تطبيقات تدخل الحمض النووي الريبي في الصرصور الأمريكي
Summary
يصف هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية خطوة بخطوة لتقنيات تشغيل الحمض النووي الريبي في P. americana.
Abstract
الصراصير ، وهي آفة صحية ، هي أنواع أساسية في الدراسات التنموية والمتحولة للحشرات بسبب سهولة تغذيتها وخصائصها نصف الأيضية. جنبا إلى جنب مع تسلسل الجينوم المشروح جيدا ، جعلت هذه المزايا الصرصور الأمريكي ، Periplaneta americana ، نموذجا مهما للحشرات نصف الأيضية. نظرا لمحدودية النقص في استراتيجية الضربة القاضية ، يصبح الضربة القاضية الجينية الفعالة القائمة على تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) تقنية لا غنى عنها في أبحاث الجينات الوظيفية ل P. americana. يصف هذا البروتوكول تقنيات تشغيل الحمض النووي الريبي في P. americana. يتضمن البروتوكول (1) اختيار P. americana في مراحل النمو المناسبة ، (2) التحضير لإعداد الحقن ، (3) حقن dsRNA ، و (4) اكتشاف كفاءة ضربة قاضية للجينات. RNAi هو أداة وراثية عكسية قوية في P. americana. غالبية أنسجة P. americana حساسة ل dsRNA خارج الخلية. تسمح بساطته للباحثين بالحصول بسرعة على أنماط ظاهرية مختلة وظيفيا تحت حقن واحدة أو عدة حقن dsRNA مستهدفة ، مما يمكن الباحثين من استخدام P. americana بشكل أفضل للدراسات التنموية والمتحولة.
Introduction
يصبح تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) ، وهو آلية محفوظة تطوريا ، تدريجيا أداة جينية عكسية أساسية لمنع التعبير الجيني في العديد من الكائنات الحية1 ، منذ أن طور أندرو فاير وكريغ ميلو2 استراتيجية صمت الجينات بوساطة الحمض النووي الريبي المزدوج (dsRNA). يتم شق dsRNA إلى شظايا من 21-23 نيوكليوتيدات ، الحمض النووي الريبي المتداخل الصغير (siRNAs) ، بواسطة إنزيم Dicer في الخلايا لتنشيط مسار RNAi. ثم يتم دمج siRNAs في مجمع إسكات الحمض النووي الريبي الناجم عن الحمض النووي الريبي (RISC) ، والذي يقترن بالحمض النووي الريبي المرسال المستهدف ، ويسبب انقسام الحمض النووي الريبي المرسال ، ويؤدي في النهاية إلى فقدان وظيفة الجينات3،4،5. من بين أنواع الحشرات ، تم الإبلاغ عن العديد من تجارب RNAi الجهازية حتى الآن في الكثير من أوامر الحشرات ، مثل Orthoptera و Isoptera و Hemiptera و Coleoptera و Neuroptera و Diptera و Hymenoptera و Lepidoptera و Blattodea 5,6,7,8.
الصراصير (Blattaria) هي عائلة حشرات أساسية في الدراسات التنموية والمتحولة مع دورات نموها السريع ، وقدرتها القوية على التكيف مع البيئة ، واللدونة التنموية العالية9. قبل اكتشاف أن الحمض النووي الريبي كان متوافقا مع الصراصير ، ركزت الأبحاث السابقة فقط على الوقاية من الصراصير ومكافحتها بسبب ندرة تقنيات التلاعب الجيني في الصراصير. جعلت البنية الفريدة ل cockroach ootheca من الصعب إجراء عملية الضربة القاضية الجينية القائمة على حقن الأجنة باستخدام نظام CRISPR-Cas9. إلى جانب ذلك ، تظهر معظم الأنسجة في الصراصير (مثل P. americana) استجابة RNAi جهازية قوية ، مما يسمح بالتوليد السريع للأنماط الظاهرية المختلة وظيفيا عن طريق حقن واحد أو أكثر يستهدف dsRNAs 9,10,11. جعلت هذه الميزات RNAi تقنية لا غنى عنها في البحوث الوظيفية الجينية في P. americana.
على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن استخدام الحمض النووي الريبي في أبحاث الجينات الوظيفية في P. americana ، إلا أنه لم يتوفر وصف مفصل أو خطوة بخطوة. يقدم هذا التقرير إرشادات تشغيلية خطوة بخطوة ل RNAi في P. americana ، وهو مفيد لدراسة وظيفة الجينات في الصراصير الأخرى. علاوة على ذلك ، لا يقتصر هذا الدليل على Blattodea ويمكن تطبيقه على العديد من الحشرات الأخرى مع تعديلات طفيفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصف هذا التقرير استراتيجية منهجية خطوة بخطوة للحمض النووي الريبي في P. americana. تجدر الإشارة إلى أنه يمكن تطبيقه أيضا على الصراصير الأخرى (Blattella germanica ، على سبيل المثال) والعديد من الحشرات الأخرى ذات التغييرات الطفيفة. ومع ذلك ، فإن كفاءة إسكات الجينات في RNAi ليست دائما عالية بما فيه ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم المنحة 32070500 31620103917 31330072 31572325 إلى C.R. ، Sh.L.) ، من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة قوانغدونغ (المنحة رقم 2021B1515020044 و 2020A1515011267 إلى C.R.) ، من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة قوانغدونغ (رقم المنحة 2019B090905003 و 2019A0102006) ، من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا في قوانغتشو (المنحة رقم 202102020110) ، من قبل برنامج شنتشن للعلوم والتكنولوجيا (رقم المنحة. KQTD20180411143628272 إلى Sh.L.).
Materials
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
References
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431 (2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications. Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).
- Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding. International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels. Frontiers in Physiology. 6, 207 (2015).
- Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine. Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1 (2020).
- Immonen, E. V., et al. EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision. The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).
- Li, S., et al. The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach. Nature Communications. 9 (1), 1008 (2018).
- Zhao, Z., et al. Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica. Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).
- Lozano, J., Belles, X. Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species. Scientific Reports. 1, 163 (2011).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).
- Zheng, Y., et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).
- Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana. Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).
- Jackson, A. L., Linsley, P. S. Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs. Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).
- Patel, M., Peter, M. E. Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses. Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).
- Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches. iScience. 23 (12), 101778 (2020).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).
- Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. interfering RNA: A new tool for gene therapy. Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).
