JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Остаточно-специфический обмен пролина на аналоги пролина в флуоресцентных белках: как «молекулярная хирургия» позвоночника влияет на складчатость и стабильность

Published: February 03, 2022
doi:
10.3791/63320
, , , ,
1Institute of Chemistry,Technische Universität Berlin, 2Department of Chemistry,University of Manitoba, 3Institute of Physics,Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Summary

Чтобы преодолеть ограничения классического сайт-направленного мутагенеза, аналоги пролина со специфическими модификациями были включены в несколько флуоресцентных белков. Показано, как замена водорода фтором или одинарных двойными связями в пролиновых остатках («молекулярная хирургия») влияет на фундаментальные свойства белка, включая их сворачивание и взаимодействие со светом.

Abstract

Замена остатков пролина (Pro) в белках традиционным сайт-направленным мутагенезом любой из оставшихся 19 канонических аминокислот часто наносит ущерб сворачиванию белка и, в частности, созреванию хромофора в зеленых флуоресцентных белках и связанных с ними вариантах. Разумной альтернативой является манипулирование трансляцией белка таким образом, чтобы все остатки Pro были заменены остатками, в частности аналогами, методом, известным как селективное включение давления (SPI). Встроенные химические модификации могут быть использованы в качестве своего рода «молекулярной хирургии» для тонкого рассечения измеримых изменений или даже рационального манипулирования различными свойствами белка. Здесь исследование демонстрирует полезность метода SPI для изучения роли пролинов в организации типичной β-бочковой структуры спектральных вариантов зеленого флуоресцентного белка (GFP) с 10-15 пролинами в их последовательности: усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP), NowGFP и KillerOrange. Остатки Pro присутствуют в соединительных секциях между отдельными β-нитями и составляют закрывающие крышки каркаса ствола, тем самым отвечая за изоляцию хромофора от воды, т.е. флуоресцентные свойства. Эксперименты селективного включения давления с (4R)-фторпролином (R-Flp), (4S)-фторпролином (S-Flp), 4,4-дифторпролином (Dfp) и 3,4-дегидропролином (Dhp) проводили с использованием пролин-ауксотрофного штамма E. coli в качестве экспрессионного хозяина. Мы обнаружили, что флуоресцентные белки с S-Flp и Dhp активны (то есть флуоресцентны), в то время как два других аналога (Dfp и R-Flp) продуцируют дисфункциональные, неправильно свернутые белки. Проверка профилей поглощения и флуоресцентного излучения UV-Vis показала несколько характерных изменений в белках, содержащих аналоги Pro. Изучение кинетических профилей сворачивания в вариантах EGFP показало ускоренный процесс перефолдирования в присутствии S-Flp, в то время как процесс был похож на дикий тип в белке, содержащем Dhp. Это исследование демонстрирует способность метода SPI производить тонкие модификации белковых остатков на атомном уровне («молекулярная хирургия»), которые могут быть приняты для изучения других белков, представляющих интерес. Проиллюстрированы результаты замены пролина близкими химическими аналогами по складчатым и спектроскопическим свойствам в классе β-бочкообразных флуоресцентных белков.

Introduction

Классический сайт-направленный мутагенез позволяет перемещать любую существующую генно-кодированную белковую последовательность путем манипуляций с кодоном на уровне ДНК. Для изучения сворачивания и стабильности белка часто желательно заменить аналогичные аминокислоты аналогичными аналогами. Однако традиционный белковый мутагенез определенно ограничен структурно похожими заменителями среди канонических аминокислот, таких как Ser/Ala/Cys, Thr/Val, Glu/Gln, Asp/Asn, Tyr/Phe, которые присутствуют в стандартном репертуаре генетического кода. С другой стороны, нет таких возможностей для других канонических аминокислот, таких как Trp, Met, His или Pro, которые часто играют важную структурную и функциональную роль в белках1. Идеальным подходом к изучению этих взаимодействий в контексте высокоспецифичной внутренней архитектуры белков и процесса их сворачивания является генерация неразрушающих изостерических модификаций. Действительно, когда изостерические аминокислотные аналоги этих канонических аминокислот, также известные как неканонические аминокислоты (ncAA), вставляются в белки, они допускают тонкие изменения даже на уровне отдельных атомов или групп атомов, таких как H / F, CH2 / S / Se / Te, известные как «атомные мутации»2. Такая «молекулярная хирургия» производит измененные белки, свойства которых являются результатом исключительно обмена отдельными атомами или группами атомов, которые в благоприятных случаях могут быть проанализированы, а обнаруженные изменения могут быть рационализированы. Таким образом, сфера синтеза белка для изучения сворачивания и структуры белка выходит далеко за рамки классического мутагенеза ДНК. Обратите внимание, что белки, генерируемые сайт-направленным мутагенезом, обычно называют «мутантами», тогда как белки с замещенными каноническими аминокислотами называют «вариантами» 3, «аллопротеинами»4 или «белковыми конгенерами»5.

Зеленый флуоресцентный белок (GFP), впервые идентифицированный в морском организме Aequorea victoria, проявляет ярко-зеленую флуоресценцию при воздействии ультрафиолетового и синего света 6,7. Сегодня GFP обычно используется в качестве высокочувствительного инструмента маркировки для рутинной визуализации экспрессии генов и локализации белка в клетках с помощью флуоресцентной микроскопии. GFP также оказался полезным в различных биофизическихисследованиях 8,9,10 и биомедицинскихисследованиях 11,12, а также в белковой инженерии 13,14,15. Тщательный анализ структуры GFP позволил создать многочисленные варианты, характеризующиеся различной стабильностью и максимумами флуоресценции16,17. Большинство вариантов GFP, используемых в клеточной и молекулярной биологии, представляют собой мономерные белки как в растворе, так и в кристалле18. Их основная структурная организация характерна для всех членов семейства GFP, независимо от их филогенетического происхождения, и состоит из 11 β-нитей, образующих так называемую β ствола, в то время как изогнутая α-спираль проходит через центр ствола и несет хромофор (рисунок 1A). Автокаталитическое созревание хромофора (рисунок 1B) требует точного позиционирования окружающих его боковых цепей в центральном месте белка; многие из этих боковых цепей хорошо сохраняются в других вариантах GFP19. В большинстве флуоресцентных белков медуз, таких как Aequorea victoria, зеленый хромофор состоит из двух ароматических колец, включая фенольное кольцо Tyr66 и пятичленную гетероциклическую структуру имидазолинона (рисунок 1B). Хромофор при правильном внедрении в белковую матрицу отвечает за характерную флуоресценцию всего белка. Он расположен в центре конструкции, в то время как конструкция ствола изолирует его от водной среды20. Воздействие хромофора на объемную воду приведет к закалке флуоресценции, т.е. потере флуоресценции21.

Правильное складывание бочкообразной структуры имеет важное значение для защиты хромофора от флуоресцентного гашения22. Остатки пролина (Pro) играют особую роль в структурной организации GFP23. Будучи неспособными поддерживать β-нити, они представляют собой соединительные петли, ответственные за поддержание структуры белка в целом. Неудивительно, что 10-15 остатков пролина содержатся как в Aequorea-, так и в Anthoathecata-производных GFP; некоторые из них хорошо сохраняются в других типах флуоресцентных β-бочковых белков. Ожидается, что пролины будут критически влиять на складчатые свойства из-за их своеобразных геометрических особенностей. Например, в ГФП, полученных из Aequorea, из десяти остатков пролина (рисунок 2A) девять образуют транс– и только один образует цис-пептидную связь (Pro89). Pro58 является незаменимым, т.е. не взаимозаменяемым с остальными 19 каноническими аминокислотами. Этот остаток может быть ответственен за правильное позиционирование остатка Trp57, который, как сообщается, имеет решающее значение для созревания хромофора и общего складывания GFP24. Фрагмент PVPWP с тремя пролиновыми остатками (Pro54, Pro56, Pro58) и Trp57 является неотъемлемой частью «нижней крышки» в структуре GFP из рисунка 1A. Структурный мотив PVPWP содержится в нескольких белках, таких как цитохромы и эукариотические калиевые каналы25, активируемые напряжением. Замены пролина на аланин в позициях 75 и 89 также вредны для экспрессии и сворачивания белка и отменяют созревание хромофора. Pro75 и Pro89 являются частью «верхней крышки», закапывающей хромофор (рисунок 1А), и сохраняются на 11-цепочечных β-бочковых флуоресцентных белках23. Эти две «крышки» удерживают хромофор исключенным из водного растворителя, даже когда стабильная третичная структура была частично нарушена26. Такая специфическая молекулярная архитектура защищает флуорофор от коллизионного (динамического) флуоресцентного гашения, например, водой, кислородом или другими диффузными лигандами.

Для того чтобы выполнить молекулярную инженерию структуры GFP, следует ввести аминокислотные замены в первичную структуру белка. Многочисленные мутации были выполнены на GFP, обеспечивая варианты с повышенной стабильностью, быстрым и надежным сворачиванием и переменными флуоресцентными свойствами17. Тем не менее, в большинстве случаев мутация остатков пролина считается рискованным подходом из-за того, что ни одна из оставшихся 19 канонических аминокислот не может должным образом восстановить конформационный профиль пролинового остатка27. Таким образом, был разработан альтернативный подход, при котором остатки пролина заменяются другими структурами на основе пролина, получившими название пролиновых аналогов28. Благодаря своей уникальной циклической химической структуре, пролин проявляет два характерных конформационных перехода (рисунок 1С): 1) пролиновое кольцевое изгибание, быстрый процесс, влекущий за собой организацию позвоночника, который в первую очередь влияет на φ угол кручения, и 2) цис/транс изомеризация пептидной связи, медленный процесс, влияющий на сворачивание позвоночника через углы кручения ω. Из-за своей медленной природы последний переход обычно отвечает за этапы ограничения скорости в процессе сворачивания всего белка. Ранее было показано, что цис/транс изомеризация пептидной связи вокруг некоторых остатков пролина имеет медленные этапы сворачивания вариантов GFP. Например, образование цис-пептидной связи в Pro89 характеризуется медленным этапом в процессе сворачивания, поскольку он опирается на переход связи от транса к цис-29. Более быстрое перефолдирование может быть достигнуто после замены Pro89 полностью транспептидной петлей, т.е. путем отмены события изомеризации цис-транс 30. В дополнение к изомеризации цис/транс, переходы шайбы могут также генерировать глубокие изменения в сворачивании белка из-за организации позвоночника и упаковки внутри белка27,31.

