JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

חילופי פרולין ספציפיים לשאריות על ידי אנלוגים פרולין בחלבונים פלואורסצנטיים: כיצד "ניתוח מולקולרי" של עמוד השדרה משפיע על קיפול ויציבות

Published: February 03, 2022
doi:
10.3791/63320
, , , ,
1Institute of Chemistry,Technische Universität Berlin, 2Department of Chemistry,University of Manitoba, 3Institute of Physics,Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Summary

כדי להתגבר על המגבלות של מוטגנזה קלאסית מכוונת אתר, אנלוגים פרולין עם שינויים ספציפיים שולבו במספר חלבונים פלואורסצנטיים. אנו מראים כיצד החלפת מימן על ידי פלואור או של היחיד על ידי קשרים כפולים בשאריות פרולין (“ניתוח מולקולרי”) משפיעה על תכונות חלבון בסיסיות, כולל קיפולם ואינטראקציה עם אור.

Abstract

החלפת שאריות פרולין (Pro) בחלבונים על ידי המוטגנזה המסורתית המכוונת לאתר על ידי כל אחת מ-19 חומצות האמינו הקנוניות הנותרות מזיקה לעתים קרובות לקיפול חלבונים, ובמיוחד להבשלת כרומופור בחלבונים פלואורסצנטיים ירוקים ובגרסאות קשורות. חלופה סבירה היא לתפעל את התרגום של החלבון כך שכל שאריות Pro יוחלפו בשאריות – במיוחד על ידי אנלוגים, שיטה המכונה שילוב לחץ סלקטיבי (SPI). השינויים הכימיים המובנים יכולים לשמש כמעין “ניתוח מולקולרי” כדי לנתח בעדינות שינויים הניתנים למדידה או אפילו לתמרן באופן רציונלי תכונות חלבון שונות. כאן, המחקר מדגים את התועלת של שיטת SPI כדי לחקור את תפקידם של פרולינים בארגון המבנה הטיפוסי של חבית β של וריאנטים ספקטרליים של החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) עם 10-15 פרולינים ברצף שלהם: חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP), NowGFP ו- KillerOrange. שאריות Pro נמצאות בקטעי חיבור בין גדילי β בודדים ומהוות את המכסים הסוגרים של פיגום החבית, ובכך אחראיות לבידוד הכרומופור ממים, כלומר תכונות פלואורסצנטיות. ניסויי שילוב לחץ סלקטיביים עם (4R)-פלואורופרופרולין (R-Flp), (4S)-פלואורופרולין (S-Flp), 4,4-דיפלואורופרולין (Dfp) ו-3,4-דהידרופרולין (Dhp) בוצעו באמצעות זן E. coli פרולין-אוקסוטרופי כמארח ביטוי. מצאנו שחלבונים פלואורסצנטיים עם S-Flp ו-Dhp הם פעילים (כלומר, פלואורסצנטיים), בעוד ששני האנלוגיים האחרים (Dfp ו-R-Flp) ייצרו חלבונים לא מתפקדים, מקופלים בצורה שגויה. בדיקה של פרופילי ספיגת UV-Vis ופליטת פלואורסצנציה הראתה מעט שינויים אופייניים בחלבונים המכילים אנלוגים של Pro. בדיקה של הפרופילים הקינטיים המתקפלים בגרסאות EGFP הראתה תהליך שיפוץ מואץ בנוכחות S-Flp, בעוד שהתהליך היה דומה לסוג פראי בחלבון המכיל Dhp. מחקר זה מציג את היכולת של שיטת SPI לייצר שינויים עדינים של שאריות חלבון ברמה אטומית (“ניתוח מולקולרי”), אשר ניתן לאמץ למחקר של חלבונים אחרים בעלי עניין. הוא ממחיש את התוצאות של תחליפי פרולין עם אנלוגים כימיים קרובים על התכונות המתקפלות והספקטרוסקופיות בקטגוריה של חלבונים פלואורסצנטיים β חבית.

Introduction

מוטגנזה קלאסית מכוונת אתר מאפשרת פרמוטציה של כל רצף חלבונים קיים המקודד על ידי גנים על ידי מניפולציה של קודון ברמת הדנ”א. כדי לחקור קיפול חלבונים ויציבותם, לעתים קרובות רצוי להחליף חומצות אמינו דומות עם עמיתים דומים. עם זאת, מוטגנזה של חלבונים מסורתיים בהחלט מוגבלת לתחליפים דומים מבחינה מבנית בין חומצות אמינו קנוניות כגון Ser/Ala/Cys, Thr/Val, Glu/Gln, Asp/Asn, Tyr/Phe, הנמצאים ברפרטואר הקוד הגנטי הסטנדרטי. מצד שני, אין אפשרויות כאלה עבור חומצות אמינו קנוניות אחרות כגון Trp, Met, His, או Pro, אשר לעתים קרובות ממלאים תפקידים מבניים ותפקודיים חיוניים בחלבונים1. גישה אידיאלית לחקר אינטראקציות אלה בהקשר של הארכיטקטורה הפנימית הספציפית ביותר של חלבונים ותהליך הקיפול שלהם היא ליצור שינויים איזוסטריים שאינם מפריעים. ואכן, כאשר אנלוגים של חומצות אמינו איזוסטריות של חומצות אמינו קנוניות אלה, הידועות גם בשם חומצות אמינו לא קנוניות (ncAAs), מוכנסים לחלבונים, הם מאפשרים שינויים עדינים אפילו ברמה של אטומים בודדים או קבוצות אטומים כגון H/F, CH2/S/Se/Te המכונות “מוטציות אטומיות”2. “ניתוח מולקולרי” כזה מייצר חלבונים משתנים שתכונותיהם נובעות אך ורק מחילופי אטומים בודדים או קבוצות של אטומים, אשר במקרים חיוביים ניתן לנתח, ואת השינויים שזוהו ניתן לתרץ. בדרך זו, היקף הסינתזה של חלבונים לחקר קיפול ומבנה החלבון מורחב הרבה מעבר למוטגנזה הקלאסית של הדנ”א. שים לב שחלבונים הנוצרים על ידי מוטגנזה מכוונת אתר מכונים בדרך כלל “מוטנטים”, בעוד שחלבונים עם חומצות אמינו קנוניות מוחלפות מכונים “וריאנטים” 3, “אלופרוטאינים”4, או “חלבונים קונגנים”5.

החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP), שזוהה לראשונה באורגניזם הימי Aequorea victoria, מפגין פלואורסצנציה ירוקה בהירה כאשר הוא נחשף לאור אולטרה סגול לכחול 6,7. כיום, GFP משמש בדרך כלל ככלי תיוג רגיש ביותר להדמיה שגרתית של ביטוי גנים ולוקליזציה של חלבונים בתאים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. GFP הוכיח את עצמו כיעיל גם במחקרים ביו-פיזיקליים שוניםשל 8,9,10 ובביו-רפואיים11,12, כמו גם בהנדסת חלבונים 13,14,15. ניתוח קפדני של מבנה ה-GFP איפשר יצירת וריאנטים רבים המאופיינים ביציבות מגוונת ובפלואורסצנטיות מקסימלית16,17. רוב וריאנטים של GFP המשמשים בביולוגיה תאית ומולקולרית הם חלבונים מונומריים הן בתמיסה והן בגביש18. הארגון המבני העיקרי שלהם אופייני לכל בני משפחת GFP, ללא תלות במקורם הפילוגנטי, והוא מורכב מ-11 גדילי β היוצרים מה שמכונה חבית β, בעוד סליל α מקועקם עובר דרך מרכז הקנה ונושא את הכרומופור (איור 1A). ההבשלה האוטוקטליטית של הכרומופור (איור 1B) דורשת מיקום מדויק של השרשראות הצדדיות המקיפות אותו במקום המרכזי של החלבון; רבות מהשרשראות הצדדיות הללו נשמרות מאוד בגרסאות GFP אחרות19. ברוב החלבונים הפלואורסצנטיים ממדוזות כמו Aequorea victoria, הכרומופור הפולט ירוק מורכב משתי טבעות ארומטיות, כולל טבעת פנול של Tyr66 והמבנה ההטרוציקלי בעל חמשת האיברים של אימידזולינון (איור 1B). הכרומופור, כאשר הוא מוטבע כראוי במטריצת החלבון, אחראי על הפלואורסצנציה האופיינית של החלבון השלם. הוא ממוקם במרכז המבנה, בעוד מבנה החבית מבודד אותו מהמדיום מימי20. חשיפת הכרומופור למים בתפזורת תגרום להרוות פלואורסצנטיות, כלומר לאובדן פלואורסצנציה21.

הקיפול הנכון של המבנה דמוי הקנה חיוני להגנה על הכרומופור מפני מרווה פלואורסצנטית22. שאריות פרולין (Pro) ממלאות תפקיד מיוחד בארגון המבני של GFP23. מאחר שהם אינם מסוגלים לתמוך בחוט β, הם מהווים לולאות חיבור האחראיות לשמירה על מבנה החלבון בכללותו. באופן לא מפתיע, 10-15 שאריות פרולין נמצאות הן ב-GFPs שמקורם ב-Aequorea והן ב-Anthoathecata שמקורם ב-GFPs; חלקם שמורים מאוד בסוגים אחרים של חלבונים פלואורסצנטיים β חבית. פרולינים צפויים להשפיע באופן קריטי על תכונות הקיפול בשל תכונותיהם הגיאומטריות הייחודיות. לדוגמה, ב-GFPs שמקורם ב-Aequorea, מתוך עשרת שאריות הפרולין (איור 2A), תשעה יוצרים טרנס-פפטידים ורק אחד יוצר קשר ציס-פפטידי (Pro89). Pro58 הוא חיוני, כלומר, לא ניתן להחלפה עם שאר 19 חומצות האמינו הקאנוניות. שאריות אלה עשויות להיות אחראיות למיקום הנכון של שאריות Trp57, שדווח כי הן חיוניות להבשלת הכרומופור ולקיפול ה-GFP הכולל24. השבר PVPWP עם שלוש שאריות פרולין (Pro54, Pro56, Pro58) ו-Trp57 הוא החלק החיוני של “המכסה התחתון” במבנה ה-GFP מאיור 1A. המוטיב המבני של PVPWP נמצא במספר חלבונים כגון ציטוכרומים ותעלות אשלגן המופעלות על ידי מתח אאוקריוטי25. תחליפי פרולין לאלנין במיקומים 75 ו-89 פוגעים גם הם בביטוי חלבונים ובקיפול ומבטלים את התבגרות הכרומופור. Pro75 ו-Pro89 הם חלק מ”המכסה העליון” שקובר את הכרומופור (איור 1A) ונשמרים על פני חלבונים פלואורסצנטיים β-חבית בעלי 11 גדילים23. שני “מכסים” אלה שומרים על הכרומוזורה לא נכלל בממס מימי, גם כאשר המבנה השלישוני היציב נשבר חלקית26. ארכיטקטורה מולקולרית ספציפית כזו מגנה על הפלואורופור מפני מרווה פלואורסצנטית מתנגשת (דינמית), למשל על ידי מים, חמצן או ליגנדות מתפזרות אחרות.

