Monitorando Cinética de Agregação de Proteínas In Vivo usando Contagem Automatizada de Inclusão em Elegans Caenorhabditis
Summary
Aqui, é apresentado um método para a análise da cinética de agregação de proteínas no nematode Caenorhabditis elegans. Animais de uma população sincronizada por idade são imagens em diferentes momentos, seguidos pela contagem de inclusão semiatomada no CellProfiler e adaptação a um modelo matemático em Amilafit.
Abstract
A agregação de proteínas em inclusões insolúveis é uma marca registrada de uma variedade de doenças humanas, muitas das quais estão relacionadas à idade. O nematode Caenorhabditis elegans é um organismo modelo bem estabelecido que tem sido amplamente utilizado no campo para estudar a agregação e toxicidade proteica. Sua transparência óptica permite a visualização direta da agregação de proteínas por microscopia de fluorescência. Além disso, o ciclo reprodutivo rápido e a vida útil curta fazem do nematode um modelo adequado para a triagem de genes e moléculas que modulam esse processo.
No entanto, a quantificação da carga agregada em animais vivos é pouco padronizada, normalmente realizada por inclusão manual contando sob um microscópio de dissecção de fluorescência em um único ponto de tempo. Essa abordagem pode resultar em alta variabilidade entre observadores e limita a compreensão do processo de agregação. Em contraste, a agregação de proteínas semelhantes a amiloide in vitro é rotineiramente monitorada pela fluorescência thioflavvin T de forma altamente quantitativa e resolvida pelo tempo.
Aqui, um método análogo é apresentado para a análise imparcial da cinética de agregação em C. elegans vivos, utilizando um microscópio confocal de alta produtividade combinado com análise de imagem personalizada e encaixe de dados. A aplicabilidade deste método é demonstrada pelo monitoramento da formação de inclusão de uma proteína de poliglutamina (polyQ) fluorescentemente rotulada nas células musculares da parede corporal. O fluxo de trabalho de análise de imagem permite a determinação do número de inclusões em diferentes momentos, que são ajustados a um modelo matemático baseado em eventos de nucleação independentes em células musculares individuais. O método aqui descrito pode ser útil para avaliar os efeitos dos fatores de proteostase e potenciais terapêuticas para doenças de agregação de proteínas em um animal vivo de forma robusta e quantitativa.
Introduction
O acúmulo de proteínas desdobradas em depósitos insolúveis ocorre em uma ampla gama de doenças. Exemplos bem conhecidos são a agregação de amilóide-β e tau na doença de Alzheimer, α-sinucleína na doença de Parkinson, e a caça com polq expandido na doença de Huntington 1,2. O descompactamento desses polipeptídeos em fibrilas amiloides está associado à toxicidade e morte celular por mecanismos que ainda não estão claros. Elucidar os mecanismos de formação amiloide será crucial para o desenvolvimento de terapias eficazes, que atualmente não estão disponíveis.
Investigações detalhadas da formação amiloide têm sido realizadas in vitro com base em medidas de fluorescência thioflavina T, levando a uma compreensão mecanicista do processo de agregação e do efeito das moléculas inibitórias 3,4,5. No entanto, não está claro se os mesmos mecanismos de agregação se mantêm verdadeiros no complexo ambiente de células vivas e organismos. O verme nematode Caenorhabditis elegans é um organismo modelo adequado para estudar a agregação de proteínas in vivo. Tem uma anatomia relativamente simples, mas consiste em múltiplos tecidos, incluindo músculo, intestino e um sistema nervoso. É geneticamente bem caracterizado, e ferramentas para modificação genética estão prontamente disponíveis. Além disso, tem um curto tempo de geração de ~3 dias e uma vida útil total de 2-3 semanas. Como tal, a agregação de proteínas pode ser examinada ao longo da vida útil do animal em uma escala de tempo experimentalmente conveniente. Finalmente, o nematoide é opticamente transparente, permitindo o rastreamento da agregação de proteínas fluorescentes rotuladas em animais vivos.
Essas características de C. elegans foram previamente exploradas para investigar a agregação de proteínas de polq como modelo para doenças de expansão de Huntington e outras doenças de expansão do POLQ. Acima do limiar patogênico de 35-40 resíduos de glutamina, as proteínas de polq rotuladas com proteína fluorescente amarela (YFP) podem ser observadas para formar inclusões insolúveis no tecido muscular 6,7, neurônios8 e intestino 9,10. Essas características têm sido amplamente utilizadas para a triagem de genes 11,12,13 e modificadores de pequenas moléculas14 de agregação e toxicidade de proteínas.
C. elegans tem o potencial de desempenhar um papel importante na ponte entre estudos in vitro de agregação de proteínas e modelos de doenças mais complexas, como camundongos15. C. elegans é favorável ao rastreamento de drogas16 , mas também pode ser explorado para obter uma compreensão fundamental dos mecanismos moleculares de agregação de proteínas in vivo, como demonstrado recentemente17. No entanto, para ambas as aplicações, é de grande importância extrair uma medida quantitativa e reprodutível de agregação de proteínas. Aqui, isso é conseguido com o uso de um microscópio confocal de alta produtividade combinado com um pipeline de análise de imagem dedicado (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
O método aqui apresentado facilita uma análise imparcial e quantitativa da cinética de agregação de proteínas no organismo modelo C. elegans. Depende de quatro elementos-chave (Figura 1): 1) manter uma população sincronizada por idade de nematoides; 2) microscopia de fluorescência em placas multiwell; 3) contagem automatizada de inclusão no CellProfiler; 4) encaixe de dados no AmyloFit. Em comparação com a contagem manual de inclusões em animais em movimento livre ou de imagens salvas26, a quantificação no CellProfiler é mais rápida e imparcial. O outro avanço fundamental do protocolo é a aquisição de dados cinéticos, em vez de pontos de tempo únicos, que fornece insights quantitativos sobre o mecanismo de agregação ao encaixar os dados em um modelo matemático.
