Visualizzazione dei cambiamenti sul circuito Neuron-Glia con la tecnica di imaging del calcio

A causa delle proprietà universali del calcio come secondo messaggero, questo ione è coinvolto in un vasto numero di attività di segnalazione: trascrizione genica, nascita e morte, proliferazione, migrazione e differenziazione, trasmissione sinaptica e plasticità. Quindi, un metodo in grado di tracciare le dinamiche di attivazione del calcio con fedeltà e agilità fornirebbe un modo per osservare risposte spazio-temporali uniche. Tale metodo è la tecnica di imaging del calcio cellulare, che correla i dati funzionali degli spostamenti del calcio con fenotipi cellulari specifici in base alle loro risposte distinte.

Le sonde ^Ca2+ sono state sviluppate per la prima volta nel 1980, con miglioramenti successivi che hanno permesso a queste molecole di essere utilizzate in saggi di cellule ^vive1. Come indicatore chimico, Fura-2 è considerato lo standard per le misurazioni quantitative [^Ca2+]_i. L’estere acetosimetilico (AM) di questo indicatore (cioè Fura-2 AM) permea facilmente la membrana cellulare e può raggiungere concentrazioni intracellulari 20 volte superiori alla diluizione di incubazione (ad esempio, [5 μM]_o/[100 μM]_i). Un altro vantaggio di Fura-2 è che ha una buona resistenza al fotosbiancamento; pertanto, l’imaging di questo indicatore per periodi di tempo più lunghi non influenzerà notevolmente le sue capacità di fluorescenza. Infine, Fura-2 è sensibile a una vasta gamma di livelli di calcio, da ~ 100 nM a ~ 100 μM, e ha un _Kd di ~ 145 nM, che è paragonabile al riposante [^{Ca2 +}] _i2. Successivamente, l’imaging del calcio cellulare è stato sviluppato con microscopi fluorescenti e metodi di calcolo migliori, insieme a sonde raziometriche che non sono influenzate dal carico del colorante.

Ogni cellula esprime diversi dispositivi di calcio (pompe, trasportatori, recettori e canali) che contribuiscono alla risposta finale come una particolare firma. Il consiglio importante è quello di trovare risposte selettive di diversi tipi di cellule correlate con la loro espressione fenotipica. Di conseguenza, ci sono almeno due diversi recettori che operano attraverso gli spostamenti del calcio: i recettori ionotropici che permeano ^{Ca2 +} in modo veloce e recettori metabotropici lenti accoppiati a vie di segnalazione e stock intracellulari che rilasciano ^{Ca2 +} attivato da secondi messaggeri, come l’inositolo trifosfato e l’ADP-ribosio ^ciclico3.

Ad esempio, le cellule progenitrici esprimono la nestin nella retina immatura e mostrano recettori _GABAA depolarizzati dal GABA (o muscimolo)⁴. Ciò accade a causa del gradiente elettrochimico Cl^– con alti livelli ^{intracellulari di Cl−} ; man mano che il tessuto si sviluppa, i trasportatori KCC2 passano dall’eccitazione sui progenitori all’inibizione sui neuroni GABAergici ^maturi5. D’altra parte, le cellule staminali che esprimono sox-2 nella zona subventricolare immatura (SVZ) dei roditori postnatali presentano anche recettori H1 metabotropici attivati dall’istamina che aumenta Il ^Ca2+ in modo ^lento6. Un secondo recettore metabotropico della famiglia par-1 (1) attivato dalla proteasi, attivato dalla trombina e a valle di G(q/11) e fosfolipasi C (PLC), fornisce lenti spostamenti di ^Ca2+ negli oligodendrociti (che esprimono O4 e PLP) generati da cellule staminali neurali SVZ ^{multipotenti7}.

In generale, i neuroni esprimono canali del calcio voltaggio-dipendenti e i principali recettori dei neurotrasmettitori permeabili al ^Ca2+, come i recettori glutamatergici (AMPA, NMDA, kainate) e periferici e centrali. Il cloruro di potassio viene solitamente utilizzato come agente depolarizzante per attivare i neuroni periferici, come i neuroni gangliari della radice ^dorsale8 o i neuroni centrali, come dalla zona subventricolare9 o ^retina10. D’altra parte, l’ATP è riconosciuto come il principale gliotrasmettitore (oltre alla D-serina), che attiva i membri ^P2X permeabili selettivi al Ca2 +, come P2X7 e P2X4. Entrambi i recettori presentano correnti di ^Ca2+ equivalenti, simili a quelle mostrate dai recettori NMDA riconosciuti come le più grandi correnti di ^Ca2+ attivate dai ^{trasmettitori11}. I recettori P2X7 sono altamente espressi sulle microglia, ma a una densità inferiore su astrociti e oligodendrociti, avendo un ruolo nel rilascio di citochine proinfiammatorie12. I recettori P2X7 sono espressi anche sulle cellule di ^Schwann13 e sulla glia di Müller nella ^retina14,15.

La retina è nota per mostrare quasi tutti i trasmettitori osservati nel cervello. Ad esempio, l’asse verticale (fotorecettori, cellule gangliari bipolari e retiniche) è principalmente glutamatergico, con AMPA permeabili al calcio o recettori kainate espressi in cellule OFF-bipolari e mgluR6 espresso in cellule ^{ON-bipolari16}. Curiosamente, tutti e tre i recettori si trovano anche nella glia di Müller, che sono accoppiati alle vie del calcio e dell’inositolo ^{trifosfato17,18}. L’asse inibitorio orizzontale, costituito da cellule orizzontali e amacrine, secerne non solo GABA, ma anche dopamina, acetilcolina e altri neurotrasmettitori classici. Le cellule amacrine sono i principali tipi di cellule presenti nelle colture retiniche aviarie, mostrando diversi tipi di canali gestiti dal calcio, come i canali del calcio glutamatergici, purinergici, nicotinici e voltaggio-dipendenti. Per questo motivo, questo è un ottimo modello per valutare le diverse proprietà degli spostamenti di calcio tra neuroni e glia.

Pertanto, la combinazione di diversi recettori e canali sommati a marcatori fenotipici selettivi durante lo sviluppo con distinti modelli di risposta agonista consente firme uniche in stelo, progenitore, neurone, astrocita, oligodendrocita e microglia che operano attraverso dispositivi di segnalazione selettiva.