על מנת לבצע הנדסה מולקולרית של מבנה ה-GFP, יש להכניס תחליפי חומצות אמינו במבנה הראשוני של החלבון. מוטציות רבות בוצעו ב-GFP, וסיפקו לווריאנטים יציבות גבוהה, קיפול מהיר ואמין ותכונות פלואורסצנטיות משתנות17. עם זאת, ברוב המקרים, מוטציה של שאריות פרולין נחשבת לגישה מסוכנת בשל העובדה שאף אחת מ-19 חומצות האמינו הקאנוניות הנותרות אינה יכולה לשחזר כראוי את הפרופיל הקונפורמי של שאריות הפרולין27. כך פותחה גישה חלופית, שבה שאריות פרולין מוחלפות במבנים אחרים המבוססים על פרולין, המכונים אנלוגים פרולין28. בשל המבנה הכימי המחזורי הייחודי שלו, פרולין מציג שני מעברים קונפורמיים אופייניים (איור 1C): 1) נקבת טבעת הפרולין, תהליך מהיר הכרוך בארגון עמוד השדרה, המשפיע בעיקר על זווית הפיתול φ, ו-2) איזומריזציה של קשר פפטידי cis/trans, תהליך איטי המשפיע על קיפול עמוד השדרה דרך זוויות הפיתול של ω. בשל אופיו האיטי, המעבר האחרון אחראי בדרך כלל לשלבים המגבילים את הקצב בתהליך הקיפול של החלבון השלם. הוכח בעבר כי איזומריזציה של קשר פפטידי cis/trans סביב חלק משאריות הפרולין כוללת צעדים איטיים בקיפול גרסאות GFP. לדוגמה, היווצרות הקשר cis-peptide ב- Pro89 כוללת את השלב האיטי בתהליך הקיפול מכיוון שהוא מסתמך על מעבר הקשר מטרנס לציס29. ניתן להשיג שיפוץ מהיר יותר לאחר החלפת Pro89 בלולאה פפטידית של כל-טרנס, כלומר על ידי ביטול אירוע איזומריזציה של ציס-לטרנס 30. בנוסף לאיזומריזציה של ציס/טרנס, מעברי ה-pucker עשויים גם ליצור שינויים עמוקים בקיפול חלבונים עקב ארגון עמוד השדרה והאריזה בתוך פנים החלבון27,31.

שינויים כימיים גורמים לשינוי המעברים הקונפורמיים הפנימיים של שאריות הפרולין, ובכך משפיעים על יכולתו של החלבון להתקפל. אנלוגים פרולין מסוימים הם מועמדים אטרקטיביים במיוחד להחלפת פרולין בחלבונים מכיוון שהם מאפשרים מניפולציה ולימוד של תכונות הקיפול. לדוגמה, (4R)-פלואורופרולין (R-Flp), (4S)-פלואורופרו-פרולין (S-Flp), 4,4-דיפלואורופרולין (Dfp) ו-3,4-דהידרופרולין (Dhp) הם ארבעה אנלוגים (איור 1D) השונים באופן מינימלי מפרולין הן מבחינת הנפח המולקולרי והן מבחינתהקוטביות 32. יחד עם זאת, כל אנלוגי מציג נקבת טבעת מובחנת: S-Flp מייצב את ה-C 4-endo pucker, R-Flp מייצב את ה-C 4-exo pucker, Dfp אינו מפגין העדפת נקבים נראית לעין, בעוד ש-Dhp מבטל את ה-puckering (איור 1D)33. על ידי שימוש באנלוגיות אלה במבנה החלבון, ניתן לתמרן עם המעבר הקונפורמי של שאריות הפרולין, ועם זאת, להשפיע על התכונות של גרסאות ה- GFP המתקבלות.

בעבודה זו, שמנו לנו למטרה לשלב את הקבוצה הייעודית של אנלוגים פרולין (איור 1D) במבנה של וריאנטים של GFP באמצעות שיטת שילוב הלחץ הסלקטיבי (SPI, איור 3)34. החלפת שאריות חומצות אמינו באנלוגיות האיזוסטרוקטורליות הקרובות ביותר אליהן היא מושג ביו-טכנולוגי יישומי בתכנון חלבונים35,36. לפיכך, ההשפעות של אנלוגים פרולין בחלבון מודל ממחישות את הפוטנציאל שלהם לשמש ככלים בהנדסת חלבונים37. ייצור חלבונים המכילים אנלוגים רצויים בוצע בזני E. coli שעברו שינוי שאינם מסוגלים לייצר פרולין (פרולין-אוקסוטרופיה). לפיכך, הם עשויים להיאלץ לקבל החלפת מצעים בתהליך של ביוסינתזה של חלבון38. החלפה גלובלית זו של פרולין מתאפשרת על ידי גמישות המצע הטבעי של סינתזות אמינואציל-tRNA אנדוגניות39, האנזימים המרכזיים המזרזים את האסטריפיקציה של tRNA עם חומצות אמינו מתאימות40. באופן כללי, כפי שמתואר באיור 3, גדילת התאים מתבצעת בתווך מוגדר עד שמגיעים לשלב הצמיחה הלוגריתמית האמצעית. בשלב הבא, חומצת האמינו שתוחלף מתרוקנת תוך תאית ממערכת הביטוי במהלך התסיסה ולאחר מכן מוחלפת על ידי האנלוגי או ה- ncAA הרצויים. לאחר מכן, ביטוי של חלבון מטרה מושרה לצורך שילוב של חומצות אמינו שאינן קנוניות ספציפיות לשאריות. ההחלפה של חומצת האמינו הקוגנטית באנלוגיה שלה מתרחשת באופן רחב פרוטאום. למרות שתופעת לוואי זו עשויה להיות בעלת השפעה שלילית על צמיחת הזן המארח, איכות ייצור חלבון המטרה לרוב אינה מושפעת, שכן, בביטוי רקומביננטי, המשאבים התאיים מופנים בעיקר לייצור חלבון היעד41,42. לכן, מערכת ביטוי מוסדרת היטב, בלתי ניתנת להשראה ומקדמים חזקים הם חיוניים ליעילות התאגדות גבוהה43. הגישה שלנו מבוססת על שילוב ספציפי לשאריות מרובות של ncAAs בתגובה לקודון חושי (הקצאה מחדש של קודון חושי), לפיו בתוך גן המטרה, ניתן לתמרן את מספר המיקומים להחדרה אנלוגית של Pro באמצעות מוטגנזהמכוונת אתר 44. גישה דומה יושמה בדו”ח הקודם שלנו על הכנת פפטידים רקומביננטיים בעלי תכונות אנטי-מיקרוביאליות45. בעבודה זו יישמנו את שיטת SPI, המאפשרת להחליף את כל שאריות הפרולין באנלוגיות קשורות, כדי ליצור חלבונים הצפויים להיות בעלי תכונות פיסיקוכימיות מובהקות שאינן קיימות בחלבונים המסונתזים עם רפרטואר חומצות האמינו הקנוניות. על ידי אפיון הפרופיל המתקפל והפלואורסצנטי של הווריאנטים המתקבלים, אנו שואפים להציג את ההשפעות של תחליפים אטומיים בגרסאות של GFP.