Os quatro elementos do protocolo podem ser usados como módulos independentes que podem ser modificados dependendo da aplicação. Populações sincronizadas por idade também podem ser mantidas usando 5-fluoro-2′-desoxyuridina (FUDR) para esterilizar os animais. Este composto afeta a vida útil e a proteostase 24,25 e é altamente cancerígeno para o experimentador; no entanto, impede a transferência manual dos vermes, que podem ser intensivos em mão-de-obra quando grandes números são tratados. Outras alternativas são o uso de mutantes estéreis29 ou dispositivos de filtragem para separar a prole30.
A etapa de microscopia de fluorescência também pode ser ajustada, por exemplo, usando ampliações mais altas para monitorar a agregação de proteínas nos neurônios. A microscopia widefield pode ser suficiente para monitorar a agregação de polq em células musculares quando a diferença relativa entre as condições é mais importante do que o número absoluto de inclusões. O pipeline CellProfiler ainda pode ser usado nesses casos, embora as configurações para reconhecer worms e inclusões precisem ser ajustadas pelo usuário. Atualmente, o rendimento da técnica é limitado pela necessidade de colheita manual dos animais na placa de 384 poços. Isso pode ser potencialmente corrigido pelo uso de dispositivos microfluidos16. O azida de sódio é um anestésico relativamente severo, que pode ser substituído pela imobilização física por hidrogéis ou contas28,29.
A análise em Amilado apresentado aqui é baseada em um mecanismo de agregação composto por eventos de nucleação independentes em células individuais. Nos casos em que esse modelo não se encaixa, o usuário deve considerar uma alternativa como o modelo de agregação cooperativa desenvolvido anteriormente17. Uma limitação dessa abordagem é que as cepas que expressam a proteína do interesse em diferentes concentrações precisam estar disponíveis, embora estas possam ser geradas usando métodos de rotina C. elegans 24.
Ao todo, este protocolo fornece os meios para a obtenção de dados de alta qualidade para a cinética de agregação de proteínas em um sistema modelo in vivo , permitindo uma análise detalhada dos mecanismos de agregação17. Embora o método tenha sido demonstrado para agregação de poliq no tecido muscular C. elegans , futuras aplicações do protocolo podem incluir outras proteínas e tecidos e os efeitos de fatores de proteostase e pequenas moléculas.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao laboratório Morimoto por cepas C. elegans e Esmeralda Bosman por assistência no microscópio confocal de alto rendimento. Este trabalho foi financiado por uma bolsa inicial da Universidade de Utrecht para t.S.
Materials
| 384-well plate | Greiner | 781091 | Black with flat clear bottom |
| AmyloFit | Knowles lab | v2.0 | Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk |
| C. elegans Q40 line A | Morimoto lab | AM1228 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
| C. elegans Q40 line B | Morimoto lab | AM1229 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
| C. elegans Q40 line C | Morimoto lab | AM1230 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
| C. elegans Q40 line D | Morimoto lab | AM1231 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
| CellProfiler | Broad Institute | 4.1.3 | Downloaded from https://cellprofiler.org |
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
| FIJI | Open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| High-throughput confocal microscope | Yokogawa | CellVoyager CV8000 | |
| M9 buffer | Home-made | 3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4 | |
| NGM plates | Home-made | 17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol | |
| Pasteur pipette | WU Mainz | 250 | To make worm pick, 150 mm length |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | 39383 | To make worm pick, 0.25 mm diameter |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9 |
References
- Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (6), 384-396 (2014).
- Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: a summary of progress over the last decade. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 27-68 (2017).
- Knowles, T. P. J., et al. An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly. Science. 326 (5959), 1533-1537 (2009).
- Cohen, S. I. A., et al. Proliferation of amyloid-β42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9758-9763 (2013).
- Meisl, G., et al. Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models. Nature Protocols. 11 (2), 252-272 (2016).
- Satyal, S. H., et al. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5750-5755 (2000).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
- Prahlad, V., Morimoto, R. I. Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14204-14209 (2011).
- Nollen, E. A. A. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
- Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).
- Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9, 1-16 (2014).
- Calamini, B., et al. Small-molecule proteostasis regulators for protein conformational diseases. Nature Chemical Biology. 8 (2), 185-196 (2012).
- Sinnige, T., Stroobants, K., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. Biophysical studies of protein misfolding and aggregation in in vivo models of Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Quarterly Reviews of Biophysics. 49, 22 (2020).
- Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023 (2016).
- Sinnige, T., et al. Kinetic analysis reveals that independent nucleation events determine the progression of polyglutamine aggregation in C. elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 202188118 (2021).
- Brenner, S. Caenorhabditis elegans. Methods. 77 (1), 71-94 (1974).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- . FIJI/ImageJ Available from: https://imagej.net/downloads (2012)
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis. BioTechniques. 42 (1), 71-75 (2007).
- CellProfiler. Broad Institute Available from: https://cellprofiler.org/releases (2021)
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- . Knowles group, University of Cambridge Available from: https://amylofit.com/amylofitmain/login/ (2021)
- Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. Quantifying tissue-specific proteostatic decline in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), (2021).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).
- Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 141-142, 1-4 (2014).
- David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS Biology. 8 (8), 47-48 (2010).
- Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., Vayndorf, E., Taylor, B. E. Caenorhabditis sieve: A low-tech instrument and methodology for sorting small multicellular organisms. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Dong, L., et al. Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms. PLoS One. 13 (3), 0193989 (2018).