Химические модификации приводят к изменению внутренних конформационных переходов остатков пролина, тем самым влияя на способность белка сворачиваться. Некоторые аналоги пролина являются особенно привлекательными кандидатами для замещения пролина в белках, поскольку они позволяют манипулировать и изучать свойства сворачивания. Например, (4R)-фторпролин (R-Flp), (4S)-фторпролин (S-Flp), 4,4-дифторпролин (Dfp) и 3,4-дегидропролин (Dhp) являются четырьмя аналогами (рисунок 1D), которые минимально отличаются от пролина как по молекулярному объему, так и по полярности32. В то же время каждый аналог демонстрирует отчетливое кольцевое покачивание: S-Flp стабилизирует C 4-эндо-шайбу, R-Flp стабилизирует C 4-экзо-шайбу, Dfp не демонстрирует явного предпочтения шайбы, в то время как Dhp отменяет шайбу (рисунок 1D)33. Используя эти аналоги в структуре белка, можно манипулировать конформационным переходом остатков пролина, и тем самым влиять на свойства результирующих вариантов GFP.

В данной работе мы поставили перед собой цель включить обозначенный набор аналогов пролина (рисунок 1D) в структуру вариантов GFP с использованием метода селективного включения давления (SPI, рисунок 3)34. Замена аминокислотных остатков их ближайшими изоструктурными аналогами является прикладной биотехнологической концепцией в белковом дизайне35,36. Таким образом, эффекты аналогов пролина в модельном белке иллюстрируют их потенциал служить инструментами в белковой инженерии37. Продуцирование белков, содержащих желаемые аналоги, осуществляли в модифицированных штаммах E. coli, которые не способны продуцировать пролин (пролин-ауксотрофия). Таким образом, они могут быть вынуждены принять замену субстратов в процессе биосинтеза белка38. Эта глобальная замена пролина обеспечивается естественной гибкостью субстрата эндогенных аминоацил-тРНК-синтетаз39, ключевых ферментов, катализирующих этерификацию тРНК соответствующими аминокислотами40. В общем, как показано на рисунке 3, клеточный рост осуществляется в определенной среде до тех пор, пока не будет достигнута середина логарифмической фазы роста. На следующем этапе аминокислота, подлежащая замене, внутриклеточно истощается из системы экспрессии во время ферментации и впоследствии обменивается желаемым аналогом или ncAA. Затем экспрессия целевого белка индуцируется для специфического для остатка неканонического включения аминокислот. Замена родственной аминокислоты аналогом происходит в протеомном порядке. Хотя этот побочный эффект может оказывать негативное влияние на рост штамма-хозяина, качество продукции целевого белка в основном не влияет, поскольку в рекомбинантной экспрессии клеточные ресурсы в основном направлены на выработку целевого белка41,42. Поэтому жестко регулируемая, индуцируемая система экспрессии и сильные промоутеры имеют решающее значение для высокой эффективности инкорпорации43. Наш подход основан на множественном специфическом для остатка включении ncAA в ответ на кодоны чувств (переназначение кодонов смысла), в результате чего в гене-мишени количество позиций для аналоговой вставки Pro можно манипулировать с помощью сайт-направленного мутагенеза44. Аналогичный подход применялся в нашем предыдущем докладе о получении рекомбинантных пептидов с антимикробными свойствами45. В этой работе мы применили метод SPI, который позволяет заменить все остатки пролина родственными аналогами, чтобы генерировать белки, которые, как ожидается, будут обладать отчетливыми физико-химическими свойствами, отсутствующими в белках, синтезированных с каноническим аминокислотным репертуаром. Характеризуя профиль складывания и флуоресценции результирующих вариантов, мы стремимся продемонстрировать эффекты атомных замещений в вариантах GFP.