Protocol

1. הכנסת פלסמידי ביטוי לתאי E. coli פרו-אקסוטרופיים מוכשרים ערבבו 1 ננוגרם של כל דגימת פלסמיד, pQE-80L H6-EGFP, pQE-80L H 6-NowGFP, ו-pQE-80L H6-KillerOrange, עם 50 μL של תאים מוכשרים כימית או אלקטרו-תחרותיים של הזן Pro-auxotrophic E. coli K12- שמקורו ב-JM83 (Addgene #50348, או ATCC #35607) לטרנספורמציה בשיטת הלם החום או האלקטרופורציה על פי הפרוטוקולים הזמינים 46, 47.הערה: וקטור הביטוי pQE-80L EGFP-H6 מקודד חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) המתויג באופן סופי ב-C-terminally 6xHis, וקטורי הביטוי pQE-80L H 6-NowGFP ו-pQE-80L H 6-KillerOrange מקודדים את ה-NowGFP 48 המתויג באופן סופי של N-terminally 6xHisE48 או KillerOrange 49 המתויג באופן סופי N-terminally 6xHis-Taged49, בהתאמה, כל אחד בעמוד שדרה פלסמיד pQE-80L. כל גני המטרה נמצאים תחת שליטה של מקדם T5 חיידקי המווסת על ידי מפעיל הלאק. עמידות אמפיצילין שימשה כסמן סלקציה ו- colE1 כמקור לשכפול. עיין בטבלת החומרים לקבלת מידע נוסף על פלסמיד pQE-80L. E. coli פרו-אוקסוטרופי חלופי שמקורו בזנים K-12 ו-B יכול לשמש גם לביטוי ואמור להניב תוצאות דומות. המסה המולקולרית המחושבת של חלבונים מסוג פרא ([M+H]+) המתויגים ב-H6 ([M+H]+) (לאחר הבשלת הכרומופור) הם 27,745.33 Da (EGFP- H6), 27,931.50 Da (H 6-NowGFP) ו-27,606.09 Da (H6-KillerOrange). המבנים העיקריים של חלבוני המטרה ניתנים בטבלה 1 (התג שלו מסומן בקו תחתון). הגלוטמין (Q) בתוך רצף התגים שלו של NowGFP זוהה על ידי ריצוף דנ”א לאחר תת-סגירה של ה-CDNA של NowGFP שהתקבלה מ-Pletnev et al.51 לתוך הפלסמיד pQE-80L. זה לא מעכב את טיהור החלבון או את התכונות של החלבון הפלואורסצנטי. לשחזר את התאים ב 950 μL של מדיום SOC ב 37 °C במשך 1 שעה. פרשו 50 μL של התאים שהתאוששו על צלחות בינוניות של Luria Agar (LA) (ראו חומר משלים) המכילות גלוקוז (10 גרם/ל’) ואמפיצילין (100 מיקרוגרם/מ”ל). דגירה של הצלחות הבינוניות של לוס אנג’לס בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה או 30 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. 2. ייצור חלבונים פלואורסצנטיים רקומביננטיים מסוג בר (המכילים פרולין קנוני) והליך לשילוב לחץ סלקטיבי (SPI) לייצור חלבונים פלואורסצנטיים עם אנלוגים פרולין (S-Flp, R-Flp, Dfp, Dhp) תרבית לילה של זן פרו-אוקסוטרופי E. coli K12 שמקורו ב-JM83 המכיל pQE-80L EGFP- H6, pQE-80L H 6-NowGFP, ו-pQE-80L H6-KillerOrange השתמשו בקצה פיפטה סטרילי או בלולאת חיסון כדי לבחור מושבה בודדת מתוך צלחת בינונית של LA ולהחיות את התאים ב-5 מ”ל של מדיום ציר ליסוגני (LB) (ראו חומר משלים; מכיל 10 גרם/ל’ גלוקוז, 100 מיקרוגרם/מ”ל אמפיצילין) בצינור תרבית פוליסטירן סטרילי 14 מ”ל.הערה: מושבות שזה עתה השתנו מומלצות לחיסון. יש להשתמש בתאים על לוחות בינוניים של LA (משלב 2.2.) המאוחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס תוך מספר ימים. הגדל את תרבית התאים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס בשייקר מסלולי ב-200-250 סל”ד. ייצור של רקומביננט EGFP- H6ח,6-NowGFP ו-H6-KillerOrange עם פרולין מקורי וגרסאות החלבון המתאימות עם אנלוגים פרוליןחסן 200 מ”ל של מדיום NMM טרי (7.5 mM (NH4)2SO4, 50 mM K2HPO4 ו- 22 mM KH2PO4, 8.5 mM NaCl, 1 mM MgSO4, 20 mM D-גלוקוז, 1 מיקרוגרם / מ”ל FeCl2, 1 מיקרוגרם / מ”ל CaCl2, 10 מיקרוגרם / מ”ל תיאמין, 10 מיקרוגרם / מ”ל ביוטין, 0.01 מיקרוגרם / מ”ל יסודות קורט (CuSO4, ZnCl2, MnCl2, (NH4)2MoO4), pH ~7.2) עם כל חומצות האמינו l-קנוניות (50 מ”ג/ל’); ראה חומר משלים) בתוספת אמפיצילין של 100 מיקרוגרם/מ”ל עם 2 מ”ל מ”ל מתרבית הלילה בבקבוקון 2-L Erlenmeyer.הערה: בהתאם לסוג החלבון, ניתן לבדוק מדיית גידול חלופית כמו MOPS medium52, מלחי גלוקוז-מינרלים בינוניים53, מדיום מינימלי של דייוויס54, M9 בינוני מינימלי55 או GMML56 כדי לייעל את תפוקת החלבון. דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בשייקר מסלולי ב-220 סל”ד למשך כ-3 שעות ו-30 דקות. מדוד את הצפיפות האופטית ב- 600 ננומטר (OD600) בספקטרופוטומטר כל 30 דקות עד שמגיעים לערך OD600 של ~ 0.7.הערה: לקביעת OD600 בספקטרופוטומטר, הקובט צריך להיות בעל אורך נתיב של 1 ס”מ. מדיום הטיפוח המתאים משמש למדידת הייחוס (“אפס”). זמן הדגירה עד להגעת ערך OD600 של ~ 0.7 עשוי להיות תלוי בנפח התרבית. 3 שעות 30 דקות הוא ערך משוער. בווריאציה של תת-הפרוטוקול 2.2.1-2.2.3., התרבות מתת-שלב 2.1.2. משמש לחיסון מדיום NMMΔPro טרי (ראו חומר משלים) בתוספת ריכוז מוגבל של פרולין (למשל, 5 מ”ג/ל’ במקום 50 מ”ג/ל’ במקום 50 מ”ג/ל’), והתאים גדלים במשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס בשייקר מסלולי ב-220 סל”ד. למחרת, קביעת OD600 מתבצעת כל 30 דקות עד שההפרשים בין המדידות יהיו פחות מ-0.05. הערך המרבי של OD600 צריך להיות סביב 1 (± 0.3). ניתן להתאים את ריכוז הפרולין ההתחלתי והמוגבל בהתאם לזן הביטוי ולמדיום הטיפוח (ראו דיון). סובב את מתלי התא למשך 10 דקות ב-3,000 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס. מפרקים בעדינות את הסופרנטנט לפסולת. שלב הכביסה: החייאת התאים ב-50 מ”ל של NMMΔAA קר כקרח (ללא כל חומצת אמינו, ראו תוספת חומר) או NMMΔPro (ללא פרולין, ראו חומר משלים) על ידי צנרת זהירה.הערה: עבור שלב שטיפה זה, ניתן להשתמש בכל אחד משני המאגרים המוצהרים, שכן חשוב רק להיפטר מפרולין שיורי במדיום הדגירה. הפרד את התאים מהמדיום על ידי שקיעה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה ב-3,000 x גרם למשך 10 דקות. מפרקים בעדינות את הסופרנטנט לפסולת. פיפט בעדינות למעלה ולמטה כדי להחיות את גלולת התא ב-200 מ”ל של מדיום NMMΔPro בתוספת 100 מיקרוגרם/מ”ל אמפיצילין לתוך בקבוקון 2-L Erlenmeyer.הערה: ניתן להפריד את תרחיף התא שנוצר למספר דגימות בעלות נפח שווה כדי לקבל תרביות התחלה זהות להשוואת ביטוי חלבון בנוכחות אנלוגים Pro או proline (למשל, הפרדה ל-4 x 50 מ”ל בבקבוקי Erlenmeyer של 100 מ”ל). דגירה למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס בשייקר מסלולי ב-220 סל”ד לדלדול מוחלט של Pro.הערה: שלב זה הוא קריטי כדי לרוקן לחלוטין את Pro מהתאים. הוסף נפח מתאים של L-proline או R-Flp, S-Flp, Dfp ו- Dhp מתמיסת מלאי של 50 mM כדי להתאים את הריכוז הסופי של 1 mM בהשעיית התא.הערה: ככלל, פתרונות מלאי טריים של 50 mM של נגזרי Pro או proline תמיד צריכים להיות מוכנים לפני השימוש. רק אם הידרוליזה של חומצת אמינו קנונית מסוימת או לא קנונית בתמיסה מימית אינה מהווה דאגה, ניתן להשתמש גם במלאים קפואים. הוסף 0.5 mM IPTG מתמיסת מלאי של 1 M כדי לגרום לביטוי חלבון מטרה. להביע את חלבון המטרה למשך הלילה (12 שעות) ב-37 מעלות צלזיוס בשייקר מסלולי ב-220 סל”ד. מדוד את OD600 ביום המחרת.הערה: קביעת OD600 נעשית כדי לכמת את כמות התאים לאחר ביטוי חלבון. ערך OD600 נמוך יותר בהשוואה לערך שנמדד לפני שלב הכביסה 2.2.3 מציין ציטוטוקסיות של חומצת האמינו שסופקה. במקרה זה, יש לחזור על ההליך עם ריכוז חומצת האמינו המסופקת ממוזער (עד 0.1 mM). צנטריפוגה ולאסוף את תאי החיידקים ב 5,000 x g ו 4 ° C במשך 10 דקות ולפרק את supernatant לתוך פסולת. שלב הכביסה: בצעו החייאה של התאים על ידי צנרת זהירה ב-50 מ”ל של חיץ קשירת קשירה (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM DTT) המכילים 10% גליצרול ומעבירים את תרחיף התא לתוך צינור פוליסטירן חרוטי של 50 מ”ל. צנטריפוגה ולאסוף את תאי החיידקים ב 5,000 x g ו 4 ° C במשך 10 דקות ולפרק את supernatant לתוך פסולת. אחסנו את גלולת התא בצינור פוליסטירן חרוטי בגודל 50 מ”ל בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס או -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף (טיהור חלבונים, ראה להלן). 3. הליך טיהור של דגימות חלבון על ידי כרומטוגרפיית זיקה של יונים מתכתיים משותקים (IMAC) ליזיס של תאים בקטריאלייםהערה: בצע את כל השלבים של תזה תאית על קרח או ב- 4 °C (7 °F) כדי למנוע פירוק של חלבון המטרה. להפשיר את גלולת התא החיידקי על קרח או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בצינור פוליסטירן חרוטי של 50 מ”ל למשך 10-20 דקות. הוסיפו 10 מ”ל של חיץ קשירה קר כקרח (ראו חומר משלים) ופיפט בעדינות למעלה ולמטה כדי לבצע החייאה של גלולת התא. הוסף 100 μL של 50 מ”ג / מ”ל ליזוזים, 100 μL של 1 מ”ג / מ”ל DNase I, 100 μL של 1 מ”ג / מ”ל RNase A, 30 μL של 1 M MgCl2. הפוך בזהירות את מתלה התא חמש פעמים, ושמור את הצינור הסגור על קרח או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.