Визуализация сдвигов на схеме Нейрон-Глия с помощью метода визуализации кальция

Благодаря универсальным свойствам кальция как второго мессенджера, этот ион участвует в огромном количестве сигнальных активностей: транскрипции генов, рождении и смерти, пролиферации, миграции и дифференцировке, синаптической передаче и пластичности. Следовательно, метод, способный отслеживать динамику активации кальция с точностью и ловкостью, обеспечит способ наблюдения уникальных пространственно-временных реакций. Таким методом является метод визуализации клеточного кальция, который коррелирует функциональные данные сдвигов кальция с конкретными фенотипами клеток на основе их различных реакций.

Зонды ^Ca2+ были впервые разработаны в 1980-х годах, а более поздние улучшения позволили использовать эти молекулы в анализах живых ^{клеток1}. В качестве химического показателя Fura-2 считается стандартом для количественных измерений [^Ca2+]_i. Эфир ацетоксиметила (AM) этого показателя (т.е. Fura-2 AM) легко проникает в клеточную мембрану и может достигать внутриклеточных концентраций, в 20 раз превышающих инкубационное разбавление (например, [5 мкМ]_o/[100 мкМ]_i). Еще одним преимуществом Fura-2 является то, что он обладает хорошей устойчивостью к фотоотбеливанию; таким образом, визуализация этого индикатора в течение более длительных периодов времени не будет сильно влиять на его флуоресцентные возможности. Наконец, Fura-2 чувствителен к широкому диапазону уровней кальция, от ~100 нМ до ~100 мкМ, и имеет _Kd ~145 нМ, что сопоставимо с покоящимся [^Ca2+]_i2. Позже была разработана визуализация кальция клеток с использованием лучших флуоресцентных микроскопов и методов вычислений вместе с ратиометрическими зондами, на которые не влияет нагрузка красителя.

Каждая клетка экспрессирует различные устройства кальция (насосы, транспортеры, рецепторы и каналы), которые способствуют конечному ответу в качестве определенной сигнатуры. Важным советом является поиск селективных реакций различных типов клеток, коррелирующих с их фенотипической экспрессией. Соответственно, существует, по крайней мере, два различных рецептора, которые действуют через сдвиги кальция: ионотропные рецепторы, которые пронизывают ^{Ca2 +} в быстром режиме, и медленные метаботропные рецепторы, связанные с сигнальными путями и внутриклеточными запасами, которые высвобождают ^{Ca2 +}, активируемые вторыми мессенджерами, такими как инозитолтрифосфат и циклическая ADP-рибоза3.

Например, клетки-предшественники экспрессируют нестин в незрелой сетчатке и показывают рецепторы _ГАМК, деполяризованные ГАМК (или мусцимолом)⁴. Это происходит из-за ^{Cl-электрохимического} градиента с высоким внутриклеточным уровнем Cl⁻; по мере развития ткани транспортеры KCC2 переключаются с возбуждения на предшественниках на ингибирование на зрелых ГАМКергических ^{нейронах5}. С другой стороны, стволовые клетки, которые экспрессируют sox-2 в незрелой субвентрикулярной зоне (SVZ) постнатальных грызунов, также представляют метаботропные рецепторы H1, активированные гистамином, медленно увеличивающим ^Ca2+.6. Второй метаботропный рецептор из семейства протеазно-активированных рецепторов-1 (PAR-1), активированный тромбином и нисходящий к G(q/11) и фосфолипазе C (PLC), дает медленные сдвиги ^Ca2+ в олигодендроцитах (которые экспрессируют O4 и PLP), генерируемых мультипотентными нервными стволовыми клетками ^SVZ7.

В целом, нейроны экспрессируют зависимые от напряжения кальциевые каналы, а также основные рецепторы нейротрансмиттеров, проницаемые для ^Ca2+, как глутаматергические (AMPA, NMDA, kainate) и периферические и центральные никотиновые рецепторы. Хлорид калия обычно используется в качестве деполяризующего агента для активации периферических нейронов, как ганглиозные нейроны дорсального ^корня8 или центральные нейроны, как из субвентрикулярной ^зоны9 или сетчатки10. С другой стороны, АТФ признан основным глиотрансмиттером (в дополнение к D-серину), который активирует селективные ^Ca2+ проницаемые члены P2X, такие как P2X7 и P2X4. Оба рецептора представляют эквивалентные токи ^Ca2+, аналогичные тем, которые показаны NMDA-рецепторами, признанными крупнейшими токами ^Ca2+, активируемыми передатчиками11. Рецепторы P2X7 высоко экспрессируются на микроглии, но при более низкой плотности на астроцитах и олигодендроцитах, играя роль в высвобождении провоспалительных ^{цитокинов12}. Рецепторы P2X7 также экспрессируются на клетках ^{Шванна13} и глии Мюллера в сетчатке14,15.

Известно, что сетчатка показывает почти все передатчики, наблюдаемые в мозге. Например, вертикальная ось (фоторецепторы, биполярные и ганглиозные клетки сетчатки) в основном глутаматергическая, с кальциепроницаемыми ampA или кайнатными рецепторами, экспрессируемыми в OFF-биполярных клетках и mgluR6, экспрессируемыми в ON-биполярных ^{клетках16}. Любопытно, что все три рецептора также обнаружены в глии Мюллера, которые связаны с путями кальция и инозитолтрифосфата17,18. Горизонтальная тормозная ось, состоящая из горизонтальных и амакриновых клеток, секретирует не только ГАМК, но и дофамин, ацетилхолин и другие классические нейромедиаторы. Амакриновые клетки являются основными типами клеток, обнаруженных в культурах птичьей сетчатки, показывая несколько типов кальциевых каналов, таких как глутаматергические, пуринергические, никотиновые и зависимые от напряжения кальциевые каналы. По этой причине это отличная модель для оценки различных свойств сдвигов кальция между нейронами и глией.

Таким образом, комбинация различных рецепторов и каналов, суммируемых с селективными фенотипическими маркерами во время развития с различными паттернами ответа агониста, позволяет создавать уникальные сигнатуры в стволе, предшественнике, нейроне, астроците, олигодендроците и микроглии, которые работают через селективные сигнальные устройства.