Visualización de cambios en el circuito Neuron-Glia con la técnica de imágenes de calcio

Debido a las propiedades universales del calcio como segundo mensajero, este ion está involucrado en un gran número de actividades de señalización: transcripción de genes, nacimiento y muerte, proliferación, migración y diferenciación, transmisión sináptica y plasticidad. Por lo tanto, un método capaz de rastrear la dinámica de activación del calcio con fidelidad y agilidad proporcionaría una forma de observar respuestas espacio-temporales únicas. Tal método es la técnica de imágenes de calcio celular, que correlaciona los datos funcionales de los cambios de calcio con fenotipos celulares específicos en función de sus distintas respuestas.

Las sondas de ^Ca2+ se desarrollaron por primera vez en la década de 1980, con mejoras posteriores que permitieron que estas moléculas se utilizaran en ensayos de células ^vivas1. Como indicador químico, Fura-2 se considera el estándar para las mediciones cuantitativas de [^Ca2+]_i. El éster de acetoximetil (AM) de este indicador (es decir, Fura-2 AM) impregna fácilmente la membrana celular y puede alcanzar concentraciones intracelulares 20 veces mayores que la dilución de incubación (por ejemplo, [5 μM]_o/[100 μM]_i). Otra ventaja de Fura-2 es que tiene una buena resistencia al fotoblanqueo; por lo tanto, la obtención de imágenes de este indicador durante períodos de tiempo más largos no afectará en gran medida sus capacidades de fluorescencia. Finalmente, Fura-2 es sensible a una amplia gama de niveles de calcio, desde ~100 nM hasta ~100 μM, y tiene un _Kd de ~145 nM, que es comparable al resto [^Ca2+]_i2. Más tarde, las imágenes de calcio celular se desarrollaron con mejores microscopios fluorescentes y métodos de computación, junto con sondas ratiométricas que no se ven afectadas por la carga de colorante.

Cada célula expresa diferentes dispositivos de calcio (bombas, transportadores, receptores y canales) que contribuyen a la respuesta final como una firma particular. El consejo importante es encontrar respuestas selectivas de diferentes tipos de células correlacionadas con su expresión fenotípica. En consecuencia, hay al menos dos receptores diferentes que operan a través de cambios de calcio: receptores ionotrópicos que impregnan ^{Ca2 +} en un modo rápido y receptores metabotrópicos lentos acoplados a vías de señalización y existencias intracelulares que liberan ^{Ca2 +} activado por segundos mensajeros, como el trifosfato de inositol y el ADP-ribosa ^cíclico3.

Por ejemplo, las células progenitoras expresan nestina en la retina inmadura y muestran receptores _GABAA despolarizados por GABA (o muscimol)⁴. Esto sucede debido al gradiente electroquímico de Cl^– con altos niveles intracelulares ^de Cl−; a medida que el tejido se desarrolla, los transportadores de KCC2 cambian de excitación en progenitores a inhibición en neuronas GABAérgicas ^maduras5. Por otro lado, las células madre que expresan sox-2 en la zona subventricular inmadura (SVZ) de roedores postnatales también presentan receptores metabotrópicos H1 activados por histamina aumentando El ^Ca2+ de forma ^lenta6. Un segundo receptor metabotrópico de la familia de receptores-1 activados por proteasa (PAR-1), activado por trombina y aguas abajo a G(q/11) y fosfolipasa C (PLC), produce cambios lentos de ^Ca2+ en oligodendrocitos (que expresan O4 y PLP) generados a partir de células madre neurales SVZ multipotentes7.

En general, las neuronas expresan canales de calcio dependientes del voltaje, así como los principales receptores de neurotransmisores permeables a ^Ca2+, como los receptores glutamatérgicos (AMPA, NMDA, kainato) y nicotínicos periféricos y centrales. El cloruro de potasio se suele utilizar como agente despolarizante para activar neuronas periféricas, como las neuronas ganglionares de la raíz ^dorsal8 o neuronas centrales, a partir de la zona ^{subventricular9} o ^retina10. Por otro lado, el ATP es reconocido como el principal gliotransmisor (además de la D-serina), que activa los miembros ^P2X permeables selectivos de Ca2+, como P2X7 y P2X4. Ambos receptores presentan corrientes de ^Ca2+ equivalentes, similares a las mostradas por los receptores NMDA reconocidos como las mayores corrientes de ^Ca2+ activadas por los ^{transmisores11}. Los receptores P2X7 están altamente expresados en microglía, pero a menor densidad en astrocitos y oligodendrocitos, teniendo un papel en la liberación de citoquinas proinflamatorias12. Los receptores P2X7 también se expresan en las células de ^Schwann13 y en la glía de Müller en la ^retina14,15.

Se sabe que la retina muestra casi todos los transmisores que se ven en el cerebro. Por ejemplo, el eje vertical (fotorreceptores, células ganglionares bipolares y retinianas) es principalmente glutamatérgico, con receptores AMPA o kainato permeables al calcio expresados en células OFF-bipolares y mgluR6 expresados en células ON-bipolares16. Curiosamente, los tres receptores también se encuentran en la glía de Müller, que están acoplados a las vías de calcio e inositol ^{trifosfato17,18}. El eje inhibitorio horizontal, hecho por células horizontales y amacrinas, secreta no sólo GABA, sino también dopamina, acetilcolina, y otros neurotransmisores clásicos. Las células amacrinas son los principales tipos de células que se encuentran en los cultivos de retina aviar, mostrando varios tipos de canales operados por calcio, como canales de calcio glutamatérgicos, purinérgicos, nicotínicos y dependientes del voltaje. Por esta razón, este es un excelente modelo para evaluar diferentes propiedades de los cambios de calcio entre las neuronas y la glía.

Por lo tanto, la combinación de diferentes receptores y canales sumados a marcadores fenotípicos selectivos durante el desarrollo con distintos patrones de respuesta agonista permite firmas únicas en el tallo, progenitor, neurona, astrocito, oligodendrocitos y microglia que operan a través de dispositivos de señalización selectiva.