הערה: Lysozyme משרה ליזיס של תאים כימיים על ידי שיבוש דופן התא החיידקי. Sonicate הדגימה לשיבוש תאים באמצעות הומוגנייזר אולטרסאונד (למשל, 3 פעמים במשך 3 דקות בצינור פוליסטירן 50 מ”ל על תערובת מי קרח, דופק 2 s / השהייה 4 s, משרעת 45%) ).הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בשיטות אחרות של שיבוש תאים, למשל, הומוגניזציה בלחץ גבוה ב-20 מחזורים ב-14,000 psi. במידת הצורך, יש לדלל באמצעות מאגר כריכה (ראה חומר משלים) כדי להגיע לנפח המכשירים המינימלי. יתר על כן, ריאגנטים למיצוי חלבונים יכולים לשמש לשיבוש תאים. ראה את טבלת החומרים לדוגמה. צנטריפוגה למשך 60 דקות ב 18,000 x g, 4 °C (74 °F). שים לב למטה את נפח הנוזל עבור substep 3.1.9. ולשפוך את supernatant לתוך צינור פוליסטירן טרי 50 מ”ל. נקה את הסופרנטנט באמצעות מסנן ממברנה עם קוטר נקבובית של 0.45 מיקרומטר. קח דוגמה של “lysate” עבור SDS-PAGE (ראה סעיף 4. להלן); זה מתאים ל”שבר חלבון מסיס”, הסופרנטנט מתת-שלב 3.1.6. הוסף נפח שווה של ddH2O כפי שנקבע ב- substep 3.1.6. כדי לבצע החייאה של פסולת התאים כדי לשמור על אותו דילול של הדגימות עבור ניתוח SDS-PAGE שלאחר מכן. קח דוגמה של “גלולה” עבור SDS-PAGE (ראה סעיף 4. להלן); זה מתאים ל”שבר חלבון בלתי מסיס”, תרחיף פסולת התא מתת-שלב 3.1.9. טיהור כרומטוגרפיית זיקה מתכתית משותקת (IMAC)הערה: ניתן לבצע טיהור של חלבון המטרה הפלואורסצנטי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או בטמפרטורת החדר (RT). עבור האפשרות האחרונה, המתן עד שהליזאט, העמודה וכל המאגרים ישתו ב- RT כדי למנוע היווצרות בועות אוויר עקב אידוי של אוויר הכלוא בתמיסה קרה עם המיקום בעמודה חמה. טהר את הדגימה באמצעות עמודת IMAC FPLC (כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר [או ביצועים] ארוזה מראש של 1 מ”ל או ארוזה בעצמה) בהתאם להוראות היצרן; הגדר לחץ עמודה מרבי ל- 0.3 MPa, וקצב זרימה ל- 1 מ”ל לדקה; השתמש במאגר קשירה (ראה חומר משלים) לשיווי משקל עמודים, במאגר שטיפה (ראה חומר משלים) עבור שלב הכביסה, ובמאגר אלוטיון (ראה חומר משלים) עבור אלוטיון חלבון מטרה.הערה: לחלופין, ניתן ליישם מערכת FPLC אוטומטית כדי להעלים את חלבון המטרה עם מאגר elution שמריץ גרדיאנט ריכוז אימידזול ליניארי (20-200 mM). לאסוף ולאחם את השברים הקטנים עם חלבונים פלואורסצנטיים (בחר לפי הצבע הירוק או הכתום הנראה לעין). מעבירים את השברים המאוגדים לממברנת דיאליזה (ניתוק משקל מולקולרי (MWCO) של 5,000-10,000) בהתאם להוראות היצרן ודיאליז לפחות שלוש פעמים כנגד מאגר דיאליזה או מאגר MS (ראו חומר משלים). לדוגמה, בצע דיאליזה של דגימה של 1 מ”ל שלוש פעמים מול 100 מ”ל של מאגר למשך 2 שעות לפחות בכל סיבוב. לקבלת פרוטוקול מפורט, עיין ב- Budisa et al.34. הכינו דילול של פי 1:100 של שבר ההמלטה הדיאליזי ב-PBS buffer (ראו חומר משלים). רשום את ספקטרום הספיגה של הדגימות המדוללות בספקטרופוטומטר UV-Vis. חישוב ריכוז החלבון בהתבסס על חוק למברט-באר כדלקמן, תוך שימוש בערכי ספרות של מקדמי ההכחדה הטוחנים ε באורך גל מסוים (עבור EGFP ב-488 ננומטר ε488 = 55,000 ס”מ-1· M-1, NowGFP ב 493 ננומטר ε493 = 53,600 ס”מ-1· M-1, KillerOrange ב-514 ננומטר ε514 = 22,600 ס”מ-1· M-1): (חוק למברט-באר)c חלבון = ריכוז חלבון [mg/mL]A = ספיגה באורך גל מסויםε = מקדם הכחדה טוחנת באורך גל מסוים [M-1·cm-1]d = אורך נתיב cuvette, כאן 1 ס”מMW = משקל מולקולרי של חלבון [g/mol]השתמש במאגר דיאליזה (ראה חומר משלים) למדידת הייחוס (“אפס”). קח דגימה של “eluate” עבור SDS-PAGE (ראה סעיף 4 להלן), טען 1-10 מיקרוגרם של חלבון (מחושב על פי השלב הקודם) לכל דגימה היטב עבור ג’לים מוכתמים כחול מבריק של Coomassie.הערה: התאם את כמויות דגימת ה- SDS בהתאם לשיטת ההכתמה המיושמת ולרגישות של הצבע אם תרכובות שונות מ- Coomassie Brilliant Blue משמשות להכתמת רצועת חלבון. הקפיאו ואחסנו את דגימת החלבון במאגר דיאליזה (ראו חומר משלים) בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.הערה: בתנאי אחסון אלה, דגימות חלבון צריכות להיות יציבות למשך 6 חודשים לפחות. מעבדה חלופית UV-Vis וספקטרופוטומטרים פלואורסצנטיים יכולים לשמש לרישום ספקטרום ספיגה ופליטה פלואורסצנטית של חלבוני מטרה. ניתן ליישם את אורכי הגל הבאים של עירור עבור מדידות פליטה פלואורסצנטיות: 488 ננומטר (EGFP), 493 ננומטר (NowGFP) ו-510 ננומטר (KillerOrange). 4. הכנת SDS-PAGE לדוגמה קבע ספיגה A ב 280 ננומטר (A280nm) עבור דגימות “eluate”, “lysate” ו “גלולה” מתוך סעיף 3. התאם את נפח הבדיקה כדי להשיג A280nm = 2 על ידי הוספת כמות מתאימה של מאגר elution (נפח הבדיקה הסופי צריך להיות לפחות 80 μL). ערבבו את הדגימה ביחס של 4:1 (v/v) עם מאגר צבע לטעינת SDS 5x (ראו חומר משלים) על ידי צנרת, למשל, 80 μL של הדגימה עם 20 μL של מאגר טעינת SDS 5x. מרתיחים את דגימות ה-SDS בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות באמבט מים או בלוק חום כדי לנטרל את החלבונים. אפשרו לדגימות להתקרר ל-RT ולסובב את הגשושיות ב-13,000 x g למשך דקה אחת במיקרו-סנטריפוג’ לפני הטעינה על הג’ל. השתמש ב- 5-10 μL עבור SDS-PAGE מוכתם בכחול מבריק של Coomassie. לפרטים על נוהל SDS-PAGE, עייןב-57.הערה: התאם את כמויות דגימת ה- SDS בהתאם לשיטת ההכתמה המוחלת ולרגישות של הצבע. יש לבדוק היטב את התוצאה של ה-SDS-PAGE כדי לוודא שהדגימות מכילות יותר מ-95% מסך החלבון בפס המתאים למשקל המולקולרי הצפוי של החלבון הרצוי. לשם כך, צלם תמונה של הג’ל המוכתם ב- Coomassie והשווה את עוצמת רצועת החלבון במשקל המולקולרי הרצוי עם העוצמה של כל הפסים האחרים בנתיב (אם בכלל) על ידי densitometry. לצורך הערכה דחיסותית של עוצמות הפס, ניתן להשתמש בתוכנה ImageJ58. כדי להוכיח באופן ניסיוני את שילובם של ה-ncAAs הרצויים בחלבון המעניין, יש לבצע ניתוח מסת חלבון שלם על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) המוצמדת לספקטרומטריית מסה של זמן-טיסה של יינון אלקטרוספריי (LC-ESI-TOF-MS) כמתואר59 (ראו פרוטוקול סעיף 5 וטבלת חומרים בו עבור ציוד למופת). 5. פליטה פלואורסצנטית של וריאנטים חלבוניים לפני ההליך, בדוק את התוצאה מניסוי SDS-PAGE כדי לוודא שטוהר הדגימה >95% (ראה הערה לאחר שלב 4.5.) התאם את הדגימות של כל גרסה של חלבון מטוהר לריכוז של 0.3 μM, תוך התחשבות בערך הספיגה המחושב באורך הגל המתאים כהפניה (תת-שלב 3.2.5.). ודא שנפח הדגימה הסופי המשוער הוא 200 μL. תנו לדגימות המדוללות להשתוות במשך שעה אחת ב-RT. העבר את הדגימות לקובט קוורץ בקוורץ בקוטר 1 ס”מ ומדוד ספקטרום פליטה פלואורסצנטי של הדגימות באמצעות ספקטרומטר פלואורסצנטי (ראה טבלת חומרים) המחיל את אורכי הגל הבאים של עירור: 488 ננומטר (עבור EGFP), 493 ננומטר (עבור NowGFP), 510 ננומטר (עבור KillerOrange). 6. דנטורציה ושיפוץ של וריאנטים של EGFP לפני ההליך, בדוק את התוצאה מניסוי SDS-PAGE כדי לוודא שטוהר הדגימה >95% (ראה הערה לאחר שלב 4.5.) היכונו לכל וריאנט של חלבון מטוהר שתי דגימות של נפח סופי של 2 μL בריכוז של 300 μM (ראו קביעת ריכוז החלבון בתת-שלבים 3.2.4-3.2.6). הוסף 18 μL של 1.11x מאגר PBS (ראה חומר משלים) המכיל 8.89 M אוריאה ו-5.56 mM DTT עד 2 μL של כל גרסת חלבון מטוהרת (כדי לקבל 1x PBS המכיל 8 M אוריאה ו-5 mM DTT) כדי לגרום לדנטורציה.הערה: עבור שלבים 6.4-6.6, עבוד כל דגימה בנפרד. דגירה של הדגימות למשך 5 דקות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס. דיללו את דגימות ה-20 μL פי 100 על ידי הוספת 1980 μL של 1x PBS (ראו חומר משלים) המכיל 5 mM DTT כדי לגרום לשינוי שם, מה שמניב ריכוז חלבון סופי של 0.3 μM ומעביר מיד 200 μL של הדגימות לקובט קוורץ של 1 ס”מ.הערה: חשוב מאוד לעבוד כאן מהר מכיוון שהשינוי מתחיל באופן מיידי. הכנס את הקובט קוורץ לספקטרומטר פלואורסצנטי מתאים (ראה טבלת חומרים) ועקוב אחר שיפוץ חלבונים בדגימות על ידי רכישת ספקטרום פלואורסצנטי כל 3 שניות מעל 30 דקות. עבור כל וריאנט חלבון, השתמש בעירור פלואורסצנטי של 295 ננומטר עבור הדגימה הראשונה ובעירור פלואורסצנטי של 488 ננומטר עבור השנייה. העבר את דגימות ה- refolding לצינורות microcentrifuge בגודל 1.5 מ”ל, סגור את המכסה ואחסן את הדגימות ב- RT בחושך במשך 24 שעות כדי לאפשר שיפוץ מלא של גרסאות EGFP. מדוד פליטה פלואורסצנטית של דגימות חלבון משוחזרות על פי שלב 6.6 באמצעות אותו אורך גל של עירור כמו קודם כדי ללכוד את נקודת הקצה הטמפורלית של התאוששות פלואורסצנטית.

