduction
הפרעות RNA (RNAi), מנגנון שנשמר אבולוציונית, הופך בהדרגה לכלי חיוני הפוך-גנטי לעיכוב ביטוי גנים באורגניזמים רבים1, שכן אנדרו פייר וקרייג מלו2 פיתחו את אסטרטגיית השתקת הגנים המתווכת של RNA (dsRNA). dsRNA הוא בקע לתוך שברים של 21-23 נוקלאוטידים, קטן מפריע RNAs (siRNAs), על ידי האנזים Dicer בתאים כדי להפעיל את מסלול RNAi. לאחר מכן siRNAs משולבים לתוך קומפלקס ההשתקה המושרה על ידי RNA (RISC), אשר זוגות mRNA היעד, גורם מחשוף mRNA, ולבסוף גורם לאובדן תפקוד הגנים 3,4,5. בין מיני החרקים, ניסויי RNAi מערכתיים רבים דווחו עד כה בהרבה סדרי חרקים, כגון אורתופטרה, איזופטרה, המיפטרה, קולופטרה, נוירופטרה, דיפטרה, היימנופטרה, לפידופטרה ובלטודה 5,6,7,8.
מקקים (Blattaria) הם משפחת חרקים חיונית במחקרים התפתחותיים ומטמורפיים עם מחזורי הצמיחה המהירים שלהם, הסתגלות חזקה לסביבה, ופלסטיות התפתחותית גבוהה9. לפני שגילה כי RNAi היה תואם עם מקקים, מחקר קודם התמקד רק במניעה ובקרה של מקק בשל מחסור של טכניקות מניפולציה גנטית מקקים. המבנה הייחודי של הג’וק אותקה הפך אותו למאתגר לביצוע נוקאאוט גנים מבוסס הזרקת עוברים עם מערכת CRISPR-Cas9. חוץ מזה, רוב הרקמות בג’וקים (כגון P. americana) להראות תגובת RNAi מערכתית חזקה, המאפשרת הדור המהיר של פנוטיפים לא מתפקדים על ידי הזרקת אחד או יותר מיקוד dsRNAs 9,10,11. תכונות אלה הפכו את RNAi לטכניקה הכרחית במחקר תפקודי גנים ב– P. americana.
למרות שהשימוש ב- RNAi במחקר גנים פונקציונלי ב – P. americana דווח, לא היה תיאור מפורט או צעד אחר צעד זמין. דו”ח זה מספק קו מנחה תפעולי צעד אחר שלב עבור RNAi ב – P. americana, שימושי לחקר תפקוד גנים בג’וקים אחרים. יתר על כן, מדריך זה אינו מוגבל לבלאטודה וניתן להחיל אותו על חרקים רבים אחרים עם שינויים קלים.
Protocol
Representative Results
Discussion
דו”ח זה תיאר אסטרטגיית RNAi מתודולוגית צעד אחר צעד ב – P. americana; שימו לב, זה יכול להיות מיושם גם על ג’וקים אחרים (Blattella germanica, למשל) וחרקים רבים אחרים עם שינויים קלים. עם זאת, יעילות השתקת הגנים של RNAi לא תמיד גבוהה מספיק, עם חיסרון ברור בהשוואה לאסטרטגיית נוקאאוט הגנים13. ההשפע?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (גרנט מס ‘ 32070500, 31620103917, 31330072, ו – 31572325 ל- C.R., Sh.L.), על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (מענק מס ‘2021B1515020044 ו 2020A1515011267 ל- C.R.), על ידי המחלקה למדע וטכנולוגיה במחוז גואנגדונג (גרנט מס ‘2019B09005003 ו 2019A0102006), על ידי המחלקה למדע וטכנולוגיה בגואנגג’ואו (גרנט מס ‘202102020110), על ידי תוכנית המדע והטכנולוגיה של שנזן (מענק מס ‘. KQTD20180411143628272 לש.ל.
Materials
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
References
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431 (2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications. Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).
- Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding. International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels. Frontiers in Physiology. 6, 207 (2015).
- Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine. Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1 (2020).
- Immonen, E. V., et al. EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision. The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).
- Li, S., et al. The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach. Nature Communications. 9 (1), 1008 (2018).
- Zhao, Z., et al. Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica. Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).
- Lozano, J., Belles, X. Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species. Scientific Reports. 1, 163 (2011).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).
- Zheng, Y., et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).
- Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana. Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).
- Jackson, A. L., Linsley, P. S. Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs. Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).
- Patel, M., Peter, M. E. Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses. Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).
- Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches. iScience. 23 (12), 101778 (2020).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).
- Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. interfering RNA: A new tool for gene therapy. Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).