Protocol

1. Введение экспрессии плазмид в компетентные проауксотрофные клетки E. coli Смешайте 1 нг каждого образца плазмиды, pQE-80L H6-EGFP, pQE-80L H 6-NowGFP и pQE-80L H6-KillerOrange, с 50 мкл химически компетентных или электрокомпетентных клеток про-ауксотрофной E. coli K12-производной штамма JM83 (Addgene #50348, или ATCC #35607) для трансформации методом теплового шока или электропорации в соответствии с доступными протоколами 46, 47.ПРИМЕЧАНИЕ: Вектор экспрессии pQE-80L EGFP-H6 кодирует C-терминально 6xHis-помеченный улучшенный зеленый флуоресцентный белок (EGFP), векторы экспрессии pQE-80L H 6-NowGFP и pQE-80L H6-KillerOrange кодируют N-терминально 6xHis-помеченный NowGFP48 или N-терминально 6xHis-помеченный KillerOrange49, соответственно, каждый в плазмидной основе pQE-80L. Все гены-мишени находятся под контролем бактериального промотора Т5, регулируемого оператором LAC. Резистентность к ампициллину использовалась в качестве маркера отбора, а colE1 — в качестве источника репликации. Смотрите Таблицу материалов для получения дополнительной информации о плазмиде pQE-80L. Альтернативная проауксотрофная Кишечная палочка, происходящая из штаммов К-12 и В, также может быть использована для экспрессии и должна давать аналогичные результаты. Расчетная молекулярная массаH6-помеченных одиночно протонированных ([M+H]+) белков дикого типа (после созревания хромофора) составляет 27 745,33 Da (EGFP-H6), 27 931,50 Da (H 6-NowGFP) и 27 606,09 Da (H6-KillerOrange). Первичные структуры белков-мишеней приведены в таблице 1 (His-tag подчеркнут). Глютамин (Q) в последовательности His-tag NowGFP был идентифицирован путем секвенирования ДНК после субклонирования кДНК NowGFP, полученной от Pletnev et al.51, в плазмиду pQE-80L. Он не препятствует очистке белка или свойствам флуоресцентного белка. Восстанавливают клетки в 950 мкл SOC среды при 37 °C в течение 1 ч. Распределите 50 мкл восстановленных клеток на средние пластины Luria Agar (LA) (см. Дополнительный материал), содержащие глюкозу (10 г / л) и ампициллин (100 мкг / мл). Инкубируйте пластины среды LA при 37 °C в течение ночи или 30 °C в течение 24 ч. 2. Производство рекомбинантных флуоресцентных белков дикого типа (содержащих канонический пролин) и процедура селективного включения давления (SPI) для получения флуоресцентных белков с аналогами пролина (S-Flp, R-Flp, Dfp, Dhp) Ночная культура проауксотрофного штамма JM83, полученного из проауксотрофной кишечной палочки K12, содержащего pQE-80L EGFP-H6, pQE-80L H 6-NowGFP и pQE-80L H 6-KillerOrange Используйте стерильный наконечник пипетки или петлю прививки, чтобы выбрать одну колонию из пластины среды LA и повторно суспендировать клетки в 5 мл среды лизогенного бульона (LB) (см. Дополнительный материал; содержащий 10 г / л глюкозы, 100 мкг / мл ампициллина) в стерильной 14 мл полистирольной культуральной трубке.ПРИМЕЧАНИЕ: Свежетрансформированные колонии рекомендуются для прививки. Ячейки на пластинах среды LA (начиная со стадии 2.2.), хранящиеся при 4 °C, следует использовать в течение нескольких дней. Вырастите культуру клеток в течение ночи при 37 °C в орбитальном шейкере при 200-250 об/мин. Производство рекомбинантного EGFP-H6, Н6-NowGFP и H6-KillerOrange с нативным пролином и соответствующими вариантами белка с аналогами пролинаИнокулируют 200 мл свежей среды НММ (7,5 мМ (NH4)2SO4, 50 мМ K2HPO4 и 22 мМ KH2PO4, 8,5 мМ NaCl, 1 мМ MgSO4, 20 мМ D-глюкозы, 1 мкг/мл FeCl2, 1 мкг/мл CaCl2, 10 мкг/мл тиамина, 10 мкг/мл биотина, 0,01 мкг/мл микроэлементов (CuSO4, ZnCl2, MnCl2, (NH4)2MoO4), pH ~7,2) со всеми каноническими l-аминокислотами (50 мг/л); см. Дополнительный материал), дополненный 100 мкг/мл ампициллина с 2 мл ночной культуры в 2-литровой колбе Эрленмейера.ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от типа белка, альтернативные питательные среды, такие как MOPS medium52, глюкозно-минеральные соли среда53, минимальная среда Дэвиса54, M9 минимальная среда55 или GMML56 , могут быть протестированы для оптимизации выхода белка. Инкубируйте клетки при 37 °C в орбитальном шейкере при 220 об/мин в течение ~3 ч 30 мин. Измеряйте оптическую плотность при 600 нм (OD600) в спектрофотометре каждые 30 минут, пока не будет достигнуто значение OD600 ~ 0,7.ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения OD600 в спектрофотометре длина пути кюветы должна составлять 1 см. Соответствующая среда культивирования используется для эталонного («нулевого») измерения. Время инкубации до достижения значения OD600 ~ 0,7 может зависеть от объема культуры. 3 ч 30 мин – приблизительное значение. В вариации подэтапов протокола 2.2.1-2.2.3 культура из подстаги 2.1.2. используется для посева свежей среды NMMΔPro (см. Дополнительный материал), дополненной ограниченной концентрацией пролина (например, 5 мг/л вместо 50 мг/л), и клетки выращивают в течение ночи при 37 °C в орбитальном шейкере при 220 об/мин. На следующий день определение OD600 выполняется каждые 30 мин до тех пор, пока разница между измерениями не составит менее 0,05. Максимальное значение OD600 должно быть около 1 (± 0,3). Начальная, ограниченная концентрация пролина может быть скорректирована в зависимости от экспрессии штамма и среды культивирования (см. Обсуждение). Открутите клеточную суспензию в течение 10 мин при 3 000 х г и 4 °C. Осторожно декантируйте супернатант в отходы. Стадия промывки: Повторное суспендирование клеток в 50 мл ледяной среды NMMΔAA (без аминокислот, см. Дополнительный материал) или NMMΔPro (без пролина, см. Дополнительный материал) путем тщательного пипетирования.ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой стадии промывки может быть использован любой из двух указанных буферов, поскольку важно только избавиться от остаточного пролина в инкубационной среде. Отделяют клетки от среды путем осаждения при 4 °C в центрифуге при 3000 х г в течение 10 мин. Осторожно декантируйте супернатант в отходы. Аккуратно пипетку вверх и вниз, чтобы повторно суспендировать клеточную гранулу в 200 мл среды NMMΔPro, дополненной 100 мкг/мл ампициллина в 2-литровую колбу Эрленмейера.ПРИМЕЧАНИЕ: Полученную клеточную суспензию можно разделить на несколько образцов одинакового объема для получения идентичных стартовых культур для сравнения экспрессии белка в присутствии аналогов Pro или пролина (например, разделение на 4 х 50 мл в колбах Эрленмейера по 100 мл). Инкубировать в течение 30 мин при 37 °C в орбитальном шейкере при 220 об/мин для полного истощения Pro.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение для полного истощения Pro из клеток. Добавьте соответствующий объем L-пролина или R-Flp, S-Flp, Dfp и Dhp из исходного раствора 50 мМ для регулировки конечной концентрации 1 мМ в клеточной суспензии.ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, перед использованием всегда следует готовить свежие 50 мМ стоковые растворы производных Pro или пролина. Только если гидролиз конкретной канонической или неканонической аминокислоты в водном растворе не является проблемой, могут быть использованы и замороженные запасы. Добавьте 0,5 мМ IPTG из стокового раствора 1 М, чтобы индуцировать экспрессию целевого белка. Экспрессируйте целевой белок в течение ночи (12 ч) при 37 °C в орбитальном шейкере при 220 об/мин. Измерьте OD600 на следующий день.ПРИМЕЧАНИЕ: Определение OD600 проводится для количественной оценки количества клеток после экспрессии белка. Более низкое значение OD600 по сравнению со значением, измеренным до этапа промывки 2.2.3, указывает на цитотоксичность подаваемой аминокислоты. В этом случае процедуру следует повторить с минимальной концентрацией подаваемой аминокислоты (до 0,1 мМ). Центрифугируйте и соберите бактериальные клетки при 5000 х г и 4 °C в течение 10 мин и декантируйте супернатант в отходы. Этап промывки: Повторное суспендирование клеток путем тщательного пипетирования в 50 мл связывающего буфера (50 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 1 мМ DTT), содержащего 10% глицерина, и перенос суспензии ячейки в коническую полистирольную трубку объемом 50 мл. Центрифугируйте и соберите бактериальные клетки при 5000 х г и 4 °C в течение 10 мин и декантируйте супернатант в отходы. Храните ячейку гранулы в конической полистирольной трубке объемом 50 мл при -20 °C или -80 °C до дальнейшего использования (очистка белка, см. Ниже). 3. Процедура очистки белковых образцов методом иммобилизованной аффинной хроматографии ионов металлов (IMAC) Бактериальный лизис клетокПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все этапы лизиса клеток на льду или при 4 °C, чтобы предотвратить деградацию белка-мишени. Разморозьте гранулу бактериальной клетки на льду или при 4 °C в конической полистирольной трубке объемом 50 мл в течение 10-20 мин. Добавьте 10 мл ледяного связывающего буфера (см. Дополнительный материал) и осторожно пипетку вверх и вниз, чтобы повторно суспендировать гранулу ячейки. Добавьте 100 мкл лизоцима 50 мг/мл, 100 мкл 1 мг/мл ДНКазы I, 100 мкл 1 мг/мл РНКазы А, 30 мкл 1 ММгCl2. Осторожно переверните клеточную суспензию пять раз и держите закрытую трубку на льду или при 4 °C в течение 60 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: Лизоцим индуцирует химический лизис клеток, разрушая бактериальную клеточную стенку. Обработайте образец ультразвуком для разрушения клеток с помощью ультразвукового гомогенизатора (например, 3 раза в течение 3 мин в полистирольной трубке объемом 50 мл на смеси льда и воды, импульс 2 с/пауза 4 с, амплитуда 45%).ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно могут быть использованы другие методы разрушения клеток, например, гомогенизация под высоким давлением в 20 циклов при 14 000 фунтов на квадратный дюйм. При необходимости разбавляют с помощью связующего буфера (см. Дополнительный материал) для достижения минимального объема инструмента. Кроме того, реагенты для экстракции белка могут быть использованы для разрушения клеток. Примеры см. в Таблице материалов . Центрифуга в течение 60 мин при 18 000 х г, 4 °C. Запишите объем жидкости для подшага 3.1.9. и вылейте супернатант в свежую полистирольную трубку объемом 50 мл. Очистите супернатант с помощью мембранного фильтра с диаметром пор 0,45 мкм. Возьмем образец «лизата» для SDS-PAGE (см. раздел 4. ниже); это соответствует «растворимой белковой фракции», супернатанту из подстадии 3.1.6. Добавить равный объем ddH2O, определенный на подэтапе 3.1.6. повторное суспендирование клеточного мусора для поддержания того же разбавления образцов для последующего анализа SDS-PAGE. Возьмем образец «гранулы» для SDS-PAGE (см. раздел 4 ниже); это соответствует «нерастворимой белковой фракции», суспензии клеточного мусора с подстадии 3.1.9. Очистка иммобилизованных металлов аффинной хроматографией (IMAC)ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка целевого флуоресцентного белка может быть выполнена при 4 °C или при комнатной температуре (RT). Для последнего варианта подождите, пока лизат, колонна и все буферы уравновесятся на RT, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха из-за испарения воздуха, захваченного в холодном растворе при размещении в теплой колонне. Очистите образец с помощью предварительно упакованной или самостоятельно упакованной колонки IMAC FPLC (быстрая белковая [или производительность] жидкостной хроматографии) в соответствии с инструкциями производителя; установить максимальное давление в колонне 0,3 МПа, а расход 1 мл/мин; использовать буфер связывания (см. Дополнительный материал) для уравновешивания колонны, буфер промывки (см. Дополнительный материал) для стадии промывки и буфер элюирования (см. Дополнительный материал) для элюирования целевого белка.ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, автоматизированная система FPLC может быть применена для элюирования целевого белка с буфером элюирования, работающим линейным градиентом концентрации имидазола (20-200 мМ). Соберите и объедините элюированные фракции с флуоресцентными белками (выбирайте по видимому зеленому или оранжевому цвету). Переведите объединенные фракции в диализную мембрану (отсечение молекулярной массы (MWCO) 5000-10000) в соответствии с инструкциями производителя и диализуйте не менее трех раз против диализного буфера или буфера MS (см. Дополнительный материал). Например, выполняйте диализ образца 1 мл три раза против 100 мл буфера в течение не менее 2 ч каждый раунд. Подробный протокол см. в Budisa et al.34. Приготовьте 1:100-кратное разбавление диализированной элюирующей фракции в буфере PBS (см. Дополнительный материал). Запишите спектр поглощения разбавленных образцов в спектрофотометре UV-Vis. Рассчитать концентрацию белка на основе закона Ламберта-Бира следующим образом, используя литературные значения коэффициентов молярного вымирания ε на удельной длине волны (для EGFP при 488 нм ε488 = 55 000 см-1· M-1, NowGFP при 493 нм ε493 = 53 600 см-1· M-1, KillerOrange при 514 нм ε514 = 22 600 см-1· М-1): (Закон Ламберта-Бира)cбелок = концентрация белка [мг/мл]A = поглощение на определенной длине волныε = коэффициент молярного вымирания на удельной длине волны [М-1·см-1]d = длина пути кюветы, здесь 1 смMW = молекулярная масса белка [г/моль]Используйте диализный буфер (см. Дополнительный материал) для эталонного («нулевого») измерения. Возьмите образец «элюата» для SDS-PAGE (см. раздел 4 ниже), загрузите 1-10 мкг белка (рассчитанного в соответствии с предыдущим шагом) на образец скважины для гелей Coomassie Brilliant Blue.ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте количество образцов SDS в зависимости от применяемого метода окрашивания и чувствительности красителя, если для окрашивания белковой полосы используются соединения, отличные от Coomassie Brilliant Blue. Заморозьте и храните образец белка в диализном буфере (см. Дополнительный материал) при -80 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: При таком условии хранения образцы белка должны быть стабильными в течение не менее 6 месяцев. Альтернативные лабораторные UV-Vis и флуоресцентные спектрофотометры могут быть использованы для регистрации спектров поглощения и флуоресцентного излучения белков-мишеней. Для измерений флуоресцентного излучения могут применяться следующие длины волн возбуждения: 488 нм (EGFP), 493 нм (NowGFP) и 510 нм (KillerOrange). 4. Подготовка образцов SDS-PAGE Определение абсорбции А при 280 нм (А280 нм) для образцов “элюат”, “лизат” и “гранула” из раздела 3. Отрегулируйте объем зонда для достижения A280 нм = 2, добавив соответствующее количество буфера элюирования (конечный объем зонда должен быть не менее 80 мкл). Смешайте образец в соотношении 4:1 (v/v) с 5-кратным буфером красителя SDS (см. Дополнительный материал) путем пипетирования, например, 80 мкл образца с 20 мкл 5x SDS нагрузочного буфера. Кипятите образцы SDS при 95 °C в течение 5 минут на водяной бане или тепловом блоке для денатурации белков. Дайте образцам остыть до RT и раскрутите зонды при 13 000 х г в течение 1 мин в микроцентрифуге перед загрузкой на гель. Используйте 5-10 мкл для Coomassie Brilliant Blue-stained SDS-PAGE. Для получения подробной информации о процедуре SDS-PAGE обратитесь кразделу 57.ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте количество образцов SDS в зависимости от применяемого метода окрашивания и чувствительности красителя. Результат SDS-PAGE должен быть тщательно проверен, чтобы убедиться, что образцы содержат более 95% общего белка в полосе, соответствующей ожидаемой молекулярной массе желаемого белка. Для этого сделайте фотографию геля, окрашенного Кумасси, и сравните интенсивность белковой полосы желаемой молекулярной массы с интенсивностью всех других полос в полосе (если таковые имеются) с помощью денситометрии. Для денситометрической оценки интенсивности полосы может быть использовано программное обеспечение ImageJ58. Чтобы экспериментально доказать включение желаемых ncAA в интересующий белок, анализ массы интактного белка с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в сочетании с масс-спектрометрией времени пролета с электрораспылительной ионизацией (LC-ESI-TOF-MS) следует проводить, как описано59 (см. раздел протокола 5 и Таблицу материалов в нем для примерного оборудования). 5. Флуоресцентная эмиссия белковых вариантов Перед процедурой проверьте результат эксперимента SDS-PAGE, чтобы убедиться, что чистота образца составляет >95% (см. ПРИМЕЧАНИЕ после шага 4.5). Отрегулируйте образцы каждого очищенного варианта белка до концентрации 0,3 мкМ, взяв в качестве эталона рассчитанное значение поглощения на соответствующей длине волны (подшаг 3.2.5.). Убедитесь, что приблизительный конечный объем образца составляет 200 мкл. Пусть разбавленные образцы уравновешиваются в течение 1 ч при РТ. Перенесите образцы в 1-сантиметровую кварцевую кювету и измерьте спектр флуоресцентного излучения образцов с помощью флуоресцентного спектрометра (см. Таблицу материалов), применяя следующие длины волн возбуждения: 488 нм (для EGFP), 493 нм (для NowGFP), 510 нм (для KillerOrange). 6. Денатурация и переворачивание вариантов EGFP Перед процедурой проверьте результат эксперимента SDS-PAGE, чтобы убедиться, что чистота образца составляет >95% (см. ПРИМЕЧАНИЕ после шага 4.5). Подготовьте для каждого очищенного варианта белка два образца конечного объема 2 мкл в концентрации 300 мкМ (см. определение концентрации белка на подшагах 3.2.4-3.2.6). Добавьте 18 мкл буфера PBS 1,11x (см. Дополнительный материал), содержащего 8,89 М мочевины и 5,56 мМ DTT, к 2 мкл каждого очищенного варианта белка (для получения 1x PBS, содержащего 8 М мочевины и 5 мМ DTT), чтобы вызвать денатурацию.ПРИМЕЧАНИЕ: На этапах 6.4-6.6 обработать каждый образец отдельно. Инкубируйте образцы в течение 5 мин при 95 °C. Разбавьте образцы 20 мкл в 100 раз, добавив 1980 мкл 1x PBS (см. Дополнительный материал), содержащий 5 мМ DTT, чтобы индуцировать ренатурацию, давая конечную концентрацию белка 0,3 мкМ, и немедленно перенесите 200 мкл образцов в 1-сантиметровую кварцевую кювету.ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь очень важно работать быстро, так как ренатурация начинается немедленно. Вставьте кварцевую кювету в соответствующий флуоресцентный спектрометр (см. Таблицу материалов) и контролируйте повторное сворачивание белка в образцах, приобретая спектр флуоресценции каждые 3 с в течение 30 мин. Для каждого варианта белка используют возбуждение флуоресценции 295 нм для первого образца и возбуждение флуоресценции 488 нм для второго. Перенесите повторно складывающиеся образцы в микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл, закройте крышку и храните образцы на RT в темноте в течение 24 ч, чтобы обеспечить полное повторное складывание вариантов EGFP. Измерьте флуоресцентное излучение восстановленных образцов белка в соответствии со стадией 6.6, используя ту же длину волны возбуждения, что и раньше, чтобы захватить временную конечную точку восстановления флуоресценции.