Representative Results

בתחילת המחקר, בחרנו שלוש גרסאות שונות של חלבונים פלואורסצנטיים החולקים את ארכיטקטורת ה-GFP האב. החלבון הראשון שנבחר היה EGFP, שהוא גרסה מהונדסת שמקורה ב-GFP המקורי מהמדוזה Aequorea victoria המכילה מוטציות Phe64Leu/Ser65Thr. החלבון השני שנבחר היה NowGFP51,60. זוהי גם גרסה של A. victoria GFP שמקורה במוטגנזה במספר שלבים באמצעות חלבונים פלואורסצנטיים קודמים. NowGFP מכיל 18 מוטציות בהשוואה לחלבון הפלואורסצנטי שקדם לו באופן מיידי “Cerulean”61. בתורו, החלבון “Cerulean” הוא נגזרת של חלבון פלואורסצנטי ציאן משופר (ECFP)62,63, חלבון שנבחר בעבר על ידי אבולוציה מעבדתית מכוונת ומכיל כרומופור מבוסס טריפטופן. שניהם, EGFP ו-NowGFP נמצאים בשימוש נרחב בביולוגיה של התא ובמחקרים ביופיזיים, והם מכילים עשרה שאריות פרולין שמורות במבנים שלהם. בנוסף, ל-NowGFP יש שאריות פרולין 11 בעמדה 230, שהופיעו בשל היסטוריית המוטציות הנרחבת של וריאנט חלבון זה. החלבון השלישי שנבחר היה החלבון הפלואורסצנטי KillerOrange64,65. הוא נגזרת של הכרומופרוטאין anm2CP מהסוג ההידרוזואני Anthoathecata. רצף החלבונים מכיל 15 שאריות פרולין, והכרומופור מבוסס על טריפטופן ולא על שאריות טירוזין. דווח על מבני רנטגן ברזולוציה גבוהה עבור כל שלושת החלבונים שנבחרו (איור 2)51,65,666. בשלב הראשון, אנלוגים פרולין (איור 1D) שולבו בכל מיקומי הפרולין של שלושה חלבוני מודל (EGFP, NowGFP ו-KillerOrange) על ידי שילוב לחץ סלקטיבי (SPI, סכימה של ההליך ניתנת באיור 3). באופן אינסטרומנטלי, זן ה-E. coli K12 הפרולין-אוקסוטרופי JM8367 שימש לביטוי של החלבונים בנוכחות פרולין ואנלוגיה (איור 1D), והניב חלבונים מסוג בר וחלבונים שעברו שינוי, בהתאמה. לכדורים מתאים המבטאים את החלבון הטבעי ולגרסאות שנשאו S-Flp ו-Dhp היה הצבע הבהיר האופייני בשל הכרומופור השלם, בעוד שגרסאות המכילות R-Flp ו-Dfp נותרו חסרות צבע, מה שמעיד על קיפול שגוי ושקיעה של חלבון נפרש בגופי הכללה (איור 4A). ניתוח SDS-PAGE של הדגימות המבוטאות אימת את נוכחותם של חלבונים המכילים R-Flp בלתי מסיסים (איור 4B-D), מה שמנע חקירות נוספות. למרות שזה מעבר להיקף של המחקר הנוכחי, יש לציין כי מסיסות חלבונים ובעיות קיפול שגויות ניתן להקל במידה מסוימת על ידי הליכי שיפוץ במבחנה 68. לעומת זאת, חלבונים מקומיים, כמו גם וריאנטים נושאי S-Flp ו-Dhp, נמצאו בעיקר בשברים המסיסים (איור 4B-D). הסוג הפראי, כמו גם הווריאנטים המכילים S-Flp ו-Dhp, יכולים להיות מבודדים עוד יותר ולאפיין במחקרי פלואורסצנציה. חלבונים מסיסים טוהרו על ידי כרומטוגרפיית זיקה משותקת של יונים מתכתיים (IMAC), והניבו 20-30 מ”ג/ל’ של נפח תרבית עבור EGFP, 60-80 מ”ג עבור NowGFP ו-KillerOrange, שהתפוקה שלהם לחלבונים מסוג פראי ומותאמים הייתה דומה מאוד. ניתוח ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS) אישר את הזהות והטוהר הצפויים של המבודדים שהתקבלו באופן זה (איור 5). בספקטרום המסה, כל החלפת פרולין ב-S-Flp הניבה תזוזה של +18 Da לכל שארית פרולין ברצף, בעוד שעבור החלפת פרולין ל-Dhp, ההזזה הייתה −2 Da לכל שאריות. בשלב הבא, תועדו קליטת אור וספקטרום פליטה כדי לנתח את ההשפעות הפוטנציאליות של אנלוגים פרוליניים שאינם קנוניים המשולבים בתכונות הספקטרוסקופיות של חלבוני האב הפלואורסצנטיים (איור 6). ספקטרום ספיגת UV-Vis הראה פס טיפוסי סביב 280 ננומטר המאפיין שאריות ארומטיות, טירוזין וטריפטופן, בעוד שספיגת הכרומופור נמצאה ב-488 ננומטר עבור EGFP, ו-493 ננומטר עבור NowGFP (איור 6A,B). ב-KillerOrange, אזור ספיגת הכרומופורים כלל שני פסים (איור 6C), המתאימים לשני מצבי תצורה ומטען אפשריים של הכרומופור המורכב. הפס סביב 510 ננומטר ידוע כמצב שממנו מתרחשת פלואורסצנציה עם תפוקה קוונטית גבוהה49,65. בגרסאות החלפת הפרולין נצפו הדברים הבאים: שילוב של Dhp לא שינה את ספקטרום הספיגה של EGFP ו- NowGFP, בעוד ש- S-Flp הפיק ספיגת UV משופרת. ניתן להסביר את זה על ידי הבדלים מושרים במיקרו-סביבה של שאריות טריפטופן, במיוחד Trp57 דחוקה בין שלושה S-Flp במוטיב PVPWP (איור 6A,B)69. עם זאת, הסבר טריוויאלי יותר לספיגת UV גבוהה יותר עשוי לנבוע מחלק מוגבר של חלבון מקופל בצורה לא נכונה. מאחר שריכוז החלבון הוערך על ידי כימות של תכונות ספיגה, נוכחות של חלבון עם כרומופור בוגר בצורה לא נכונה יכולה להגביר את הספיגה, בעוד שחלק זה אינו נספר בריכוז הכולל (איור 6A,B). בתמיכה בהשערה זו, ראינו כי ה-EGFP המכיל S-Flp הציג יחס מופחת במידה ניכרת של כרומופור לעומת ספיגה משולבת של טריפטופן וטירוזין (ε(CRO)/ε(Tyr+Trp) = 0.96) בהשוואה לערך גבוה יותר (1.57) בחלבון האב (טבלה 2)70. נוכחותו של שבר שאינו פלואורסצנטי ב-EGFP המכיל S-Flp תהיה גורם תורם חשוב לניתוח נוסף של תכונות החלבון. בגרסת KillerOrange המכילה S-Flp נצפתה ספיגה משופרת לצד תזוזה אדומה בפס הכרומופור. עובדה זו הצביעה על כך שהיווצרות הכרומופור העדיפה תצורה עם תפוקה קוונטית פלואורסצנטית גדולה (איור 6C). לאחר מכן, ניתחנו את הספקטרום הפלואורסצנטי של החלבונים שנרשמו בעת עירור באורכי הגל המתאימים לספיגה מקסימלית. התוצאות מראות כי הספקטרום נותר זהה במהותו עבור גרסאות החלבון הפלואורסצנטיות שנבדקו, הנושאות פרולין ותחליפים, S-Flp ו-Dhp. תוצאה זו מרמזת על כך שהאנלוגיות לא שינו את הסביבה הכימית של הכרומופור בכל מקרה (איור 6G-I). למרות עובדה זו, הבדלים ניכרים נצפו בספקטרום הפלואורסצנטי של KillerOrange שתועד עם עירור במהירות של 295 ננומטר, ומכאן עם עירור טריפטופן. ניסוי זה עוקב אחר העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET) או צימוד אקסיטוני ישיר המתרחש בין שרשראות הצד של טריפטופן לבין הכרומופור הבוגר מכיוון ששניהם ממוקמים במרחק קצר של לא יותר מ-25 Å. עבור גרסאות EGFP ו-NowGFP, כאשר ספקטרום הפליטה נמדד באמצעות עירור של 295 ננומטר, נצפתה פליטת כרומופור חזקה לצד כמעט פליטת טריפטופן (איור 6D,E). עם זאת, הווריאנטים שהכילו S-Flp הציגו פליטה מעט גדולה יותר ספציפית לטריפטופן. תצפית זו יכולה להיות קשורה לתרומה לא מדווחת של האפופרוטאין המתגלגל המכיל טריפטופנים אך לא את הכרומופור הבוגר. פליטה ספציפית לטריפטופן מוגברת באופן משמעותי נצפתה ב-KillerOrange, מה שמצביע על היעדר מרווה פלואורסצנטית באמצעות המנגנון הצפוי של העברת אנרגיית עירור או צימוד אקסיטוני. גרסאות החלבון שהכילו פרולין ו-S-Flp הציגו פליטת טריפטופן דומה לצד התכונה הפלואורסצנטית האדומה המועדפת של תפוקה קוונטית גבוהה. לעומת זאת, הווריאנט שהכיל Dhp הראה ירידה דרסטית בעוצמת הפלואורסצנציה של הכרומופור, ככל הנראה בשל השפעות מבניות קלות (איור 6F). לאחר מכן, השווינו את תכונות הקיפול של החלבונים על ידי ביצוע ניסוי התגלגלות/רנטורציה. ספקטרום פליטה פלואורסצנטית נרשם במצב מקופל (פרוטוקול סעיף 5), לאחר דנטורציה כימית, ולאחר מכן, בתהליך של שיפוץ מנוטר במשך תקופה של 24 שעות (פרוטוקול סעיף 6). הספקטרום תועד עם עירור בשני אורכי הגל הרלוונטיים, 295 ננומטר, ובמקסימום של ספקטרום הספיגה של הכרומופורים, בעוד שהפלואורסצנציה המתקבלת מוצגת כמנורמלת לערך המרבי עבור כל חלבון (איור 7). בסוף הפרוטוקול, ראינו כי וריאנטים של EGFP יכולים להתפרק מחדש, בעוד שווריאנטים של NowGFP ו- KillerOrange – לאחר שעברו דנטורציה – נותרו פתוחים (הנתונים לא מוצגים). לפיכך, יכולות השיפוץ של החלבונים הפלואורסצנטיים המקוריים השתנו באופן משמעותי. יש לציין כי KillerOrange פותחה כ-photoensitizer החל מגרסת הכרומופרוטאין ההידרוזואית KillerRed65,71, וההתפרקות שלו בדרך כלל מפגרת מאחור למרות המבנה החזק של β-חבית. בניסויים שלנו, מצאנו שהפלואורסצנציה של כרומופור EGFP מסוג פראי התאוששה רק באופן חלקי, אם כי הפלואורסצנציה הספציפית לטריפטופן הייתה גדולה יותר לאחר שינוי שם (איור 7A,D). למעשה, התנהגות דומה נצפתה בווריאנט המכיל Dhp (איור 7C,F). ב-EGFP המכיל S-Flp נצפתה תוצאה דומה כאשר העירור בוצע באורך הגל הספציפי לטריפטופן של 295 ננומטר (איור 7B). באופן מדהים, הפלואורסצנציה התאוששה להתארכות גבוהה בהרבה כאשר הכרומופור התרגש במהירות של 488 ננומטר (איור 7E). נראה כי S-Flp גורם לתפוקה הרבה יותר טובה של שיפוץ בהשוואה לשתי הגרסאות האחרות. עם זאת, השפעה מועילה זו לא נראתה בעת שימוש בעירור של 295 ננומטר עקב אינטראקציות מולקולריות לא ידועות. לאחר מכן, מהירות השיפוץ הייתה מנוטרת על ידי רישום פלואורסצנטיות הן של טריפטופן והן של הכרומופור, בנפרד, בעוד שנקודת הקצה של התהליך נקבעה ב -24 שעות לאחר תחילת הרנטורציה. רק וריאנטים של EGFP הראו קינטיקה מהירה יחסית שניתן היה להעריך באופן אמין, בעוד שאף אחת מווריאנטים של NowGFP ו-KillerOrange שעברו דנטורציה לא הצליחה להתאושש לערך שאיפשר מדידות כמותיות נוספות. ב-EGFP, התאוששות הפליטה של טריפטופן הייתה מהירה פי שניים (הושלמה ב-750 שניות) בהשוואה להתאוששות פליטת הכרומוזורים (שהושלמה ב-1,500 שניות), מה שמצביע על המורכבות של התהליכים הבסיסיים (איור 8). בשני אורכי הגל של העירור, קצב ההשבה הועלה על ידי נוכחותו של S-Flp, בהסכמה עם נתוני הספרות25. במקביל, הגרסה המכילה Dhp הראתה פרופיל רפרולינג הדומה לסוג פראי. איור 1: פיגומים מבניים של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), בניית כרומופורים, מעברים קונפורמיים פרולין ואנלוגיות סינתטיות ששימשו במחקר זה. (A) המבנה של GFP מורכב מגדילי β היוצרים חבית כמעט מושלמת (כלומר, “פחית” עם ממדים של 4.2 ננומטר x 2.4 ננומטר) המכוסה בשני הקצוות על ידי מכסים סליליים α. החלבון 27 kDa GFP מראה מבנה שלישוני המורכב מאחד עשר גדילי β, שני α קצרים וכרומופור באמצע. המצבים הקונפורמיים של פרולים סמוכים קשורים להיווצרות כרומופור. (B) התבגרות אוטוקטליטית (עיבוי) של הכרומופור מתרחשת בשאריות Ser65, Tyr66 ו-Gly67, וממשיכה במספר שלבים: ראשית, התאמות פיתול בעמוד השדרה הפוליפפטידי כדי להביא את פחמן הקרבוקסיל של Thr65 לקרבת חנקן האמיד של Gly67. לאחר מכן, היווצרותה של מערכת טבעת אימידזולין-5-אחת הטרוציקלית מתרחשת עם התקפה נוקלאופילית על אטום פחמן זה על ידי חנקן אמיד של גליצין והתייבשות לאחר מכן. לבסוף, המערכת מקבלת פלואורסצנציה נראית לעין כאשר חמצון של קשר הפחמן טירוזין אלפא-בטא על ידי חמצן מולקולרי מוביל להרחבת המערכת המצומדת של מערכת הטבעות האימידזולינית, בסוף כולל טבעת פניל טירוזין ותחליף הפרא-חמצן שלה. הכרומופור para-hydroxybenzylidene imidazolinone שנוצר כתוצאה מכך במרכז β-חבית מופרד לחלוטין מהממס בתפזורת. (C) נוסחאות מבנה השלד והגיאומטריות של 1) טבעת הפרולין (puckers) ו-2) קשר האמיד הקודם מייצג את המעברים הקונפורמיים העיקריים של שאריות הפרולין. (D) האנלוגיות הפרולין המשמשות בעבודה זו עם הנקבים המיועדים לטבעת פרולין. הדמות נוצרה באמצעות ChemDraw ו-Discovery Studio Visualizer. מבנה ה- GFP הוא מערך מבנה PDB 2Q6P. