Extracción y purificación de la proteína FAHD1 del riñón porcino y el hígado de ratón
Summary
Este protocolo describe cómo extraer la proteína 1 que contiene el dominio fumarilacetato hidrolasa (FAHD1) del riñón porcino y el hígado de ratón. Los métodos enumerados pueden adaptarse a otras proteínas de interés y modificarse para otros tejidos.
Abstract
La proteína 1 que contiene el dominio de la fumarilacetoacetato hidrolasa (FAHD1) es el primer miembro identificado de la superfamilia FAH en eucariotas, actuando como oxaloacetato descarboxilasa en las mitocondrias. Este artículo presenta una serie de métodos para la extracción y purificación de FAHD1 a partir de riñón porcino e hígado de ratón. Los métodos cubiertos son la cromatografía de intercambio iónico con cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC), la filtración en gel preparativa y analítica con FPLC y los enfoques proteómicos. Después de la extracción total de proteínas, se exploró la precipitación de sulfato de amonio y la cromatografía de intercambio iónico, y se extrajo FAHD1 a través de una estrategia secuencial utilizando intercambio iónico y cromatografía de exclusión de tamaño. Este enfoque representativo puede adaptarse a otras proteínas de interés (expresadas a niveles significativos) y modificarse para otros tejidos. La proteína purificada del tejido puede apoyar el desarrollo de anticuerpos de alta calidad y/o inhibidores farmacológicos potentes y específicos.
Introduction
La proteína 1 que contiene el dominio faH eucariota (FAHD1) actúa como oxaloacetato bifuncional (OAA) descarboxilasa (ODx)1 y acilpiruvato hidrolasa (ApH)2. Se localiza en las mitocondrias2 y pertenece a la amplia superfamilia faH de enzimas 1,2,3,4,5,6. Mientras que su actividad apH es solo de menor relevancia, la actividad ODx de FAHD1 está involucrada en la regulación del flujo del ciclo TCA 1,7,8,9. La OAA no solo es necesaria para la reacción de la citrato sintasa central en el ciclo del ácido tricarboxílico, sino que también actúa como un inhibidor competitivo de la succinato deshidrogenasa como parte del sistema de transporte de electrones y como metabolito cataplerótico. La regulación a la baja de la expresión del gen FAHD1 en células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) resultó en una reducción significativa en la tasa de proliferación celular10, y una inhibición significativa del potencial de membrana mitocondrial, asociada con un cambio concomitante a la glucólisis. El modelo de trabajo se refiere a la disfunción mitocondrial asociada a la senescencia (MiDAS)11-como el fenotipo8, donde los niveles de OAA mitocondrial están estrechamente regulados por la actividad de FAHD1 1,8,9.
La proteína recombinante es más fácil de obtener a través de la expresión y purificación de la bacteria12 en lugar de a partir del tejido. Sin embargo, una proteína expresada en bacterias puede estar sesgada por la posible falta de modificaciones post-traduccionales, o simplemente puede ser problemática (es decir, debido a la pérdida de plásmidos, respuestas al estrés bacteriano, enlaces disulfuro distorsionados / no formados, secreción nula o deficiente, agregación de proteínas, escisión proteolítica, etc.). Para ciertas aplicaciones, la proteína debe obtenerse a partir de lisado celular o tejido, con el fin de incluir tales modificaciones y / o excluir posibles artefactos. La proteína purificada del tejido apoya el desarrollo de anticuerpos de alta calidad y/o inhibidores farmacológicos potentes y específicos para enzimas seleccionadas, como para FAHD113.
Este manuscrito presenta una serie de métodos para la extracción y purificación de FAHD1 a partir de riñón porcino e hígado de ratón. Los métodos descritos requieren cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC), pero por lo demás utilizan equipos de laboratorio comunes. Los métodos alternativos se pueden encontrar en otros lugares 14,15,16,17. Después de la extracción total de proteínas, el protocolo propuesto implica una fase de prueba, en la que se discuten los subprotocolos para la precipitación de sulfato de amonio y la cromatografía de intercambio iónico (Figura 1). Después de definir estos subprotos protocolos, la proteína de interés se extrae a través de una estrategia secuencial utilizando intercambio iónico y cromatografía de exclusión de tamaño con FPLC. Sobre la base de estas directrices, el protocolo final puede adaptarse individualmente para otras proteínas de interés.
Figura 1: La estrategia general de este protocolo. De arriba a abajo: La proteína se extrae de los tejidos. El homogeneizado tisular se prepara, centrifuga y filtra. Para cada par de muestras sobrenadantes y derivadas de pellets, se deben realizar pruebas de precipitación de sulfato de amonio y cromatografía de intercambio iónico (FPLC) para sondear las condiciones óptimas. Después de establecer estos subprotos protocolos, la proteína se puede extraer a través de un procedimiento secuencial de precipitación de sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión de tamaño repetitivo (FPLC) a diferentes concentraciones de pH y sal. Todos los pasos deben ser controlados por Western Blot. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pasos críticos en el protocolo
Seguir pautas comunes para el manejo de proteínas es esencial, como trabajar en hielo y en condiciones moderadas de pH y sal. El uso de inhibidores de la proteasa es beneficioso para el método, mientras que el uso de inhibidores del proteasoma es muy recomendable. La congelación y descongelación de la muestra siempre puede dar lugar a la precipitación de proteínas (al menos parcialmente), por lo que cualquier alícuota descongelada de lisado proteico inicial (paso…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores están muy agradecidos por la asistencia técnica de Ayse Öztürk y Eva Albertini. Los ratones utilizados para la generación de tejido hepático se mantuvieron bajo la supervisión de la Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Instituto de Investigación Biomédica sobre el Envejecimiento de la Universidad de Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Austria).
Materials
| 0.22 µm filter units | MERCK | SLGP033RS | Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril |
| 0.45 µm filter units | MERCK | SLHP033NS | Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril |
| 15 mL Falcon tubes | VWR | 734-0451 | centrifugal tubes |
| 50 mL Falcon tubes | VWR | 734-0448 | centrifugal tubes |
| 96-Well UV Microplate | Thermo-Fischer | 8404 | UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates |
| Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio) | BIO-RAD | #1610147 | 40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels |
| ÄKTA FPLC system | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | – | using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system |
| Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC901024 | centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL |
| Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC801024 | centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL |
| Ammonium sulfate powder | MERCK | A4418 | ammonium sulphate for molecular biology, ≥99.0% |
| Ammoniumpersulfat reagent grade, 98% | MERCK | 215589 | Catalyst for acrylamide gel polymerization. |
| Coomassie Brilliant blue R 250 | MERCK | 1125530025 | Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 °C) |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MERCK | D9277 | Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis. |
| Eppendof tubes 1.5 mL | VWR | 525-1042 | microcentrifugal tubes; autoclaved |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 28989334 | HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins |
| Immun-Blot PVDF Membrane | BIO-RAD | #1620177 | PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications. |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | #1703930 | Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels. |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels | BIO-RAD | #1658004 | 4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam. |
| Mono Q 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516701 | Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins. |
| Mono S 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516901 | Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins. |
| PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | Thermo-Fischer | 26616 | A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo-Fischer | 23225 | A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration. |
| Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter | Branson | – | New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf |
| Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated) | Agilent Dako | P0399 | The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes. |
| TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA | MERCK | T9281 | TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels. |
| Tube Roller | – | – | A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71 |
| Tube Rotator | – | – | A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123 |
| ULTRA-TURRAX; T 25 digital | IKA | 0003725000 | New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/ |
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