Representative Results

В начале исследования мы выбрали три различных варианта флуоресцентного белка, разделяющих родительскую архитектуру GFP. Первым выбранным белком был EGFP, который является инженерным вариантом, полученным из оригинального GFP от медузы Aequorea victoria, содержащей мутации Phe64Leu / Ser65Thr. Вторым выбранным белком был NowGFP51,60. Это также вариант A. victoria GFP, полученный путем мутагенеза в несколько этапов через предшествующие флуоресцентные белки. NowGFP содержит 18 мутаций по сравнению со своим непосредственным предшественником флуоресцентным белком «Cerulean»61. В свою очередь, белок «Cerulean» является производным усиленного голубого флуоресцентного белка (ECFP)62,63, белка, ранее выбранного направленной лабораторной эволюцией и содержащего хромофор на основе триптофана. Как EGFP, так и NowGFP широко используются в клеточной биологии и биофизических исследованиях, и они содержат десять законсервированных остатков пролина в своих структурах. Кроме того, NowGFP имеет одиннадцатый пролиновый остаток в позиции 230, который появился из-за обширной истории мутаций этого варианта белка. Третьим выбранным белком был флуоресцентный белок KillerOrange64,65. Является производным хромопротеина anm2CP из гидрозоанского рода Anthoathecata. Белковая последовательность содержит 15 остатков пролина, а хромофор основан на триптофане, а не на остатке тирозина. Сообщалось о рентгеновских структурах высокого разрешения для всех трех выбранных белков (рисунок 2)51,65,66. На первом этапе аналоги пролина (рисунок 1D) были включены во все пролиновые позиции трех модельных белков (EGFP, NowGFP и KillerOrange) путем селективного включения давления (SPI, схема процедуры приведена на рисунке 3). Инструментально пролин-ауксотрофный штамм E. coli K12 JM8367 использовали для экспрессии белков в присутствии пролина и аналогов (рисунок 1D), получая белки дикого типа и модифицированные белки соответственно. Гранулы из клеток, экспрессирующих нативный белок, и вариантов, несущих S-Flp и Dhp, имели типичный яркий цвет из-за интактного хромофора, тогда как варианты, содержащие R-Flp и Dfp, оставались бесцветными, что указывало на неправильное сворачивание и осаждение развернутого белка в телах включения (рисунок 4A). Анализ экспрессированных образцов SDS-PAGE подтвердил наличие нерастворимых R-Flp-содержащих белков (рисунок 4B-D), что исключило дальнейшие исследования. Хотя это выходит за рамки настоящего исследования, следует отметить, что проблемы растворимости и неправильного сворачивания белка могут быть в некоторой степени облегчены процедурами рефолдирования in vitro 68. Напротив, нативные белки, а также S-Flp- и Dhp-содержащие варианты были обнаружены в основном в растворимых фракциях (рисунок 4B-D). Дикий тип, а также S-Flp- и Dhp-содержащие варианты могут быть дополнительно выделены и охарактеризованы в исследованиях флуоресценции. Растворимые белки очищали с помощью иммобилизованной аффинной хроматографии ионов металлов (IMAC), получая 20-30 мг/л культурального объема для EGFP, 60-80 мг для NowGFP и KillerOrange, чьи выходы для белков дикого типа и модифицированных белков были очень похожи. Жидкостная хроматография-масс-спектрометрический (LC-MS)-связанный анализ подтвердил ожидаемую идентичность и чистоту изолятов, полученных таким образом (рисунок 5). В масс-спектрах каждая замена пролина S-Flp производила сдвиг +18 Da на каждый остаток пролина в последовательности, в то время как для замены пролина на Dhp сдвиг составлял −2 Da на остаток. На следующем этапе были зарегистрированы спектры поглощения света и излучения для анализа потенциальных эффектов включения неканонических аналогов пролина на спектроскопические свойства родительских флуоресцентных белков (рисунок 6). Спектры поглощения UV-Vis показали типичную полосу около 280 нм, характерную для ароматических остатков, тирозина и триптофана, в то время как абсорбция хромофора была обнаружена при 488 нм для EGFP и 493 нм для NowGFP (рисунок 6A, B). В KillerOrange область поглощения хромофора состояла из двух полос (рисунок 6C), которые соответствуют двум возможным конфигурационным и зарядовым состояниям комплексного хромофора. Полоса около 510 нм известна как состояние, из которого происходит флуоресценция с высоким квантовым выходом49,65. В вариантах замены пролина наблюдалось следующее: включение Dhp не изменяло спектры поглощения EGFP и NowGFP, в то время как S-Flp производил усиленное поглощение УФ-излучения. Последнее может быть объяснено индуцированными различиями в микросредах остатка триптофана, в частности Trp57, зажатых между тремя S-Flp в мотиве PVPWP (рисунок 6A,B)69. Однако более тривиальное объяснение более высокого поглощения УФ-излучения может быть связано с увеличением доли неправильно свернутого белка. Поскольку концентрация белка оценивалась путем количественной оценки особенностей абсорбции, наличие белка с неправильно зрелым хромофором может увеличить абсорбцию, при этом эта фракция не учитывается в общей концентрации (рис. 6А,В). Подтверждая эту гипотезу, мы заметили, что S-Flp-содержащий EGFP демонстрирует заметно сниженное соотношение хромофора по сравнению с комбинированным поглощением триптофана и тирозина (ε(CRO)/ε(Tyr+Trp) = 0,96) по сравнению с более высоким значением (1,57) в родительском белке (таблица 2)70. Наличие нефлуоресцентной фракции в S-Flp-содержащем EGFP будет важным фактором, способствующим дальнейшему анализу свойств белка. В варианте KillerOrange, содержащем S-Flp, наблюдалось усиленное поглощение наряду с красным смещением в полосе хромофоров. Этот факт указывал на то, что образование хромофора благоприятствовало конфигурации с большим квантовым выходом флуоресценции (рисунок 6C). Впоследствии мы проанализировали спектры флуоресценции белков, регистрируемых при возбуждении на соответствующих максимальных длинах волн поглощения. Результаты показывают, что спектры оставались по существу идентичными для исследованных флуоресцентных вариантов белка, несущих пролин и заменители, S-Flp и Dhp. Этот результат подразумевает, что аналоги ни в коем случае не изменяли химическую среду хромофора (рисунок 6G-I). Несмотря на этот факт, заметные различия были замечены в спектрах флуоресценции KillerOrange, регистрируемых при возбуждении при 295 нм, следовательно, при возбуждении триптофана. Этот эксперимент отслеживает флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) или прямую экситонную связь, которая происходит между боковыми цепями триптофана и зрелым хромофором, поскольку оба расположены на небольшом расстоянии не более 25 Å. Для вариантов EGFP и NowGFP, когда спектры излучения измерялись с использованием возбуждения 295 нм, наблюдалось сильное излучение хромофора наряду с практически никаким излучением триптофана (рисунок 6D, E). Однако варианты, содержащие S-Flp, демонстрировали несколько большее триптофан-специфическое излучение. Это наблюдение может быть связано с неисчислимым вкладом развернутого апопротеина, который содержит триптофаны, но не зрелый хромофор. Существенно повышенное триптофан-специфическое излучение наблюдалось в KillerOrange, что указывает на отсутствие флуоресцентного гашения через ожидаемый механизм передачи энергии возбуждения или экситонной связи. Варианты белка, содержащие пролин и S-Flp, продемонстрировали сопоставимое излучение триптофана наряду с предпочтительной функцией флуоресценции с красным смещением высокого квантового выхода. Напротив, вариант, который содержал Dhp, показал резкое снижение интенсивности флуоресценции хромофора, предположительно из-за незначительных структурных эффектов (рисунок 6F). Затем мы сравнили складчатые свойства белков, выполнив эксперимент по разворачиванию/ренатурации. Спектры флуоресцентного излучения регистрировались в сложенном состоянии (раздел 5 протокола), после химической денатурации и, впоследствии, в процессе повторного сворачивания, контролируемого в течение 24 ч (раздел 6 протокола). Спектры регистрировались при возбуждении на обеих соответствующих длинах волн, 295 нм, и на максимумах спектров поглощения хромофоров, в то время как результирующая флуоресценция представлена как нормализованная до максимального значения для каждого белка (рисунок 7). В конце протокола мы заметили, что варианты EGFP могут переворачиваться, в то время как варианты NowGFP и KillerOrange – после денатурирования – остаются развернутыми (данные не показаны). Таким образом, рефолдирующие способности исходных флуоресцентных белков существенно варьировались. Следует отметить, что KillerOrange был разработан в качестве фотосенсибилизатора, начиная с варианта гидрозоанового хромопротеина KillerRed65,71, и его переворачивание обычно отстает, несмотря на прочную структуру β ствола. В наших экспериментах мы обнаружили, что флуоресценция хромофора EGFP дикого типа восстанавливается только частично, хотя триптофан-специфическая флуоресценция была больше после ренатурации (рисунок 7A, D). По существу аналогичное поведение наблюдалось в варианте, содержащем Dhp (рисунок 7C,F). У S-Flp-содержащих EGFP аналогичный результат наблюдался, когда возбуждение выполнялось на триптофан-специфической длине волны 295 нм (рисунок 7B). Поразительно, что флуоресценция восстановилась в гораздо большей степени, когда хромофор возбуждался при 488 нм (рисунок 7E). Похоже, что S-Flp вызывает гораздо лучший выход переворачивания по сравнению с двумя другими вариантами. Однако этого благотворного эффекта не наблюдалось при использовании возбуждения 295 нм из-за неизвестных молекулярных взаимодействий. Впоследствии скорость рефолдирования контролировали путем регистрации флуоресценции как триптофана, так и хромофора, отдельно, при этом конечную точку процесса определяли через 24 ч после начала ренатурации. Только варианты EGFP показали относительно быструю кинетику повторного складывания, которая может быть надежно оценена, в то время как ни один из денатурированных вариантов NowGFP и KillerOrange не смог восстановиться до значения, которое позволило бы проводить дальнейшие количественные измерения. В EGFP извлечение выбросов триптофана было в два раза быстрее (завершено за 750 с) по сравнению с восстановлением излучения хромофора (завершено за 1 500 с), что указывает на сложность основных процессов (рисунок 8). На обеих длинах волн возбуждения скорость сворачивания была повышена присутствием S-Flp, в соответствии с литературными данными25. В то же время dhp-содержащий вариант показал профиль перефолдирования, похожий на дикий тип. Рисунок 1: Структурный каркас зеленого флуоресцентного белка (GFP), построение хромофора, конформационные переходы пролина и синтетические аналоги, используемые в этом исследовании. (A) Структура GFP состоит из β нитей, образующих почти идеальный ствол (т.