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 2: חלבונים פלואורסצנטיים המשמשים במחקר זה. הלוחות מציגים את ייצוג הסרט של המבנים האופייניים β-חבית של שלוש גרסאות שונות של חלבונים פלואורסצנטיים: EGFP, NowGFP ו-KillerOrange, כאשר צבע הסרט מייצג את צבע הפליטה הפלואורסצנטית של כל גרסה. שאריות פרולין (קוד בן אות אחת) מודגשות כמקלות, והתנוחות המתאימות מבוארות. כרומופורים מוצגים עם הרכב ראשוני של חומצות אמינו מודגשות. כל ייצוגי המבנה הופקו עם PyMol בהתבסס על ערכי המבנה הבאים של PDB: 2Q6P עבור EGFP, 4RYS עבור NowGFP, 4ZFS עבור KillerOrange. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 3: הצגת תרשים זרימה של שיטת SPI לשילוב ספציפי לשאריות של אנלוגים פרוליניים שאינם קנוניים. זן מארח פרולין-אוקסוטרופי Escherichia coli (E. coli) הנושא את הגן המעניין על פלסמיד ביטוי גדל בתווך מינימלי מוגדר עם כל 20 חומצות האמינו הקאנוניות עד שמגיעים ל-OD600 של כ-0.7 שבו תרבית התא נמצאת בשלב הצמיחה הלוגריתמי האמצעי. התאים נקטפים ומועברים למדיום מינימלי טרי המכיל 19 חומצות אמינו קנוניות ואנלוגיה פרולין. לאחר הוספת משרה, ביטוי חלבון מבוצע בן לילה. לבסוף, חלבון המטרה מבודד על ידי ליזה של התא ומטוהר לפני ניתוח נוסף. בווריאציה של הפרוטוקול, התאים גדלים במדיום מינימלי מוגדר עם 19 חומצות אמינו קנוניות, ופרולין מתווסף בכמות מוגבלת (למשל, חמישית מהריכוז של חומצות האמינו האחרות). על ידי מדד זה, התאים ממצים פרולין בתווך לפני שהם יכולים לצאת משלב הצמיחה הלוגריתמית, ואז, לאחר מכן, האנלוגי מתווסף, ואת החלבון של ייצור עניין הוא מושרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 4: ניתוח ביטויים של גרסאות EGFP, NowGFP ו-KillerOrange. (A) כדורי תאים מ-1 מ”ל של תרבית ביטוי, מנורמלים ל-OD600 =2. ניתוח SDS-PAGE של (B) EGFP, (C) NowGFP, ו- (D) וריאנטים של KillerOrange. שברים מסיסים (S) ובלתי מסיסים (I) של כל נגזר חלבון פלואורסצנטי הועמסו על 15% ג’ל אקרילאמיד, כמו גם שברים חמקמקים (E) מ-IMAC של חלבונים מסיסים. סולם החלבון הלא מוכתם PageRuler שימש כסמן (M) בנתיבים המסומנים על ידי (M). האזורים הצפויים של החלבון המסוים ממוסגרים. חומצות אמינו משולבות במיקומים פרוליניים מוצגות Pro, R-Flp, S-Flp ו-Dhp (ב- (A) כדורי תאים מגרסאות חלבון פלואורסצנטיות המשלבות Dfp במקום Dhp). הג’לים הוכתמו ב-1% (w/v) Coomassie Brillant Blue. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 5: ניתוח ספקטרומטרי של מסה של וריאנטים של חלבונים פלואורסצנטיים. (A) ספקטרום ESI-MS מייצג של EGFP (שחור), S-Flp-EGFP (כתום) ו-Dhp-EGFP (ציאן) עם מיקום פסגות המסה העיקריות המסופקות כמספרים (ב-Da). המסות המולקולריות המחושבות [M+H]+ של החלבונים המתויגים H6 הן: עבור EGFP 27,745.33 Da (נצפה 27,746,15 Da); עבור S-Flp-EGFP 27,925.33 Da (נצפה 27,925.73 Da); עבור Dhp-EGFP 27,725.33 Da (נצפה 27,726.01 Da). (B) ספקטרום ESI-MS מייצג של ESI-MS מתויגב-6 של NowGFP (שחור), S-Flp-NowGFP (כתום) ו-Dhp-NowGFP (ציאן) עם מיקום פסגות המסה העיקריות המסופקות כמספרים (ב-Da). המסות המחושבות של החלבונים המתויגים H6 הן: עבור NowGFP 27,931.50 Da (נצפה 27,946.46 Da; ההפרש של ~16 Da נובע ככל הנראה מחמצון של מתיונין בחלבון); עבור S-Flp-NowGFP 28,129.50 Da (נצפה 28,130.08 Da); עבור Dhp-NowGFP 27,909.50 Da (נצפה 27,910.22 Da). (C) ספקטרום ESI-MS מייצג של ESI-MS מתויג של H6-מתויג KillerOrange (שחור), S-Flp-KillerOrange (כתום) ו- Dhp-KillerOrange (ציאן) עם המיקום של פסגות המסה העיקריות המסופק כמספרים (ב- Da). המסות המחושבות של החלבונים המתויגים H6 הן: עבור KillerOrange 27,606.09 Da (נצפה 27,605.91 Da); עבור S-Flp-KillerOrange 27,876.09 Da (נצפה 27,876.08 Da); עבור Dhp-KillerOrange 27,576.09 Da (נצפה 27,575.93 Da). סטיות בין המסות המולקולריות הנצפות והמחושבות של כ-1 Da נמצאות בטווח השגיאות של ציוד ESI-MS. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 6: ספקטרום ספיגת אור ופליטת פליטה פלואורסצנטית של גרסאות חלבון פלואורסצנטיות. ספקטרום ספיגת UV-Vis מנורמל מוצג עבור הגרסאות (A) של EGFP, (B) של NowGFP ו- (C) של KillerOrange. הספקטרום נורמל למקסימום של ספיגת כרומופור (כ-500 ננומטר). ספקטרום פליטת פלואורסצנציה מנורמל מוצג של הגרסאות (D,G) של EGFP, (E,H) של NowGFP, ו -(F,I) של KillerOrange. הספקטרום ב- (D,E,F) נמדד עם עירור עם אור אולטרה סגול (295 ננומטר), עבור הספקטרום ב -(G,H,I) 488 ננומטר, 493 ננומטר ו-510 ננומטר אור שימשו לעירור, בהתאמה, והספקטרום נורמל למקסימה המתאימה של פליטת כרומופור (כ-500 ננומטר). בכל פאנל, עקומות שחורות מתאימות לספקטרום של וריאנט החלבון הפלואורסצנטי עם פרולין מקורי, עקומות כתומות מציינות את הספקטרום של חלבונים שהוחלפו ב-S-Flp, וקימורים כחולים מתאימים לחלבונים שהוחלפו ב-Dhp. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 7: ספקטרום פליטה פלואורסצנטית של וריאנטים של EGFP בניסויים חוזרים. ספקטרום פליטה פלואורסצנטי מנורמל של תמיסות 0.3 μM של וריאנטים של חלבונים פלואורסצנטיים במצב הטבעי ולאחר דנטורציה ושיפוץ: ספקטרה ב -(A,B,C) נמדדה בעת עירור עם אור אולטרה סגול (295 ננומטר ) (A) עבור EGFP, (B) עבור S-Flp-EGFP, ו- (C) עבור Dhp-EGFP. ספקטרום ב – (D,E,F) נמדד על ידי עירור עם אור ירוק (488 ננומטר) (D) עבור EFGP, (E) עבור S-Flp-EGFP, ו- (F) עבור Dhp-EGFP. ספקטרום הפליטה של הדגימות המקוריות (עקומות שחורות) והדגימות המחודשות (ירוק מתאים ל-EGFP, כתום ל-S-Flp-EGFP וכחול ל-Dhp-EGFP, בהתאמה) של כל וריאנט חלבון מנורמלים לפלואורסצנטיות המרבית של מצב הילידים המתאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 8: ניטור קיפול חלבונים והבשלת כרומופור של וריאנטים של EGFP עם פלואורסצנציה. (A) פליטה פלואורסצנטית באזור הפלואורסצנציה של Trp (הפליטה נקבעה ל-330 ננומטר) שנרשמה בעת עירור עם אור אולטרה סגול (295 ננומטר). (B) פיתוח משרעת פלואורסצנטית באזור פליטת הכרומוזורים עם עירור באור ירוק (488 ננומטר). עקבות הפלואורסצנציה התלויים בזמן נורמלו לאחדות (100%) על פי משרעת הפלואורסצנציה שהושגה בסוף מרווח הניטור. בכל פאנל, עקומות שחורות תואמות לספקטרום של גרסת החלבון הפלואורסצנטי עם פרולין מקומי, עקומות כתומות מציינות את הספקטרום של חלבונים תחליפי S-Flp ועקומות כחולות תואמות לחלבונים שהוחלפו ב-Dhp. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. מבנה רצפי חומצות אמינו (6xהתג קו תחתון): EGFP-H6 MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKHHHHHH H6-NowGFP MRGSHHQHHHGSVSKGEKLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKMSLKFICTTGKLPVPWPTLKTTLTWGMQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGVDFKEDGNILGHKLEYNAISGNANITADKQKNGIKAYFTIRHDVEDGSVLLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKQSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGIPLGADELYK H6-רוצחאורנג’ MRGSHHHHHHGSECGPALFQSDMTFKIFIDGEVNGQKFTIVADGSSKFPHGDFNVHAVCETGKLPMSWKPICHLIQWGEPFFARYPDGISHFAQECFPEGLSIDRTVRFENDGTMTSHHTYELSDTCVVSRITVNCDGFQPQPDGPIMRDQLVDILPSETHMFPHGPNAVRQLAFIGFTTADGGLMMGHLDSKMTFNGSRAIEIPGPHFVTIITKQMRDTSDKRDHVCQREVAHAHSVPRITSAIGSDQD טבלה 1: מבנים ראשוניים של חלבוני המטרה. התגים שלו מסומנים בקו תחתון בכל רצף. λ [nm] ε [M-1·cm-1] (EGFP) ε [M-1·cm-1] (S-Flp-EGFP) ε [M-1·cm-1] (Dhp-EGFP) 488 (≡ CRO) 31,657 (± 1,341) 22,950 (± 290) 27,800 (± 542) 280 (≡ צור+טרפ) 20,116 (± 172) 23,800 (± 715) 17,300 (± 554) ערכים עבור מקדם הכחדה ε (ב- M-1·cm-1) מחושבים מתוך ספקטרום ספיגת UV-Vis מתועד של גרסאות EGFP מתאימות באמצעות ריכוזי חלבונים ידועים. אורך גל נבחר של 280 ננומטר מתאים לספיגה המרבית של שאריות ארומטיות, טירוזין וטריפטופן, ו-488 ננומטר מייצג את אורך הגל של ספיגת הכרומופורים. טבלה 2: מקדמי הכחדה (ε) של גרסאות EGFP באורכי גל נבחרים. הערכים עבור מקדם ההכחדה ε (ב-M-1·cm-1) מחושבים מתוך ספקטרום ספיגת UV-Vis מתועד של גרסאות EGFP מתאימות באמצעות ריכוזי חלבונים ידועים. אורך הגל הנבחר של 280 ננומטר מתאים לספיגה המרבית של שאריות ארומטיות, טירוזין וטריפטופן, בעוד ש-488 ננומטר מייצג את אורך הגל המרבי של בליעת כרומופורים. חומר משלים: הכנת פתרונות מלאי וכריות אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

