Visualiser les changements sur le circuit neurone-glie avec la technique d’imagerie calcique

En raison des propriétés universelles du calcium en tant que deuxième messager, cet ion est impliqué dans un grand nombre d’activités de signalisation: transcription des gènes, naissance et mort, prolifération, migration et différenciation, transmission synaptique et plasticité. Par conséquent, une méthode capable de suivre la dynamique d’activation du calcium avec fidélité et agilité fournirait un moyen d’observer des réponses spatio-temporelles uniques. Une telle méthode est la technique d’imagerie cellulaire du calcium, qui met en corrélation les données fonctionnelles des décalages calciques avec des phénotypes cellulaires spécifiques en fonction de leurs réponses distinctes.

Les sondes ^Ca2+ ont été développées pour la première fois dans les années 1980, avec des améliorations ultérieures permettant à ces molécules d’être utilisées dans des tests de cellules ^vivantes1. En tant qu’indicateur chimique, fura-2 est considéré comme la norme pour les mesures quantitatives [^Ca2+]_i. L’ester acétoxyméthyl (AM) de cet indicateur (c.-à-d. Fura-2 AM) pénètre facilement dans la membrane cellulaire et peut atteindre des concentrations intracellulaires 20 fois supérieures à la dilution d’incubation (p. ex., [5 μM]_o/[100 μM]_i). Un autre avantage de Fura-2 est qu’il a une bonne résistance au photoblanchiment; ainsi, l’imagerie de cet indicateur pendant de plus longues périodes n’affectera pas grandement ses capacités de fluorescence. Enfin, Fura-2 est sensible à une large gamme de niveaux de calcium, de ~100 nM à ~100 μM, et a un _Kd de ~145 nM, ce qui est comparable au repos [^Ca2+]_i2. Plus tard, l’imagerie du calcium cellulaire a été développée avec de meilleurs microscopes fluorescents et méthodes de calcul, ainsi que des sondes ratiométriques qui ne sont pas affectées par la charge en colorant.

Chaque cellule exprime différents dispositifs calciques (pompes, transporteurs, récepteurs et canaux) qui contribuent à la réponse finale en tant que signature particulière. L’astuce importante est de trouver des réponses sélectives de différents types de cellules corrélées à leur expression phénotypique. En conséquence, il existe au moins deux récepteurs différents qui fonctionnent par décalage calcique : les récepteurs ionotropes qui imprègnent le ^Ca2+ en mode rapide et les récepteurs métabotropiques lents couplés aux voies de signalisation et aux stocks intracellulaires qui libèrent du ^Ca2+ activé par des seconds messagers, tels que l’inositol triphosphate et l’ADP-ribose3 cyclique.

Par exemple, les cellules progénitrices expriment la nestine dans la rétine immature et montrent des récepteurs _GABAA dépolarisés par GABA (ou muscimol)⁴. Cela se produit en raison du gradient électrochimique Cl^– avec des niveaux intracellulaires ^{élevés de Cl−}; au fur et à mesure que le tissu se développe, les transporteurs KCC2 passent de l’excitation sur les progéniteurs à l’inhibition sur les neurones GABAergiques ^matures5. D’autre part, les cellules souches qui expriment le sox-2 dans la zone sous-ventriculaire immature (SVZ) des rongeurs postnatals présentent également des récepteurs H1 métabotropes activés par l’histamine augmentant lentement le ^Ca2+6. Un deuxième récepteur métabotropique de la famille des récepteurs 1 activés par la protéase (PAR-1), activé par la thrombine et en aval de G(q/11) et de phospholipase C (PLC), donne des changements lents de ^Ca2+ dans les oligodendrocytes (qui expriment O4 et PLP) générés à partir de cellules souches neurales SVZ multipotentes7.

En général, les neurones expriment des canaux calciques voltage-dépendants ainsi que des récepteurs neurotransmetteurs majeurs perméables au ^Ca2+, comme les récepteurs glutamatergiques (AMPA, NMDA, kainate) et les récepteurs nicotiniques périphériques et centraux. Le chlorure de potassium est généralement utilisé comme agent dépolarisant pour activer les neurones périphériques, comme les neurones ganglionnaires de la racine ^dorsale8 ou les neurones centraux, comme à partir de la zone sous-ventriculaire9 ou de la ^rétine10. D’autre part, l’ATP est reconnu comme le principal gliotransmetteur (en plus de la D-sérine), qui active les membres ^P2X perméables sélectifs Ca2+, comme P2X7 et P2X4. Les deux récepteurs présentent des courants ^Ca2+ équivalents, similaires à ceux montrés par les récepteurs NMDA reconnus comme les plus grands courants ^Ca2+ activés par les ^émetteurs11. Les récepteurs P2X7 sont fortement exprimés sur la microglie, mais à une densité plus faible sur les astrocytes et les oligodendrocytes, ayant un rôle dans la libération de cytokines ^{pro-inflammatoires12}. Les récepteurs P2X7 sont également exprimés sur les cellules ^{de Schwann13} et la glie de Müller dans la ^rétine14,15.

La rétine est connue pour montrer presque tous les transmetteurs vus dans le cerveau. Par exemple, l’axe vertical (photorécepteurs, cellules bipolaires et ganglionnaires rétiniennes) est principalement glutamatergique, avec des récepteurs AMPA ou kainate perméables au calcium exprimés dans les cellules OFF-bipolaires et mgluR6 exprimés dans les cellules ^{ON-bipolaires16}. Curieusement, les trois récepteurs se trouvent également dans la glie de Müller, qui sont couplés aux voies du calcium et de l’inositol ^{triphosphate17,18}. L’axe inhibiteur horizontal, fabriqué par les cellules horizontales et amacrines, sécrète non seulement du GABA, mais aussi de la dopamine, de l’acétylcholine et d’autres neurotransmetteurs classiques. Les cellules amacrines sont les principaux types de cellules trouvées dans les cultures rétiniennes aviaires, montrant plusieurs types de canaux opérés par le calcium, comme les canaux calciques glutamatergiques, purinergiques, nicotiniques et dépendants de la tension. Pour cette raison, il s’agit d’un excellent modèle pour évaluer différentes propriétés des changements de calcium parmi les neurones et la glie.

Par conséquent, la combinaison de différents récepteurs et canaux additionnés à des marqueurs phénotypiques sélectifs au cours du développement avec des modèles de réponse agoniste distincts permet des signatures uniques dans la tige, le progéniteur, le neurone, l’astrocyte, l’oligodendrocyte et la microglie qui fonctionnent à travers des dispositifs de signalisation sélective.