е. “банку” с размерами 4,2 нм x 2,4 нм), которая ограничена с обоих концов α спиральными крышками. Белок GFP 27 кДа показывает третичную структуру, состоящую из одиннадцати β-нитей, двух коротких α-спиралей и хромофора посередине. Конформационные состояния соседних пролинов связаны с образованием хромофоров. (B) Автокаталитическое созревание (конденсация) хромофора происходит в остатках Ser65, Tyr66 и Gly67 и происходит в несколько этапов: во-первых, корректировка кручения в полипептидной основе для приведения карбоксильного углерода Thr65 в близость к амидному азоту Gly67. Затем происходит образование гетероциклической кольцевой системы имидазолин-5-один при нуклеофильной атаке на этот атом углерода амидным азотом глицина и последующем обезвоживании. Наконец, система приобретает видимую флуоресценцию, когда окисление тирозиновой альфа-бета-углеродной связи молекулярным кислородом приводит к расширению сопряженной системы имидазолиновой кольцевой системы, на конце включающей тирозинфенильное кольцо и его паракислородный заместитель. Полученный парагидроксибензилиден имидазолинон хромофор в центре β ствола полностью отделяется от объемного растворителя. (C) Формулы скелетной структуры и геометрии 1) пролинового кольца (шайбы) и 2) предшествующей амидной связи представляют собой основные конформационные переходы пролинового остатка. (D) Пролиновые аналоги, используемые в этой работе с обозначенными пролиновыми кольцевыми шайбами. Рисунок был сгенерирован с помощью ChemDraw и Discovery Studio Visualizer. Структура GFP взята из записи структуры PDB 2Q6P. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: Флуоресцентные белки, используемые в этом исследовании. Панели показывают ленточное представление типичных β-бочковых структур трех различных вариантов флуоресцентных белков: EGFP, NowGFP и KillerOrange, с цветом ленты, представляющим цвет флуоресцентного излучения каждого варианта. Остатки пролина (однобуквенный код) подсвечиваются в виде палочек, а соответствующие позиции аннотируются. Хромофоры выделены жирным шрифтом с исходным аминокислотным составом. Все структурные представления были созданы с помощью PyMol на основе следующих записей структуры PDB: 2Q6P для EGFP, 4RYS для NowGFP, 4ZFS для KillerOrange. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Отображение блок-схемы метода SPI для включения неканонических пролиновых аналогов. Пролин-ауксотрофный штамм-хозяин Escherichia coli (E. coli), несущий интересующий ген экспрессии плазмиды, выращивают в определенной минимальной среде со всеми 20 каноническими аминокислотами до тех пор, пока не будет достигнут OD600 ~ 0,7, при котором клеточная культура находится в среднелогарифмической фазе роста. Клетки собирают и переносят в свежую минимальную среду, содержащую 19 канонических аминокислот и аналог пролина. После добавления индуктора экспрессия белка осуществляется на ночь. Наконец, белок-мишень выделяют путем лизиса клеток и очищают перед дальнейшим анализом. В вариации протокола клетки выращивают в определенной минимальной среде с 19 каноническими аминокислотами, а пролин добавляют в ограниченном количестве (например, одна пятая концентрации других аминокислот). По этой мере клетки выхватывают пролин в среде до того, как смогут выйти из логарифмической фазы роста, а затем, впоследствии, добавляется аналог, и индуцируется интересующий белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: Анализ выражений вариантов EGFP, NowGFP и KillerOrange. (A) Клеточные гранулы из 1 мл экспрессионной культуры, нормализованные до OD600 = 2. SDS-PAGE анализ вариантов (B) EGFP, (C) NowGFP и (D) KillerOrange. Растворимые (S) и нерастворимые фракции (I) каждого флуоресцентного белкового деривата загружали на 15% акриламидный гель, а также элюированные фракции (E) из IMAC растворимых белков. PageRuler Unstained Protein Ladder использовался в качестве маркера (M) в полосах, обозначаемых (M). Обрамляются ожидаемые области конкретного белка. Инкорпорированными аминокислотами в пролиновых позициях являются Pro, R-Flp, S-Flp и Dhp (показаны гранулы (A) клеток из вариантов флуоресцентного белка, включающие Dfp вместо Dhp). Гели окрашивали на 1% (мас./об.) Coomassie Brillant Blue. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5: Масс-спектрометрический анализ вариантов флуоресцентных белков. (A) Репрезентативные деконволютированные спектры ESI-MS H 6-меченых EGFP (черный), S-Flp-EGFP (оранжевый) и Dhp-EGFP (голубой) с расположением пиков основной массы, указанных в виде чисел (в Da). Рассчитанные молекулярные массы [M+H]+ белков, помеченных H6, составляют: для EGFP 27 745,33 Da (наблюдается 27 746,15 Da); для S-Flp-EGFP 27 925,33 Да (наблюдается 27 925,73 Да); для Dhp-EGFP 27 725,33 Da (наблюдается 27 726,01 Da). (B) Репрезентативные деконволютированные спектры ESI-MS H 6-меченых NowGFP (черный), S-Flp-NowGFP (оранжевый) и Dhp-NowGFP (голубой) с расположением пиков основной массы, указанных в виде чисел (в Da). Расчетные массыH6-меченых белков составляют: для NowGFP 27 931,50 Da (наблюдается 27 946,46 Da; разница ~ 16 Da, вероятно, связана с окислением метионина в белке); для S-Flp-NowGFP 28 129,50 Да (наблюдается 28 130,08 Да); для Dhp-NowGFP 27 909,50 Da (наблюдается 27 910,22 Da). (C) Репрезентативные деконволютированные спектры ESI-MS H 6-меченого KillerOrange (черный), S-Flp-KillerOrange (оранжевый) и Dhp-KillerOrange (голубой) с расположением пиков основной массы, указанных в виде чисел (в Da). Расчетные массы белков, помеченных H6, составляют: для KillerOrange 27 606,09 Da (наблюдается 27 605,91 Da); для S-Flp-KillerOrange 27 876,09 Da (наблюдается 27 876,08 Da); для Dhp-KillerOrange 27 576,09 Da (наблюдается 27 575,93 Da). Отклонения между наблюдаемыми и рассчитанными молекулярными массами около 1 Да находятся в пределах диапазона погрешностей оборудования ESI-MS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 6: Спектры поглощения света и флуоресцентного излучения флуоресцентных вариантов белка. Нормализованные спектры поглощения UV-Vis показаны для вариантов (A) EGFP, (B) NowGFP и (C) KillerOrange. Спектры нормализовали до максимальной абсорбции хромофора (около 500 нм). Нормализованные спектры флуоресцентного излучения показаны вариантами (D,G) EGFP, (E,H) NowGFP и (F,I) KillerOrange. Спектры в (D,E,F) измеряли при возбуждении ультрафиолетовым светом (295 нм), для спектров в (G,H,I) для возбуждения использовали 488 нм, 493 нм и 510 нм для возбуждения соответственно, а спектры нормализовали до соответствующих максимумов излучения хромофора (около 500 нм). В каждой панели черные кривые соответствуют спектрам варианта флуоресцентного белка с нативным пролином, оранжевые кривые указывают на спектры S-Flp-замещенных белков, а синие кривые соответствуют dhp-замещенным белкам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 7: Спектры флуоресцентной эмиссии вариантов EGFP в экспериментах по рефолдированию. Нормализованные спектры флуоресцентного излучения 0,3 мкМ растворов флуоресцентных вариантов белков в нативном состоянии и после денатурации и перефолдирования: Спектры в (A,B,C) измеряли при возбуждении ультрафиолетовым светом (295 нм ) (A) для EGFP, (B) для S-Flp-EGFP и (C) для Dhp-EGFP. Спектры в (D,E,F) измеряли при возбуждении зеленым светом (488 нм) (D) для EFGP, (E) для S-Flp-EGFP и (F) для Dhp-EGFP. Спектры излучения нативных (черные кривые) и пересложенных образцов (зеленый соответствует EGFP, оранжевый — S-Flp-EGFP и синий — Dhp-EGFP соответственно) каждого варианта белка нормализуются до максимальной флуоресценции соответствующего нативного состояния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 8: Мониторинг сворачивания белка и созревания хромофоров вариантов EGFP с флуоресценцией. (A) Флуоресцентное излучение в области флуоресценции Trp (излучение установлено на 330 нм), регистрируемое при возбуждении ультрафиолетовым светом (295 нм). (B) Развитие амплитуды флуоресценции в области излучения хромофора при возбуждении зеленым светом (488 нм). Зависимые от времени следы флуоресценции нормализовали до единицы (100%) в соответствии с амплитудой флуоресценции, достигнутой в конце интервала мониторинга. В каждой панели черные кривые соответствуют спектрам варианта флуоресцентного белка с нативным пролином, оранжевые кривые указывают на спектры S-Flp-замещенных белков, а синие кривые соответствуют dhp-замещенным белкам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Строить Аминокислотные последовательности (6xHis тег подчеркнут): ЭГФП-Н6 MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNSHNVYIMADKKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKHHHHHHHHHHHHHHHHHH H6-NowGFP MRGSHHQHHHHHGSVSKGLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGDATYGKMSLKFICTTGKLPVPWPTLKTTLTWGMQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGVDFKEDGNILGHKLEYNAISGNANITADKQKNGIKAYFTIRHDVEDGSVLLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKQSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGIPLGADELYK H6-КиллерОранж MRGSHHHHHHHHGSECGPALFQSDMTFKIFIDGEVNGQKFTIVADGSSKFPHGDFNVHAVCETGKLPMSWKPICHLIQWGEPFFARYPDGISHFAQECFPEGLSIDRTVRFENDGTMTSHHTYELSDTCVVSRITVNCDGFQPDGPIMRDQLVDILPSETHMFPHGPNAVRQLAFIGFTTADGGLMMGHLDSKMTFNGSRAIEIPGPHFVTIITKQMRDTSDKRDHVCQREVAHAHSVPRITSAIGSDQD Таблица 1: Первичные структуры белков-мишеней. Его теги подчеркнуты в каждой последовательности. λ [нм] ε [М-1·см-1] (ЭГФП) ε [M-1·cm-1] (S-Flp-EGFP) ε [M-1·см-1] (Dhp-EGFP) 488 (≡ CRO) 31 657 (± 1 341) 22 950 (± 290) 27 800 (± 542) 280 (≡ Tyr+Trp) 20 116 (± 172) 23 800 (± 715) 17 300 (± 554) Значения коэффициента вымирания ε (в М-1·см-1) рассчитываются на основе зарегистрированных спектров поглощения UV-Vis соответствующих вариантов EGFP с использованием известных концентраций белка. Выбранная длина волны при 280 нм соответствует максимальному поглощению ароматических остатков тирозина и триптофана, а 488 нм представляет собой длину волны поглощения хромофора. Таблица 2: Коэффициенты вымирания (ε) вариантов EGFP на выбранных длинах волн. Значения коэффициента вымирания ε (в М-1·см-1) рассчитываются на основе зарегистрированных спектров поглощения UV-Vis соответствующих вариантов EGFP с использованием известных концентраций белка. Выбранная длина волны 280 нм соответствует максимальному поглощению ароматических остатков, тирозина и триптофана, тогда как 488 нм представляет собой максимальную длину волны поглощения хромофора. Дополнительный материал: Подготовка стоковых растворов и буферов Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