Discussion

בטבע, מניפולציות עם מבנים ותפקודים של חלבונים מתרחשות בדרך כלל עקב מוטציות, התופעה שמובילה לחילופי זהות של חומצת אמינו במיקומים מסוימים ברצף החלבונים. מנגנון טבעי זה מיושם באופן נרחב כשיטה ביוטכנולוגית להנדסת חלבונים בצורה של מוטגנזה, והוא מסתמך על הרפרטואר של 20 חומצות האמינו הקאנוניות המעורבות בתהליך. עם זאת, חילופי שאריות פרולין הם בעייתיים. בשל ארכיטקטורת קבוצת עמוד השדרה המיוחדת שלה, היא כמעט ואינה ניתנת להחלפה עם 19 השאריות הנותרות להחלפה72. לדוגמה, פרולין ידוע בדרך כלל כמפסק מבנה משני ברצפי פוליפפטידים בגלל תאימותו הלקויה למבנים המשניים הנפוצים ביותר, כלומר, α-סליל ו-β גדילים. תכונה זו של פרולין הולכת לאיבוד בקלות כאשר השאריות עוברות מוטציה לחומצת אמינו אחרת מהרפרטואר הנפוץ. החלפת הפרולין באנלוגיה הכימית שלה מציעה גישה חלופית, המאפשרת לשמור על תכונות עמוד השדרה הבסיסיות של שאריות הפרולין האב תוך הטלת הטיה על המעברים הקונפורמיים הספציפיים שלה או הפקת אפנון של הנפח המולקולרי והקוטביות. לדוגמה, ניתן לספק תרביות חיידקים עם מבנים אנלוגיים כגון הידרוקסי-, פלואורו-, אלקיל-, דהידרופרולינים, מבנים בעלי גדלי טבעות משתנים ועוד, ובכך להקל על ייצור של חלבון המכיל שינויים ספציפיים בשאריות פרולין.

שיטת שילוב הלחץ הסלקטיבי (SPI) המתוארת במחקר זה מאפשרת החלפה גלובלית, כלומר ספציפית לשאריות, של כל הפרולינים בחלבון המטרה באנלוגיות כימיות קשורות. חשיבות השיטה משתקפת בכך ש-SPI מאפשר יצירת שינויי רצף שאינם נגישים לטכניקות מוטגנזה נפוצות. לדוגמה, הוא מאפשר ייצור של חלבון מטרה המכיל שינויים מבניים קטנים למדי, שבדרך כלל עשויים שלא לעלות על תחליפי אטום אחד או שניים / מחיקות / תוספות, כפי שהודגם במחקר זה. שינויים חלבוניים כאלה מכונים “מוטציות אטומיות”73,74. בחלבון פלואורסצנטי כגון GFP, ניתן לראות את התוצאה של חדירה מולקולרית זו במהירות הקיפול, הקטבים המקומיים, אריזת החלבון, היציבות של התכונות המבניות המעורבות. השינויים בתכונות הספיגה והפלואורסצנציה מופקים בעקיפין בשל ההשפעה על קיפול חלבונים ומיקרו-סביבה של שאריות. הדיוק של השינויים המולקולריים המבוצעים על ידי SPI הוא בדרך כלל גבוה בהרבה, בהשוואה למוטציות של פרולינים לשאריות קנוניות אחרות, כאשר האחרונה בדרך כלל מזיקה לקיפול החלבון, ייצורו ובידודו.

כשיטת ייצור, גישת SPI משתמשת בסובלנות המצע של כיס הסינתאז אמינואציל-tRNA לכיוון אנלוגים כימיים של חומצת האמינו המקומית. הסינתאז אחראי לזיהוי נכון של מבנה חומצות האמינו, בעוד שהשילוב בחלבונים מתרחש במורד הזרם בתהליך התרגום. באופן אינסטרומנטלי, הייצור, הבידוד והטיהור של חלבונים ב-SPI מבוצעים באופן אופייני לכל טכניקות ביטוי אחרות של חלבונים רקומביננטיים; עם זאת, עם כמה תוספות לפרוטוקול כדלקמן: פרולין, אשר מחויב להחלפה, מסופק בתחילת תהליך התסיסה, כך שהתאים יכולים לגדול ולפתח את המנגנון התאי שלם שלהם. עם זאת, תרבית התאים אינה רשאית להגיע לצפיפות האופטית המקסימלית, כדי לשמור על התאים בפאזה הלוגריתמית אופטימלית לביטוי חלבונים. ישנן שתי וריאציות עיקריות של שיטת SPI בשלב זה. בראשון, ריכוז הפרולין מותאם בתווך הצמיחה הראשוני (תווך מוגדר כימית) כך שהתדלדלות של פרולין מתרחשת ללא כל חדירה חיצונית. התאים ממצים את הפרולין בתווך לפני שהם יכולים לצאת משלב הגדילה הלוגריתמית, ואז, לאחר מכן, מוסיפים את האנלוגיה, ומשרים את החלבון של ייצור העניין. בגרסה השנייה של השיטה, התאים גדלים בתווך המכיל פרולין עד אמצע הפאזה הלוגריתמית שלהם. בשלב זה, יש להוציא את התאים ולהעבירם פיזית למדיום אחר, שאינו מכיל עוד פרולין, רק את האנלוגי, עם אינדוקציה עוקבת של החלבון המעניין. בשתי הגרסאות, ריאגנט האינדוקציה האנלוגי והחלבון מסופקים לתאים שגדלו מראש. הבידוד והטיהור של החלבון מסוג בר מבוצעים באותו אופן כמו עבור הווריאנטים. באופן עקרוני, כל זן Pro-auxotrophic זמין יכול לשמש כמארח ביטוי. עם זאת, מומלץ מבחני ביטוי לזיהוי המארח המתאים ביותר. כמו כן, ניתן להשתמש בבדיקות של מדיה שונה המוגדרת כימית כדי לייעל את תפוקת החלבון.

