Quantificação da Distribuição de Glicogênio Subcelular em Fibras Musculares Esqueléticas usando Microscopia eletrônica de transmissão
Summary
Um procedimento pós-fixação modificado aumenta o contraste das partículas de glicogênio no tecido. Este artigo fornece um protocolo passo-a-passo descrevendo como lidar com o tecido, conduzir a imagem e usar métodos esterológicos para obter dados imparciales e quantitativos sobre a distribuição de glicogênio subcelular específico do tipo de fibra no músculo esquelético.
Abstract
Com o uso de microscopia eletrônica de transmissão, podem ser obtidas imagens de alta resolução de amostras fixas contendo fibras musculares individuais. Isso permite quantificações de aspectos ultraestruturais, como frações de volume, proporções de superfície/volume, morfometria e locais de contato físico de diferentes estruturas subcelulares. Na década de 1970, um protocolo para melhor coloração de glicogênio nas células foi desenvolvido e abriu caminho para uma série de estudos sobre a localização subcelular do tamanho de partículas glicogênio e glicogênio usando microscopia eletrônica de transmissão. Enquanto a maioria das análises interpreta o glicogênio como se fosse distribuído homogêneo dentro das fibras musculares, fornecendo apenas um único valor (por exemplo, uma concentração média), a microscopia eletrônica de transmissão revelou que o glicogênio é armazenado como partículas de glicogênio discretas localizadas em compartimentos subcelulares distintos. Aqui, descreve-se o protocolo passo-a-passo da coleta de tecidos para a determinação quantitativa da fração de volume e diâmetro de partículas do glicogênio nos distintos compartimentos subcelulares das fibras musculares esqueléticas individuais. Considerações sobre como 1) coletar e manchar amostras de tecidos, 2) realizar análises de imagem e manuseio de dados, 3) avaliar a precisão das estimativas, 4) discriminar entre tipos de fibras musculares e 5) armadilhas e limitações metodológicas.
Introduction
As partículas glicogênio são compostas de polímeros ramificados de glicose e várias proteínas associadas1 e constituem um combustível importante durante altas demandas metabólicas2. Embora não amplamente reconhecidas, as partículas de glicogênio também constituem um combustível local, onde alguns processos subcelulares utilizam preferencialmente o glicogênio, apesar da disponibilidade de outros combustíveis mais duradouros como glicose plasmática e ácidos graxos3,4.
A importância de armazenar glicogênio como combustível localizado específico subcelular tem sido discutida em várias revisões5,6 principalmente com base em algumas das documentações mais antigas da distribuição subcelular de glicogênio por microscopia eletrônica de transmissão (TEM)7,8. Os primeiros estudos utilizaram diferentes protocolos para aumentar o contraste do glicogênio das técnicas histoquímicas de coloração para manchas negativas e positivas9,10. Um importante desenvolvimento metodológico foi o refinado protocolo pós-fixação com o osmium reduzido por ferrociancida de potássio111,12,13,14, o que melhorou significativamente o contraste das partículas de glicogênio. Este protocolo refinado não foi usado em alguns dos trabalhos pioneiros sobre o esgotamento do glicogênio induzido pelo exercício15, mas foi reintroduzido por Graham e seus colegas16,17.
Com base nas imagens bidimensionais, a distribuição subcelular do glicogênio é mais frequentemente descrita como partículas de glicogênio localizadas em três piscinas: subsarcolemmal (logo abaixo da membrana superficial), intermyofibrilar (entre os miofibrils) ou intramyofibrilar (dentro dos miofibrils). No entanto, partículas de glicogênio também podem ser descritas como associadas, por exemplo, a reguloso sarcoplasmático7 ou núcleos18. Além da distribuição subcelular, a vantagem do teor de glicogênio estimado pelo TEM também é que a quantificação pode ser realizada no nível único de fibra. Isso permite a investigação da variabilidade de fibra para fibra e análises correlativas com tipos de fibras e componentes celulares como mitocôndrias e gotículas lipídicas.
Aqui, descreve-se o protocolo para o teor volutrico específico do tipo de fibra tem das três piscinas subcelulares comuns de glicogênio (subsarcolemmal, intermyofibrilar e intramyofibrilar) em fibras musculares esqueléticas. O método foi aplicado aos músculos esqueléticos de humanos19, ratos20 e camundongos21; assim como aves e peixes22; e cardiomiócitos de ratos23.
Protocol
Representative Results
Discussion
A etapa crítica do método é o uso de osmium reduzido por ferrocianídeo de potássio durante a pós-fixação. A seletividade deste fixador modificado para detecção de glicogênio não pode ser totalmente explicada pela química, mas também inclui achados experimentais que demonstram nenhuma detecção de tais partículas em tecidos conhecidos por estarem livres de glicogênio ou no espaço extracelular11.
Parâmetros críticos são a precisão das estimativas e a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Comitê Olímpico Sueco.
Materials
| 1,2-Propylene oxide | Merck | 75-56-9 | |
| Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
| Glutaraldehyde solution 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ITEM | Olympus | Imaging software | |
| Leica EM AC20 | Leica | Automatic contrasting system | |
| OSIS Veleta digital camera | Olympus | ||
| Osmium tetroxide 4% solution | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Transmission EM | Philips | ||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtome Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution | Leica | 16707235 | |
| Uranyl acetate dihydrate | Polysciences | 6159-44-0 |
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