В природе манипуляции с белковыми структурами и функциями обычно происходят из-за мутаций, явления, которое приводит к обмену аминокислотной идентичностью в определенных положениях в последовательности белка. Этот природный механизм широко применяется в качестве биотехнологического метода белковой инженерии в форме мутагенеза и опирается на репертуар 20 канонических аминокислот, участвующих в процессе. Однако обмен остатков пролина проблематичен. Из-за своей особой архитектуры магистральной группы он едва ли взаимозаменяем с оставшимися 19 остатками для замены72. Например, пролин обычно известен как разрушитель вторичной структуры в полипептидных последовательностях из-за его плохой совместимости с наиболее распространенными вторичными структурами, то есть α-спиралью и β-цепью. Эта функция пролина легко теряется, когда остаток мутирует в другую аминокислоту из общего репертуара. Замена пролина его химическими аналогами предлагает альтернативный подход, позволяющий сохранить основные системообразующие особенности родительского пролинового остатка при наложении смещения на его специфические конформационные переходы или получении модуляций молекулярного объема и полярности. Например, можно снабжать бактериальные культуры аналоговыми структурами, такими как гидрокси-, фтор-, алкил-, дегидропролины, структуры, имеющие переменные размеры колец и т.д., тем самым облегчая выработку белка, содержащего специфические изменения пролинового остатка.

Метод селективного включения давления (SPI), описанный в этом исследовании, позволяет осуществить глобальную, т.е. специфическую для остатка замену всех пролинов в целевом белке родственными химическими аналогами. О важности метода свидетельствует тот факт, что SPI позволяет создавать изменения последовательностей, недоступные для распространенных методов мутагенеза. Например, он позволяет производить целевой белок, содержащий довольно небольшие структурные изменения, которые обычно не могут превышать одного или двух замен/делеций/добавлений атомов, как показано в данном исследовании. Такие модификации белка называют «атомными мутациями»73,74. В флуоресцентном белке, таком как GFP, результат этого молекулярного вторжения можно увидеть в скорости сворачивания, локальных полярностях, белковой упаковке, стабильности вовлеченных структурных особенностей. Изменения абсорбционных и флуоресцентных свойств производятся косвенно за счет влияния на сворачивание белка и остаточные микросреды. Точность молекулярных изменений, выполняемых SPI, как правило, намного выше, по сравнению с мутациями пролинов к другим каноническим остаткам, причем последние, как правило, вредны для сворачивания, производства и выделения белка.

В качестве метода производства подход SPI использует субстратную толерантность кармана аминоацил-тРНК-синтетазы к химическим аналогам нативной аминокислоты. Синтетаза отвечает за правильную идентификацию аминокислотной структуры, в то время как включение в белки происходит вниз по течению в процессе трансляции. Инструментально, производство, выделение и очистка белка в SPI выполняются способом, типичным для любых других методов экспрессии рекомбинантного белка; однако с некоторыми дополнениями к протоколу следующим образом: Пролин, который должен быть заменен, предоставляется в начале процесса ферментации, так что клетки могут расти и развивать свой неповрежденный клеточный механизм. Однако клеточной культуре не дают достичь максимальной оптической плотности, чтобы удержать клетки в логарифмической фазе, оптимальной для экспрессии белка. На данный момент существует два основных варианта метода SPI. В первом концентрацию пролина корректируют в исходной питательной среде (химически определенной среде) таким образом, что истощение пролина происходит без какого-либо внешнего вторжения. Клетки выхлопывают пролин в среде до того, как смогут выйти из логарифмической фазы роста, а затем, впоследствии, добавляется аналог, и индуцируется интересующий белок. Во втором варианте способа клетки выращивают в среде, содержащей пролин, до середины их логарифмической фазы. В этот момент клетки следует вынуть и физически перенести в другую среду, которая уже не содержит пролина, только аналог, с последующей индукцией интересующего белка. В обоих вариантах аналог и реагент индукции белка обеспечиваются предварительно выращенным клеткам. Выделение и очистка белка дикого типа выполняются так же, как и для вариантов. В принципе, каждый доступный проауксотрофный штамм может быть использован в качестве экспресс-хоста. Тем не менее, рекомендуется проводить экспрессионные тесты для определения наиболее подходящего хоста. Кроме того, тесты различных химически определенных сред могут быть использованы для оптимизации выхода белка.

Существуют определенные требования в отношении химических аналогов, которые необходимо учитывать для SPI, такие как растворимость и концентрация. Метаболическая доступность и поглощение аминокислот зависят от количества растворенных молекул в среде. Для повышения растворимости того или иного соединения могут быть выбраны слабокислые или щелочные условия. Поскольку искусственные молекулы могут вызывать ингибирующие рост эффекты из-за их клеточной токсичности, концентрация должна быть снижена до минимума, чтобы избежать клеточного стресса75.

Незначительным недостатком SPI является снижение эффективности регистрации с большим количеством позиций, которые необходимо обменять. В принципе, снижение частоты аминокислот в целевой биомолекуле путем сайт-направленного мутагенеза может решить эту проблему. Однако структурные и функциональные свойства желаемого белка могут быть затронуты изменением первичной структуры.

Как упоминалось ранее, SPI позволяет специфическую для остатка замену канонической аминокислоты. Это означает, что неканонические аминокислоты вставляются в каждое положение канонической аминокислоты в целевом белке, включая консервированные остатки, которые необходимы для функции белка или сворачивания. Альтернативные методы инкорпорации на конкретном участке являются единственной возможностью преодолеть эту проблему3. В последние несколько десятилетий был разработан метод ортогональной пары, который может продуцировать белки, содержащие модифицированные остатки в заранее определенных местах. Наиболее распространенная модификация этого метода известна как подавление стоп-кодона. Этот метод основан на инженерной ортогональной системе трансляции, предназначенной для конкретного включения синтетических аминокислот76. Более 200 аминокислот с различными модификациями боковой цепи были включены в белки на сегодняшний день с использованием этого подхода77. Однако эти системы трансляции все еще не подходят для вставки аналогов пролина в белки-мишени. Кроме того, эффективность метода считается низкой в случае незначительных аминокислотных модификаций, поскольку некоторая фоновая распущенность аминоацил-тРНК-синтетазы обычно остается в инженерных системах трансляции.

Используя SPI, мы произвели ряд β-бочковых вариантов флуоресцентного белка и изучили результаты обмена пролина с его неестественными аналогами. В случае замены пролина R-Flp и Dfp дисфункциональный белок продуцировался экспресс-хозяином. Эффект, вероятно, вызван неправильным сворачиванием белка. Последний может происходить от конформацииC4-экзо, продвигаемой R-Flp, которая не благоприятствует родительским белковым структурам 27. При Dfp неправильное сворачивание, вероятно, будет вызвано уменьшением скорости изомеризации транс-цис-пептидной связи в пролиновом остатке27. Последний, как известно, является одной из ограничивающих стадий в кинетическом профиле сворачивания белка, который влияет на образование β и последующее созревание хромофора. Действительно, для обеих аминокислот, R-Flp и Dfp, производство белка привело к агрегированному и нерастворимому белку. Следовательно, образование хромофоров не могло произойти, и флуоресценция была полностью потеряна. Однако при S-Flp и Dhp наблюдалось надлежащее созревание белка, в результате чего образовывались флуоресцентные образцы белка для каждой комбинации аналог/белок. Несмотря на некоторые модуляции в особенностях поглощения и флуоресценции белка, они в значительной степени оставались похожими на таковые у белков дикого типа. Эффект аминокислотного замещения был выявлен в исследованиях кинетики рефолдирования. Последний показал более быстрое переворачивание в случае замены на S-Flp. Модельные исследования показали, что этот остаток может генерировать некоторое улучшение скорости вращения транс-цис-амида и приводить к образованию конформации C 4-endo. Оба эти фактора, вероятно, будут способствовать благотворному кинетическому эффекту этого остатка в EGFP. Напротив, Dhp продуцировал кинетические профили складывания, максимально похожие на родительский белок. Разнообразие результатов, полученных простыми атомными мутациями в исследуемых флуоресцентных белках, иллюстрирует потенциал метода производства SPI в изменении свойств целевого белка. Изменения белка, вызванные заменой пролина аналогами, имеют дальнейшие последствия для разработки ферментов78,79,80 и ионных каналов 81,82, а также для общей инженерии стабильности белка.

