Visualisierung von Verschiebungen auf dem Neuron-Glia-Schaltkreis mit der Kalzium-Bildgebungstechnik

Aufgrund der universellen Eigenschaften von Kalzium als zweiter Botenstoff ist dieses Ion an einer Vielzahl von Signalaktivitäten beteiligt: Gentranskription, Geburt und Tod, Proliferation, Migration und Differenzierung, synaptische Übertragung und Plastizität. Daher würde eine Methode, die in der Lage ist, die Dynamik der Kalziumaktivierung mit Genauigkeit und Beweglichkeit zu verfolgen, eine Möglichkeit bieten, einzigartige räumlich-zeitliche Reaktionen zu beobachten. Eine solche Methode ist die zelluläre Kalzium-Bildgebungstechnik, die funktionelle Daten mit spezifischen Zellphänotypen korreliert, basierend auf ihren unterschiedlichen Reaktionen.

^Ca2+-Sonden wurden erstmals in den 1980er Jahren entwickelt, mit späteren Verbesserungen, die es ermöglichten, diese Moleküle in Lebendzellassays zu ^verwenden1. Als chemischer Indikator gilt Fura-2 als Standard für quantitative [^Ca2+]_i-Messungen. Der Acetoxymethylester (AM) dieses Indikators (d. h. Fura-2 AM) durchdringt leicht die Zellmembran und kann intrazelluläre Konzentrationen erreichen, die 20-fach größer sind als die Inkubationsverdünnung (z. B. [5 μM]_o/[100 μM]_i). Ein weiterer Vorteil von Fura-2 ist, dass es eine gute Fotobleichbeständigkeit hat; Daher hat die Abbildung dieses Indikators über längere Zeiträume keinen großen Einfluss auf seine Fluoreszenzfähigkeiten. Schließlich ist Fura-2 empfindlich gegenüber einem breiten Bereich von Kalziumspiegeln, von ~ 100 nM bis ~ 100 μM, und hat einen _Kd von ~ 145 nM, was mit dem ruhenden [Ca2 ^{+ ]}_i2 vergleichbar ist_. Später wurde die Zellkalziumbildgebung mit besseren Fluoreszenzmikroskopen und Berechnungsmethoden entwickelt, zusammen mit ratiometrischen Sonden, die nicht von der Farbstoffbelastung betroffen sind.

Jede Zelle exprimiert verschiedene Kalziumgeräte (Pumpen, Transporter, Rezeptoren und Kanäle), die als besondere Signatur zur endgültigen Reaktion beitragen. Der wichtige Tipp ist, selektive Reaktionen verschiedener Zelltypen zu finden, die mit ihrer phänotypischen Expression korrelieren. Dementsprechend gibt es mindestens zwei verschiedene Rezeptoren, die durch Kalziumverschiebungen arbeiten: ionotrope Rezeptoren, die Ca2+ in einem schnellen Modus durchdringen, und langsame metabotrope Rezeptoren, die an Signalwege gekoppelt sind, und intrazelluläre Bestände, die ^Ca2+ freisetzen, das durch zweite Botenstoffe wie Inositoltriphosphat und zyklisches ^ADP-Ribose3 aktiviert wird^.

Zum Beispiel exprimieren Vorläuferzellen Nestin in der unreifen Netzhaut und zeigen GABAA-Rezeptoren, die durch GABA (oder Muscimol) depolarisiert ^sind4. Dies geschieht aufgrund des elektrochemischen ^{Cl-Gradienten} mit hohen intrazellulären Cl^−-Werten; Wenn sich das Gewebe entwickelt, wechseln KCC2-Transporter von der Anregung an Vorläuferzellen zur Hemmung an reifen GABAergen ^Neuronen5. Auf der anderen Seite präsentieren Stammzellen, die Sox-2 in der unreifen subventrikulären Zone (SVZ) postnataler Nagetiere exprimieren, auch metabotrope H1-Rezeptoren, die durch Histamin aktiviert werden, das ^Ca2+ langsam ^erhöht6. Ein zweiter metabotroper Rezeptor aus der Protease-aktivierten Rezeptor-1 (PAR-1)-Familie, der durch Thrombin aktiviert wird und nach G(q/11) und Phospholipase C (PLC) nachgeschaltet ist, führt zu langsamen ^Ca2+-Verschiebungen in Oligodendrozyten (die O4 und PLP exprimieren), die aus multipotenten neuronalen SVZ-Stammzellen erzeugt ^werden7.

Im Allgemeinen exprimieren Neuronen spannungsabhängige Kalziumkanäle sowie wichtige Neurotransmitterrezeptoren, die für ^{Ca2 + durchlässig sind}, als glutamaterge (AMPA, NMDA, Kainate) und periphere und zentrale Nikotinrezeptoren. Kaliumchlorid wird normalerweise als Depolarisationsmittel verwendet, um periphere Neuronen zu aktivieren, wie die dorsalen Wurzelganglion-Neuronen8 oder zentrale Neuronen, wie aus der subventrikulären ^Zone9 oder ^Retina10. Auf der anderen Seite wird ATP als der wichtigste Gliotransmitter (zusätzlich zu D-Serin) anerkannt, der selektive ^{Ca2 + permeable} P2X-Mitglieder als P2X7 und P2X4 aktiviert. Beide Rezeptoren weisen äquivalente Ca2+-Ströme auf, ähnlich denen, die von NMDA-Rezeptoren gezeigt werden, die als die größten ^Ca2+-Ströme anerkannt sind, die von Transmittern aktiviert ^werden11. P2X7-Rezeptoren werden auf Mikroglia stark exprimiert, aber in einer geringeren Dichte auf Astrozyten und Oligodendrozyten, die eine Rolle bei der Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen ^spielen12. P2X7-Rezeptoren werden auch auf Schwann-Zellen13 und ^{Müller-Glia in der Netzhaut14,15} exprimiert^.

Es ist bekannt, dass die Netzhaut fast alle im Gehirn gesehenen Sender zeigt. Zum Beispiel ist die vertikale Achse (Photorezeptoren, bipolare und retinale Ganglienzellen) hauptsächlich glutamaterg, mit calciumdurchlässigen AMPA- oder Kainatrezeptoren, die in OFF-bipolaren Zellen exprimiert werden, und mgluR6, das in ON-bipolaren Zellen exprimiert ^wird16. Seltsamerweise finden sich alle drei Rezeptoren auch in Müller-Glia, die an Calcium- und Inositoltriphosphatwege gekoppelt ^sind17,18. Die horizontale inhibitorische Achse, die aus horizontalen und amakrinen Zellen besteht, sezerniert nicht nur GABA, sondern auch Dopamin, Acetylcholin und andere klassische Neurotransmitter. Amakrinzellen sind die Haupttypen von Zellen, die in den Vogelnetzhautkulturen vorkommen und verschiedene Arten von kalziumbetriebenen Kanälen zeigen, wie glutamaterge, purinerge, nikotinische und spannungsabhängige Kalziumkanäle. Aus diesem Grund ist dies ein hervorragendes Modell, um verschiedene Eigenschaften von Kalziumverschiebungen zwischen Neuronen und Glia zu bewerten.

Daher ermöglicht die Kombination verschiedener Rezeptoren und Kanäle, die während der Entwicklung zu selektiven phänotypischen Markern summiert werden, mit unterschiedlichen Agonisten-Reaktionsmustern einzigartige Signaturen in Stamm, Vorläufer, Neuron, Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia, die durch selektive Signalgeräte arbeiten.