Monitoraggio della cinetica di aggregazione proteica in vivo utilizzando il conteggio automatico dell'inclusione in Caenorhabditis elegans
Summary
Qui, viene presentato un metodo per l’analisi della cinetica di aggregazione proteica nel nematode Caenorhabditis elegans. Gli animali di una popolazione sincronizzata con l’età vengono ripresi in diversi punti temporali, seguiti dal conteggio dell’inclusione semiautomatica in CellProfiler e dall’adattamento a un modello matematico in AmyloFit.
Abstract
L’aggregazione proteica in inclusioni insolubili è un segno distintivo di una varietà di malattie umane, molte delle quali sono legate all’età. Il nematode Caenorhabditis elegans è un organismo modello ben consolidato che è stato ampiamente utilizzato nel campo per studiare l’aggregazione proteica e la tossicità. La sua trasparenza ottica consente la visualizzazione diretta dell’aggregazione proteica mediante microscopia a fluorescenza. Inoltre, il ciclo riproduttivo veloce e la breve durata della vita rendono il nematode un modello adatto per lo screening di geni e molecole che modulano questo processo.
Tuttavia, la quantificazione del carico aggregato negli animali vivi è scarsamente standardizzata, in genere eseguita mediante il conteggio manuale dell’inclusione sotto un microscopio a dissezione a fluorescenza in un singolo punto temporale. Questo approccio può comportare un’elevata variabilità tra gli osservatori e limita la comprensione del processo di aggregazione. Al contrario, l’aggregazione proteica simile all’amiloide in vitro viene regolarmente monitorata dalla fluorescenza T della tioflavina in modo altamente quantitativo e risolto nel tempo.
Qui, viene presentato un metodo analogo per l’analisi imparziale della cinetica di aggregazione nei C. elegans viventi, utilizzando un microscopio confocale ad alto rendimento combinato con analisi delle immagini su misura e adattamento dei dati. L’applicabilità di questo metodo è dimostrata monitorando la formazione di inclusione di una proteina poliglutammina (polyQ) marcata fluorescentemente nelle cellule muscolari della parete corporea. Il flusso di lavoro di analisi delle immagini consente di determinare il numero di inclusioni in diversi punti temporali, che sono adattati a un modello matematico basato su eventi di nucleazione indipendenti nelle singole cellule muscolari. Il metodo qui descritto può rivelarsi utile per valutare gli effetti dei fattori di proteostasi e le potenziali terapie per le malattie da aggregazione proteica in un animale vivente in modo robusto e quantitativo.
Introduction
L’accumulo di proteine mal ripiegate in depositi insolubili si verifica in una vasta gamma di malattie. Esempi ben noti sono l’aggregazione di amiloide-β e tau nella malattia di Alzheimer, α-sinucleina nel morbo di Parkinson e huntingtina con poliQ espanso nella malattia di Huntington 1,2. Il misfolding di questi polipeptidi in fibrille amiloidi è associato a tossicità e morte cellulare da meccanismi che sono ancora in gran parte poco chiari. Chiarire i meccanismi della formazione dell’amiloide sarà cruciale per lo sviluppo di terapie efficaci, che attualmente non sono disponibili.
Indagini dettagliate sulla formazione di amiloidi sono state eseguite in vitro sulla base di misurazioni della fluorescenza della tioflavina T, portando a una comprensione meccanicistica del processo di aggregazione e dell’effetto delle molecole inibitorie 3,4,5. Tuttavia, non è chiaro se gli stessi meccanismi di aggregazione siano validi nel complesso ambiente delle cellule e degli organismi viventi. Il verme nematode Caenorhabditis elegans è un organismo modello adatto per studiare l’aggregazione proteica in vivo. Ha un’anatomia relativamente semplice ma è costituito da più tessuti, tra cui muscoli, intestino e sistema nervoso. È geneticamente ben caratterizzato e gli strumenti per la modificazione genetica sono prontamente disponibili. Inoltre, ha un breve tempo di generazione di ~ 3 giorni e una durata totale di 2-3 settimane. Pertanto, l’aggregazione proteica può essere esaminata per tutta la durata della vita dell’animale su una scala temporale sperimentalmente conveniente. Infine, il nematode è otticamente trasparente, consentendo il tracciamento dell’aggregazione di proteine marcate fluorescentemente in animali vivi.
Queste caratteristiche di C. elegans sono state precedentemente sfruttate per studiare l’aggregazione delle proteine polyQ come modello per la Malattia di Huntington e altre malattie da espansione polyQ. Al di sopra della soglia patogenetica di 35-40 residui di glutammina, le proteine polyQ etichettate con proteina fluorescente gialla (YFP) possono essere osservate per formare inclusioni insolubili nel tessuto muscolare 6,7, neuroni8 e intestino 9,10. Queste caratteristiche sono state ampiamente utilizzate per lo screening dei geni 11,12,13 e dei modificatori di piccole molecole14 dell’aggregazione proteica e della tossicità.