Основным ограничением метода SPI является его режим «все или ничего» при обмене пролина на родственные аналоги. Было бы очень полезно иметь возможность точно выбирать, какие остатки пролина должны быть заменены аналогами, а какие должны оставаться немодифицированными. Однако в настоящее время не существует техники, которая могла бы выполнить такое сложное производство с использованием микробного производственного хозяина. Химический синтез белков83,84, а также бесклеточнаяпродукция 85,86 являются двумя альтернативными методами, которые могут производить позиционно-специфические модификации пролина. Тем не менее, их эксплуатационная сложность и низкая производительность делают их более низкими по сравнению с производством в живых клетках. На данный момент SPI остается наиболее простым и надежным подходом к производству сложных белков, несущих атомные мутации. Путем введения неестественных заменителей аминокислот способ позволяет целенаправленно модифицировать особенности белка, что иллюстрируется здесь изменениями в сворачивании и поглощении света / излучении флуоресцентных белков, генерируемых заменителями пролина.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Немецким исследовательским фондом (Кластер передового опыта «Унифицированные системы в катализе») для T.F. и N.B. и Федеральным министерством образования и науки (программа BMBF «HSP 2020», TU-WIMIplus Project SynTUBio) для F.-J.S. и Т.М.Т.Т.

Materials

Acetonitrile VWR HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 LC-MS grade required
Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30) Carl Roth 3029.1
Agar-agar Carl Roth 5210
Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4) Sigma-Aldrich 277908
Ammonium peroxydisulphate (APS) Carl Roth 9592.2 ≥98 %, p.a., ACS grade required
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) Sigma-Aldrich A4418
Ampicillin sodium salt Carl Roth K029
Biotin Sigma-Aldrich B4501
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670
Coomassie Brillant Blue R 250 Carl Roth 3862
Copper sulfate (CuSO4) Carl Roth CP86.1
D-glucose Carl Roth 6780
1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane, N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3 ≥99 %, p.a., for electrophoresis
1,4-dithiothreitol (DTT) Carl Roth 6908
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997
di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4) Carl Roth P749.1
di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) Carl Roth X987
DNase I Sigma-Aldrich D5025
Dowex 50WX8-100 (hydrogen form) Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.) 10731181 cation exchange resin
Ethanol Carl Roth 9065.1
Formic acid VWR HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 LC-MS grade required
Glacial acetic acid Carl Roth 3738.5 100 %, p. a.
Glycerol Carl Roth 3783
Imidazole Carl Roth X998
Hydrogen chlroide (HCl) Merck 295426
Iron(II) chloride (FeCl2) Sigma-Aldrich 380024
Isopropanol Carl Roth AE73.1
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Magnesium chloride (MgCl2) Carl Roth KK36.1
Magnesium sulfate (MgSO4) Carl Roth 8283.2
Manganese chloride (MnCl2) Sigma-Aldrich 63535
β-mercaptoethanol Carl Roth 4227.3
PageRuler Unstained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific 26614
Potassium chloride (KCl) Carl Roth 6781.3
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655
RNase A Carl Roth 7156
Sodium chloride (NaCl) Carl Roth P029
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) Carl Roth T879
Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4) Carl Roth 0183
Thiamine Sigma-Aldrich T4625
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma-Aldrich T6508
Tris hydrochloride (Tris-HCl) Sigma-Aldrich 857645
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris) Carl Roth 5429
Tryptone Carl Roth 8952
Yeast extract Carl Roth 2363
Zinc chloride (ZnCl2) Sigma-Aldrich 229997
L-alanine Sigma-Aldrich A7627
L-arginine Sigma-Aldrich A5006
L-asparagine Sigma-Aldrich A8381
L-aspartic acid Sigma-Aldrich A0884
L-cysteine Sigma-Aldrich C7352
L-glutamic acid Sigma-Aldrich G2128
L-glutamine Sigma-Aldrich G3126
L-glycine Sigma-Aldrich G7126
L-histidine Sigma-Aldrich H8000
L-isoleucine Sigma-Aldrich I2752
L-leucine Sigma-Aldrich L8000
L-lysine Sigma-Aldrich L5501
L-methionine Sigma-Aldrich M9625
L-phenylalanine Sigma-Aldrich P2126
L-proline Sigma-Aldrich P0380
L-serine Sigma-Aldrich S4500
L-threonine Sigma-Aldrich T8625
L-tryptophan Sigma-Aldrich T0254
L-tyrosine Sigma-Aldrich T3754
L-valine Sigma-Aldrich V0500
(4S)-fluoroproline Bachem 4033274 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression.
(4R)-fluoroproline Bachem 4033275 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
3,4-dehydroproline Bachem 4003545 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
4,4-difluoroproline Enamine EN400-17448 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-49B
Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000 Spectrum Medical Industries Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198
Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA GE Healthcare HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01
Luer-Lock syringe, 5 mL Carl Roth EP96.1
Luer-Lock syringe, 20 mL Carl Roth T550.1
Luer-Lock syringe, 50 mL Carl Roth T552.1
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL Eppendorf 30120086
Petri dishes (polystyrene, sterile) Carl Roth TA19
pQE-80L plasmid vector Qiagen no longer available replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915
Pro-auxotrophic E. coli strain JM83 Addgene 50348 https://www.addgene.org/50348/
Pro-auxotrophic E. coli strain JM83 ATCC 35607
Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL Fisher Scientific Corning Falcon, 14-959-1B
Syringe filter 0.45 µm with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Carl Roth CCY1.1
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS Sigma-Aldrich Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 µm particle size, 10 cm x 2.1 mm with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa
HPLC autosampler vials 1.5 mL Sigma-Aldrich Supelco 854165
Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS Agilent Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF
Mass spectrometry data analysis software Agilent MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00
Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf 5427 R
Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes Eppendorf 5810 R
Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system GE Healthcare ÄKTA pure 25 L
Fluorescence spectrometer Perkin Elmer LS 55
High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption Microfluidics LM series with “Z” type chamber
Orbital shaker for bacterial cultivation Infors HT Minitron
Peristaltic pump for liquid chromatography (LC) GE Healthcare P-1
Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption Omnilab Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182 with MS72 sonifier tip
UV-Vis spectrophotometer Biochrom ULTROSPEC 2100
UV-Vis/NIR spectrophotometer Perkin Elmer LAMBDA 950 UV/Vis/NIR
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agostini, F., Völler, J. -. S., Koksch, B., Acevedo-Rocha, C. G., Kubyshkin, V., Budisa, N. Biocatalysis with unnatural amino acids: Enzymology meets xenobiology. Angewandte Chemie (International ed. In English). 56 (33), 9680-9703 (2017).
  2. Minks, C., Alefelder, S., Moroder, L., Huber, R., Budisa, N. Towards new protein engineering: In vivo building and folding of protein shuttles for drug delivery and targeting by the selective pressure incorporation (SPI) method. Tetrahedron. 56 (48), 9431-9442 (2000).
  3. Hoesl, M. G., Budisa, N. Expanding and engineering the genetic code in a single expression experiment. Chembiochem: A, European Journal of Chemical Biology. 12 (4), 552-555 (2011).
  4. Wiltschi, B., Budisa, N. Natural history and experimental evolution of the genetic code. Applied Microbiology and Biotechnology. 74 (4), 739-753 (2007).
  5. Hoesl, M. G., et al. Lipase congeners designed by genetic code engineering. ChemCatChem. 3 (1), 213-221 (2011).
  6. . FPbase avGFP Available from: https://www.fpbase.org/protein/avgfp/ (2011)
  7. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
  8. Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418 (6895), 331-335 (2002).
  9. Misteli, T., Spector, D. L. Applications of the green fluorescent protein in cell biology and biotechnology. Nature Biotechnology. 15 (10), 961-964 (1997).
  10. Hanson, M. R., Köhler, R. H. GFP imaging: methodology and application to investigate cellular compartmentation in plants. Journal of Experimental Botany. 52 (356), 529-539 (2001).
  11. Sakamoto, S., Shoyama, Y., Tanaka, H., Morimoto, S. Application of green fluorescent protein in immunoassays. Advances in Bioscience and Biotechnology. 05 (6), 557-563 (2014).
  12. Akbar, M., Kim, H. Y. Green fluorescent protein tagging: A novel tool in biomedical research. Indian Journal of Biotechnology. 4, 466-470 (2005).
  13. Kobayashi, T., Morone, N., Kashiyama, T., Oyamada, H., Kurebayashi, N., Murayama, T. Engineering a novel multifunctional green fluorescent protein tag for a wide variety of protein research. PloS One. 3 (12), 3822 (2008).
  14. Kent, K. P., Oltrogge, L. M., Boxer, S. G. Synthetic control of green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (44), 15988-15989 (2009).
  15. Born, J., Pfeifer, F. Improved GFP variants to study gene expression in Haloarchaea. Frontiers in Microbiology. 10, 1200 (2019).
  16. Pakhomov, A. A., Martynov, V. I. GFP family: structural insights into spectral tuning. Chemistry & Biology. 15 (8), 755-764 (2008).
  17. Zimmer, M. Green fluorescent protein (GFP): applications, structure, and related photophysical behavior. Chemical Reviews. 102 (3), 759-781 (2002).
  18. Valbuena, F. M., Fitzgerald, I., Strack, R. L., Andruska, N., Smith, L., Glick, B. S. A photostable monomeric superfolder green fluorescent protein. Traffic. 21 (8), 534-544 (2020).
  19. Craggs, T. D. Green fluorescent protein: structure, folding and chromophore maturation. Chemical Society Reviews. 38 (10), 2865-2875 (2009).
  20. Maddalo, S. L., Zimmer, M. The role of the protein matrix in green fluorescent protein fluorescence. Photochemistry and Photobiology. 82 (2), 367-372 (2006).
  21. Cui, G., Lan, Z., Thiel, W. Intramolecular hydrogen bonding plays a crucial role in the photophysics and photochemistry of the GFP chromophore. Journal of the American Chemical Society. 134 (3), 1662-1672 (2012).
  22. Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
  23. Andrews, B. T., Roy, M., Jennings, P. A. Chromophore packing leads to hysteresis in GFP. Journal of Molecular Biology. 392 (1), 218-227 (2009).
  24. Xie, J. -. B., Zhou, J. -. M. Trigger factor assisted folding of green fluorescent protein. Biochemistry. 47 (1), 348-357 (2008).
  25. Steiner, T., Hess, P., Bae, J. H., Wiltschi, B., Moroder, L., Budisa, N. Synthetic biology of proteins: tuning GFPs folding and stability with fluoroproline. PloS One. 3 (3), 1680 (2008).
