Applications de l’interférence ARN chez le cafard américain
Summary
Le présent protocole décrit des lignes directrices étape par étape pour les techniques d’opération de l’ARNi chez P. americana.
Abstract
Les cafards, un ravageur sanitaire, sont des espèces essentielles dans les études de développement et de métamorphie des insectes en raison de leur alimentation facile et de leurs caractéristiques hémimétabrines. Ensemble avec des séquences de génome bien annotées, ces avantages ont fait du cafard américain, Periplaneta americana, un modèle important d’insecte hémimétabole. Limité par l’absence de stratégie de knock-out, l’interférence ARN efficace (ARNi) basée sur l’élimination des gènes devient une technique indispensable dans la recherche sur les gènes fonctionnels de P. americana. Le présent protocole décrit les techniques de fonctionnement de l’ARNi chez P. americana. Le protocole comprend (1) la sélection du P. americana aux stades de développement appropriés, (2) la préparation pour le réglage de l’injection, (3) l’injection d’ARNd et (4) la détection de l’efficacité de l’élimination des gènes. L’ARNi est un puissant outil génétique inverse chez P. americana. La majorité des tissus de P. americana sont sensibles à l’ARNds extracellulaire. Sa simplicité permet aux chercheurs d’obtenir rapidement des phénotypes dysfonctionnels sous une ou plusieurs injections d’ARNd ciblant, ce qui permet aux chercheurs de mieux utiliser le P. americana pour les études développementales et métamorphiques.
Introduction
L’interférence ARN (ARNi), un mécanisme conservé sur le plan de l’évolution, devient progressivement un outil génétique inverse essentiel pour inhiber l’expression des gènes dans de nombreux organismes1, depuis qu’Andrew Fire et Craig Mello2 ont développé la stratégie de silence génétique médié par l’ARN double brin (ARNdS). L’ARNds est clivé en fragments de 21 à 23 nucléotides, de petits ARN interférents (siRNA), par l’enzyme Dicer dans les cellules pour activer la voie de l’ARNi. Ensuite, les siRNA sont incorporés dans le complexe de silençage induit par l’ARN (RISC), qui se couple à l’ARNm cible, provoque un clivage de l’ARNm et entraîne finalement la perte de la fonction génique 3,4,5. Parmi les espèces d’insectes, de nombreuses expériences systémiques d’ARNi ont jusqu’à présent été rapportées dans de nombreux ordres d’insectes, tels que les orthoptères, les isoptères, les hémiptères, les coléoptères, les neuroptères, les diptères, les hyménoptères, les lépidoptères etles blattodea 5,6,7,8.
Les cafards (Blattaria) sont une famille d’insectes essentielle dans les études développementales et métamorphiques avec leurs cycles de croissance rapides, leur forte adaptabilité à l’environnement et leur grande plasticité développementale9. Avant de découvrir que l’ARNi était compatible avec les cafards, les recherches précédentes se concentraient uniquement sur la prévention et le contrôle des cafards en raison de la rareté des techniques de manipulation génétique chez les cafards. La structure unique de l’oothèque de cafard rendait difficile l’exécution d’un knockout génétique basé sur l’injection d’embryons avec le système CRISPR-Cas9. En outre, la plupart des tissus chez les cafards (tels que P. americana) présentent une réponse systémique robuste à l’ARNi, permettant la génération rapide de phénotypes dysfonctionnels en injectant un ou plusieurs ARNd ciblant 9,10,11. Ces caractéristiques ont fait de l’ARNi une technique indispensable dans la recherche fonctionnelle sur les gènes chez P. americana.
Même si l’utilisation de l’ARNi dans la recherche sur les gènes fonctionnels chez P. americana a été rapportée, aucune description détaillée ou étape par étape n’était disponible. Ce rapport fournit une ligne directrice opérationnelle étape par étape pour l’ARNi chez P. americana, utile pour l’étude de la fonction génique chez d’autres cafards. De plus, ce guide ne se limite pas à Blattodea et peut être appliqué à de nombreux autres insectes avec des modifications mineures.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce rapport décrivait une stratégie méthodologique d’ARNi étape par étape chez P. americana; Il convient de noter qu’il peut également être appliqué à d’autres cafards (Blattella germanica, par exemple) et à de nombreux autres insectes présentant des modifications mineures. Cependant, l’efficacité du silençage génique de l’ARNi n’est pas toujours assez élevée, avec un inconvénient évident par rapport à la stratégie d’éliminationgénique 13. L’e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subventions n° 32070500, 31620103917, 31330072 et 31572325 à C.R., Sh.L.), par la Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong (subvention n° 2021B1515020044 et 2020A1515011267 à C.R.), par le Département des sciences et de la technologie de la province du Guangdong (subventions n° 2019B0905003 et 2019A0102006), par le Département des sciences et de la technologie de Guangzhou (subvention n° 202102020110), par le Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272 à Sh.L.).
Materials
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
References
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431 (2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications. Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).
- Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding. International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels. Frontiers in Physiology. 6, 207 (2015).
- Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine. Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1 (2020).
- Immonen, E. V., et al. EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision. The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).
- Li, S., et al. The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach. Nature Communications. 9 (1), 1008 (2018).
- Zhao, Z., et al. Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica. Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).
- Lozano, J., Belles, X. Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species. Scientific Reports. 1, 163 (2011).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).
- Zheng, Y., et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).
- Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana. Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).
- Jackson, A. L., Linsley, P. S. Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs. Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).
- Patel, M., Peter, M. E. Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses. Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).
- Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches. iScience. 23 (12), 101778 (2020).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).
- Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. interfering RNA: A new tool for gene therapy. Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).