C. elegans ha il potenziale per svolgere un ruolo importante nel colmare il divario tra studi in vitro sull’aggregazione proteica e modelli di malattia più complessi come i topi15. C. elegans è suscettibile di screening farmacologico16 ma può anche essere sfruttato per ottenere una comprensione fondamentale dei meccanismi molecolari dell’aggregazione proteica in vivo, come dimostrato recentemente17. Tuttavia, per entrambe le applicazioni, è di primaria importanza estrarre una misura quantitativa e riproducibile dell’aggregazione proteica. Qui, questo si ottiene con l’uso di un microscopio confocale ad alto rendimento combinato con una pipeline di analisi delle immagini dedicata (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo qui presentato facilita un’analisi imparziale e quantitativa della cinetica di aggregazione proteica nell’organismo modello C. elegans. Dipende da quattro elementi chiave (Figura 1): 1) mantenere una popolazione di nematodi sincronizzata con l’età; 2) microscopia a fluorescenza in piastre multiwell; 3) conteggio automatico delle inclusioni in CellProfiler; 4) data fitting in AmyloFit. Rispetto al conteggio manuale delle inclusioni in animali in movimento libero o da immagini salvate26, la quantificazione in CellProfiler è sia più veloce che imparziale. L’altro progresso chiave del protocollo è l’acquisizione di dati cinetici, piuttosto che di singoli punti temporali, che fornisce approfondimenti quantitativi sul meccanismo di aggregazione dopo aver adattato i dati a un modello matematico.
I quattro elementi del protocollo possono essere utilizzati come moduli indipendenti che possono essere modificati a seconda dell’applicazione. Le popolazioni sincronizzate con l’età possono anche essere mantenute utilizzando 5-fluoro-2′-deossiuridina (FUDR) per sterilizzare gli animali. Questo composto influisce sulla durata della vita e sulla proteostasi 24,25 ed è altamente cancerogeno per lo sperimentatore; tuttavia, preclude il trasferimento manuale dei worm, che può essere laborioso quando vengono gestiti grandi numeri. Altre alternative sono l’uso di mutanti sterili29 o dispositivi di filtrazione per separare la prole30.
La fase di microscopia a fluorescenza può anche essere regolata, ad esempio, utilizzando ingrandimenti più elevati per monitorare l’aggregazione proteica nei neuroni. La microscopia a campo largo può essere sufficiente per monitorare l’aggregazione di poliQ nelle cellule muscolari quando la differenza relativa tra le condizioni è più importante del numero assoluto di inclusioni. La pipeline CellProfiler può ancora essere utilizzata in questi casi, anche se le impostazioni per riconoscere worm e inclusioni dovranno essere regolate dall’utente. La produttività della tecnica è attualmente limitata dalla necessità di raccogliere manualmente gli animali nella piastra a 384 pozzetti. Questo può potenzialmente essere risolto con l’uso di dispositivimicrofluidici 16. L’azide di sodio è un anestetico relativamente duro, che potrebbe essere sostituito dall’immobilizzazione fisica con idrogel o perline28,29.
L’analisi in AmyloFit qui presentata si basa su un meccanismo di aggregazione costituito da eventi di nucleazione indipendenti in singole cellule. Nei casi in cui questo modello non si adatta, l’utente dovrebbe prendere in considerazione un’alternativa come il modello di aggregazione cooperativa sviluppato in precedenza17. Un limite di questo approccio è che devono essere disponibili ceppi che esprimono la proteina di interesse a diverse concentrazioni, sebbene questi possano essere generati utilizzando i metodi di routine di C. elegans 24.
Complessivamente, questo protocollo fornisce i mezzi per ottenere dati di alta qualità per la cinetica di aggregazione proteica in un sistema modello in vivo , consentendo un’analisi dettagliata dei meccanismi di aggregazione17. Sebbene il metodo sia stato dimostrato per l’aggregazione polyQ nel tessuto muscolare C. elegans , le future applicazioni del protocollo potrebbero includere altre proteine e tessuti e gli effetti dei fattori di proteostasi e delle piccole molecole.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il laboratorio Morimoto per i ceppi di C. elegans ed Esmeralda Bosman per l’assistenza sul microscopio confocale ad alto rendimento. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione di start-up dell’Università di Utrecht a T.S.
Materials
| 384-well plate | Greiner | 781091 | Black with flat clear bottom |
| AmyloFit | Knowles lab | v2.0 | Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk |
| C. elegans Q40 line A | Morimoto lab | AM1228 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
| C. elegans Q40 line B | Morimoto lab | AM1229 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
| C. elegans Q40 line C | Morimoto lab | AM1230 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
| C. elegans Q40 line D | Morimoto lab | AM1231 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
| CellProfiler | Broad Institute | 4.1.3 | Downloaded from https://cellprofiler.org |
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
| FIJI | Open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| High-throughput confocal microscope | Yokogawa | CellVoyager CV8000 | |
| M9 buffer | Home-made | 3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4 | |
| NGM plates | Home-made | 17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol | |
| Pasteur pipette | WU Mainz | 250 | To make worm pick, 150 mm length |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | 39383 | To make worm pick, 0.25 mm diameter |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9 |
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