  26. Andrews, B. T., Schoenfish, A. R., Roy, M., Waldo, G., Jennings, P. A. The rough energy landscape of superfolder GFP is linked to the chromophore. Journal of Molecular Biology. 373 (2), 476-490 (2007).
  27. Kubyshkin, V., Davis, R., Budisa, N. Biochemistry of fluoroprolines: the prospect of making fluorine a bioelement. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 17, 439-460 (2021).
  28. Renner, C., Alefelder, S., Bae, J. H., Budisa, N., Huber, R., Moroder, L. Fluoroprolines as tools for protein design and engineering. Angewandte Chemie (International ed. In English). 40 (5), 923-925 (2001).
  29. Fukuda, H., Arai, M., Kuwajima, K. Folding of green fluorescent protein and the cycle3 mutant. Biochemistry. 39 (39), 12025-12032 (2000).
  30. Rosenman, D. J., et al. Green-lighting green fluorescent protein: faster and more efficient folding by eliminating a cis-trans peptide isomerization event. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 23 (4), 400-410 (2014).
  31. Vitagliano, L., Berisio, R., Mastrangelo, A., Mazzarella, L., Zagari, A. Preferred proline puckerings in cis and trans peptide groups: implications for collagen stability. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 10 (12), 2627-2632 (2001).
  32. Kubyshkin, V. Experimental lipophilicity scale for coded and noncoded amino acid residues. Organic and Biomolecular Chemistry. 19 (32), 7031-7040 (2021).
  33. Kubyshkin, V., Budisa, N. cis-trans-Amide isomerism of the 3,4-dehydroproline residue, the ‘unpuckered’ proline. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 12, 589-593 (2016).
  34. Budisa, N. Prolegomena to future experimental efforts on genetic code engineering by expanding its amino acid repertoire. Angewandte Chemie (International ed. In English). 43 (47), 6426-6463 (2004).
  35. Beatty, K. E., Tirrel, D. A. Noncanonical amino acids in protein science and engineering. Protein Engineering. Nucleic Acids and Molecular Biology. 22, (2009).
  36. Budisa, N. . Engineering the Genetic Code: Expanding the Amino Acid Repertoire for the Design of Novel Proteins. , (2006).
  37. Merkel, L., Budisa, N. Organic fluorine as a polypeptide building element: in vivo expression of fluorinated peptides, proteins and proteomes. Organic & Biomolecular Chemistry. 10 (36), 7241-7261 (2012).
  38. van Eldijk, M. B., van Hest, J. C. M. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids for protein engineering. Methods in Molecular Biology. 1728, 137-145 (2018).
  39. Hartman, M. C. T. Non-canonical amino acid substrates of E. coli aminoacyl-tRNA synthetases. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. , (2021).
  40. Gomez, M. A. R., Ibba, M. Aminoacyl-tRNA synthetases. RNA. 26 (8), 910-936 (2020).
  41. Grant, M. M., Brown, A. S., Corwin, L. M., Troxler, R. F., Franzblau, C. Effect of l-azetidine 2-carboxylic acid on growth and proline metabolism in Escherichia coli. Biochimica et Biophysica Acta. 404 (2), 180-187 (1975).
  42. Budisa, N., Steipe, B., Demange, P., Eckerskorn, C., Kellermann, J., Huber, R. High-level biosynthetic substitution of methionine in proteins by its analogs 2-aminohexanoic acid, selenomethionine, telluromethionine and ethionine in Escherichia coli. European Journal of Biochemistry. 230 (2), 788-796 (1995).
  43. Budisa, N., Pal, P. P. Designing novel spectral classes of proteins with a tryptophan-expanded genetic code. Biological Chemistry. 385 (10), 893-904 (2004).
  44. Hoesl, M. G., Budisa, N. Recent advances in genetic code engineering in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 751-757 (2012).
  45. Nickling, J. H., et al. Antimicrobial peptides produced by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57551 (2018).
  46. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. JoVE Science Education Database. , (2021).
  47. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. JoVE Science Education Database. , (2021).
  48. Sarkisyan, K. S., et al. fluorescent protein with anionic tryptophan-based chromophore and long fluorescence lifetime. Biophysical Journal. 109 (2), 380-389 (2015).
  49. Sarkisyan, K. S., et al. KillerOrange, a genetically encoded photosensitizer activated by blue and green light. PloS One. 10 (12), 0145287 (2015).
  50. Grigorenko, B. L., Krylov, A. I., Nemukhin, A. V. Molecular modeling clarifies the mechanism of chromophore maturation in the green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 139 (30), 10239-10249 (2017).
  51. Pletnev, V. Z., et al. Structure of the green fluorescent protein NowGFP with an anionic tryptophan-based chromophore. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 71, 1699-1707 (2015).
  52. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  53. Hörnsten, E. G. On culturing Escherichia coli on a mineral salts medium during anaerobic conditions. Bioprocess Engineering. 12 (3), 157-162 (1995).
  54. Davis, B. D. The Isolation of biochemically deficient mutants of bacteria by means of penicillin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 35 (1), 1-10 (1949).
  55. Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
  56. Wang, Y. -. S., et al. The de novo engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase for genetic incorporation of L-phenylalanine and its derivatives. Molecular bioSystems. 7 (3), 714-717 (2011).
  57. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE Science Education Database. , (2021).
  58. . ImageJ Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2021)
  59. Baumann, T., et al. Engineering ‘Golden’ fluorescence by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids and protein analysis by mass spectrometry and fluorescence. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57017 (2018).
  60. . FPbase NowFFP Available from: https://www.fpbase.org/protein/nowgfp/ (2021)
  61. Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PloS One. 6 (3), 17896 (2011).
  62. Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. Chromophore isomer stabilization is critical to the efficient fluorescence of cyan fluorescent proteins. Biochemistry. 56 (49), 6418-6422 (2017).
  63. Lelimousin, M., et al. Intrinsic dynamics in ECFP and Cerulean control fluorescence quantum yield. Biochemistry. 48 (42), 10038-10046 (2009).
  64. . FPbase mKillerOrange Available from: https://www.fpbase.org/protein/mkillerorange/ (2021)
  65. Pletneva, N. V., et al. Crystal structure of phototoxic orange fluorescent proteins with a tryptophan-based chromophore. PloS One. 10 (12), 0145740 (2015).
  66. Royant, A., Noirclerc-Savoye, M. Stabilizing role of glutamic acid 222 in the structure of Enhanced Green Fluorescent Protein. Journal of Structural Biology. 174 (2), 385-390 (2011).
  67. Larregola, M., Moore, S., Budisa, N. Congeneric bio-adhesive mussel foot proteins designed by modified prolines revealed a chiral bias in unnatural translation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421 (4), 646-650 (2012).
  68. Yamaguchi, H., Miyazaki, M. Refolding techniques for recovering biologically active recombinant proteins from inclusion bodies. Biomolecules. 4 (1), 235-251 (2014).
  69. Ghisaidoobe, A. B. T., Chung, S. J. Intrinsic tryptophan fluorescence in the detection and analysis of proteins: A focus on Förster resonance energy transfer techniques. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 22518-22538 (2014).
  70. Pal, P. P., et al. Structural and spectral response of Aequorea victoria green fluorescent proteins to chromophore fluorination. Biochemistry. 44 (10), 3663-3672 (2005).
  71. Pletnev, S., et al. Structural basis for phototoxicity of the genetically encoded photosensitizer KillerRed. The Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 32028-32039 (2009).
  72. Kubyshkin, V., Budisa, N. Anticipating alien cells with alternative genetic codes: away from the alanine world. Current Opinion in Biotechnology. 60, 242-249 (2019).
  73. Minks, C., Huber, R., Moroder, L., Budisa, N. Atomic mutations at the single tryptophan residue of human recombinant annexin V: effects on structure, stability, and activity. Biochemistry. 38 (33), 10649-10659 (1999).
  74. Budisa, N., Huber, R., Golbik, R., Minks, C., Weyher, E., Moroder, L. Atomic mutations in annexin V thermodynamic studies of isomorphous protein variants. European Journal of Biochemistry. 253, 1-9 (1998).
  75. Lin, X., Yu, A. C. S., Chan, T. F. Efforts and challenges in engineering the genetic code. Life. 7, (2017).
  76. Völler, J. -. S., Budisa, N. Coupling genetic code expansion and metabolic engineering for synthetic cells. Current Opinion in Biotechnology. 48, 1-7 (2017).
  77. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annual Review of Biochemistry. 79, 413-444 (2010).
  78. Lukesch, M. S., Pavkov-Keller, T., Gruber, K., Zangger, K., Wiltschi, B. Substituting the catalytic proline of 4-oxalocrotonate tautomerase with non-canonical analogues reveals a finely tuned catalytic system. Scientific Reports. 9 (1), 2697 (2019).
  79. Acevedo-Rocha, C. G., et al. Non-canonical amino acids as a useful synthetic biological tool for lipase-catalysed reactions in hostile environments. Catalysis Science & Technology. 3 (5), 1198 (2013).
  80. Holzberger, B., Marx, A. Replacing 32 proline residues by a non-canonical amino acid results in a highly active DNA polymerase. Journal of the American Chemical Society. 132 (44), 15708-15713 (2010).
  81. Mosesso, R., Dougherty, D. A., Lummis, S. C. R. Proline residues in the transmembrane/extracellular domain interface loops have different behaviors in 5-HT3 and nACh receptors. ACS Chemical Neuroscience. 10 (7), 3327-3333 (2019).
  82. Mosesso, R., Dougherty, D. A., Lummis, S. C. R. Probing proline residues in the prokaryotic ligand-gated ion channel, ELIC. Biochemistry. 57 (27), 4036-4043 (2018).
  83. Torbeev, V. Deciphering protein folding using chemical protein synthesis. Total Chemical Synthesis of Proteins. 1st ed. , (2021).
  84. Torbeev, V. Y., Hilvert, D. Both the cis-trans equilibrium and isomerization dynamics of a single proline amide modulate β2-microglobulin amyloid assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20051-20056 (2013).
  85. Kawakami, T., Ishizawa, T., Murakami, H. Extensive reprogramming of the genetic code for genetically encoded synthesis of highly N-alkylated polycyclic peptidomimetics. Journal of the American Chemical Society. 135 (33), 12297-12304 (2013).
  86. Cui, Z., Johnston, W. A., Alexandrov, K. Cell-free approach for non-canonical amino acids incorporation into polypeptides. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1031 (2020).

Tags

Proline AnalogNon-canonical Amino AcidProtein FoldingProtein StabilityMolecular SurgeryFluorescent ProteinSite-directed MutagenesisRibosomal Protein TranslationProtein EngineeringE. Coli CultureNMM MediumOptical DensityCell SuspensionCentrifugationAmino Acid DepletionAmpicillin

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Thi To, T. M., Kubyshkin, V., Schmitt, F., Budisa, N., Friedrich, T. Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How “Molecular Surgery” of the Backbone Affects Folding and Stability. J. Vis. Exp. (180), e63320, doi:10.3791/63320 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image