ישנן דרישות מסוימות לגבי האנלוגיות הכימיות שיש לקחת בחשבון עבור SPI, כגון מסיסות וריכוז. הזמינות המטבולית והספיגה של חומצות אמינו תלויות במספר המולקולות המומסות במדיום. כדי להגדיל את המסיסות של תרכובת מסוימת, ניתן לבחור תנאים חומציים או בסיסיים מעט. מאחר שהמולקולות המלאכותיות עלולות לגרום להשפעות מעכבות גדילה בשל רעילות התאים שלהן, יש להוריד את הריכוז למינימום על מנת למנוע עקה75 של התאים.

חולשה קלה של SPI היא ירידה ביעילות ההתאגדות עם מספר גדול יותר של עמדות שיש להחליף. באופן עקרוני, הפחתה של תדירות חומצות האמינו בתוך הביו-מולקולה של המטרה על ידי מוטגנזה מכוונת אתר יכולה לפתור בעיה זו. עם זאת, התכונות המבניות והתפקודיות של חלבון רצוי עשויות להיות מושפעות משינוי המבנה הראשוני.

כאמור, SPI מאפשר החלפה ספציפית לשאריות של חומצת האמינו הקנונית. משמעות הדבר היא שחומצות אמינו שאינן קנוניות מוכנסות לכל מיקום של חומצת האמינו הקנונית בתוך חלבון המטרה, כולל שאריות שמורות החיוניות לתפקוד החלבון או לקיפולו. שיטות חלופיות לשילוב ספציפי לאתר הן האפשרות היחידה להתגבר על בעיה זו3. בעשורים האחרונים פותחה שיטת הזוג האורתוגונלי שיכולה לייצר חלבונים המכילים שאריות מעובדות באתרים מוגדרים מראש. השינוי הנפוץ ביותר בשיטה זו ידוע בשם דיכוי קודון עצירה. שיטה זו מבוססת על מערכת תרגום אורתוגונלית מהונדסת המוקדשת לשילוב ספציפי לאתר של חומצות אמינו סינתטיות76. יותר מ-200 חומצות אמינו עם שינויים שונים בשרשרת הצדדית שולבו בחלבונים עד כה באמצעות גישה זו77. עם זאת, מערכות תרגום אלה עדיין אינן מתאימות להכנסת אנלוגים פרולין לחלבוני מטרה. יתר על כן, ביצועי השיטה נחשבים נמוכים במקרה של שינויים קלים בחומצות אמינו מכיוון שהפקרות מסוימת ברקע של סינתזת אמינואציל-tRNA נשארת בדרך כלל במערכות התרגום המהונדסות.

באמצעות SPI, ייצרנו מספר גרסאות של חלבונים פלואורסצנטיים β חבית וחקרנו את התוצאות של חילופי פרולין עם האנלוגיות הלא טבעיות שלו. במקרה של החלפת פרולין עם R-Flp ו- Dfp, חלבון לא מתפקד הופק על ידי מארח הביטוי. ההשפעה נוצרת ככל הנראה על ידי קיפול שגוי של חלבונים. ייתכן שמקורו של האחרון הוא בקונפורמציה C 4-exo המקודמת על ידי R-Flp, שאינה שלילית על ידי מבני חלבון האב27. עם Dfp, סביר להניח שהקיפול השגוי ייווצר על ידי המהירות המופחתת של איזומריזציה של קשרים פפטידיים טרנס-עד-ציס בשאריות פרולין27. האחרון ידוע כאחד השלבים המגבילים בפרופיל הקינטי של קיפול החלבון המשפיע על היווצרות β-חבית ועל התבגרות הכרומופורים שלאחר מכן. ואכן, עבור שתי חומצות האמינו, R-Flp ו-Dfp, ייצור החלבון הביא לחלבון מצטבר ובלתי מסיס. כתוצאה מכך, היווצרות כרומופור לא יכלה להתרחש, והפלואורסצנציה אבדה לחלוטין. עם זאת, עם S-Flp ו-Dhp נצפתה הבשלה נכונה של חלבונים, וכתוצאה מכך דגימות חלבון פלואורסצנטיות עבור כל שילוב אנלוגי/חלבוני. למרות כמה אפנון בתכונות הספיגה והפלואורסצנציה של החלבון, אלה נשארו במידה רבה דומים לאלה של החלבונים מסוג בר. ההשפעה של תחליפי חומצות האמינו התגלתה במחקרי הקינטיקה המחודשת. זה האחרון הראה שיפוץ מהיר יותר במקרה של החלפה ב- S-Flp. מחקרי מודל הראו כי שאריות אלה עשויות ליצור שיפור מסוים במהירות הסיבוב של טרנס-טו-ציס אמיד ולהוביל להיווצרות הקונפורמציה C 4-endo. שני גורמים אלה עשויים לתרום להשפעות הקינטיות המועילות של שאריות אלה ב- EGFP. לעומת זאת, Dhp ייצר פרופילי קיפול קינטיים הדומים באופן מקסימלי לחלבון האב. מגוון התוצאות המיוצרות על ידי מוטציות אטומיות בלבד בחלבונים הפלואורסצנטיים שנבדקו ממחיש את הפוטנציאל של שיטת ייצור SPI בשינוי תכונות חלבון המטרה. לשינויים בחלבון המושרים על ידי החלפת פרולין באנלוגיות יש השלכות נוספות על הנדסת האנזימים 78,79,80 ותעלות היונים 81,82, כמו גם בהנדסה הכללית של יציבות החלבון.

המגבלה הבסיסית של שיטת SPI היא מצב “הכל או אף אחד” שלה בהחלפת פרוליין שוכן עם אנלוגים קשורים. זה יהיה יתרון גדול להיות מסוגל לבחור במדויק, אילו שאריות פרולין יש להחליף עם אנלוגים, ואילו אלה צריכים להישאר ללא שינוי. עם זאת, נכון לעכשיו, אין טכניקה שיכולה לבצע הפקה מתוחכמת כזו באמצעות מארח ייצור מיקרוביאלי. סינתזה כימית של חלבונים83,84, כמו גם ייצור ללא תאים85,86, הן שתי השיטות החלופיות שיכולות לייצר שינויים פרולין ספציפיים למיקום. עם זאת, המורכבות התפעולית שלהם ותפוקת הייצור הנמוכה שלהם הופכים אותם לנחותים בהשוואה לייצור בתאים חיים. נכון לעכשיו, SPI נותרה הגישה הפשוטה והחזקה ביותר מבחינה תפעולית לייצור חלבונים מורכבים הנושאים מוטציות אטומיות. על ידי החדרת תחליפי חומצות אמינו לא טבעיות, השיטה מאפשרת לשנות את תכונות החלבון באופן ממוקד, כפי שמודגם כאן על ידי שינויים בקיפול ובספיגת אור / פליטה של חלבונים פלואורסצנטיים הנוצרים על ידי תחליפי פרולין.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית (אשכול מצוינות “איחוד מערכות בקטליזה) ל- T.F. ו- N.B. ועל ידי משרד החינוך והמדע הפדרלי (תוכנית BMBF “HSP 2020”, TU-WIMIplus Project SynTUBio) ל- F.-J.S. וט.מ.ת.ת.

Materials

Acetonitrile VWR HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 LC-MS grade required
Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30) Carl Roth 3029.1
Agar-agar Carl Roth 5210
Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4) Sigma-Aldrich 277908
Ammonium peroxydisulphate (APS) Carl Roth 9592.2 ≥98 %, p.a., ACS grade required
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) Sigma-Aldrich A4418
Ampicillin sodium salt Carl Roth K029
Biotin Sigma-Aldrich B4501
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670
Coomassie Brillant Blue R 250 Carl Roth 3862
Copper sulfate (CuSO4) Carl Roth CP86.1
D-glucose Carl Roth 6780
1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane, N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3 ≥99 %, p.a., for electrophoresis
1,4-dithiothreitol (DTT) Carl Roth 6908
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997
di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4) Carl Roth P749.1
di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) Carl Roth X987
DNase I Sigma-Aldrich D5025
Dowex 50WX8-100 (hydrogen form) Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.) 10731181 cation exchange resin
Ethanol Carl Roth 9065.1
Formic acid VWR HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 LC-MS grade required
Glacial acetic acid Carl Roth 3738.5 100 %, p. a.
Glycerol Carl Roth 3783
Imidazole Carl Roth X998
Hydrogen chlroide (HCl) Merck 295426
Iron(II) chloride (FeCl2) Sigma-Aldrich 380024
Isopropanol Carl Roth AE73.1
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Magnesium chloride (MgCl2) Carl Roth KK36.1
Magnesium sulfate (MgSO4) Carl Roth 8283.2
Manganese chloride (MnCl2) Sigma-Aldrich 63535
β-mercaptoethanol Carl Roth 4227.3
PageRuler Unstained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific 26614
Potassium chloride (KCl) Carl Roth 6781.3
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655
RNase A Carl Roth 7156
Sodium chloride (NaCl) Carl Roth P029
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) Carl Roth T879
Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4) Carl Roth 0183
Thiamine Sigma-Aldrich T4625
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma-Aldrich T6508
Tris hydrochloride (Tris-HCl) Sigma-Aldrich 857645
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris) Carl Roth 5429
Tryptone Carl Roth 8952
Yeast extract Carl Roth 2363
Zinc chloride (ZnCl2) Sigma-Aldrich 229997
L-alanine Sigma-Aldrich A7627
L-arginine Sigma-Aldrich A5006
L-asparagine Sigma-Aldrich A8381
L-aspartic acid Sigma-Aldrich A0884
L-cysteine Sigma-Aldrich C7352
L-glutamic acid Sigma-Aldrich G2128
L-glutamine Sigma-Aldrich G3126
L-glycine Sigma-Aldrich G7126
L-histidine Sigma-Aldrich H8000
L-isoleucine Sigma-Aldrich I2752
L-leucine Sigma-Aldrich L8000
L-lysine Sigma-Aldrich L5501
L-methionine Sigma-Aldrich M9625
L-phenylalanine Sigma-Aldrich P2126
L-proline Sigma-Aldrich P0380
L-serine Sigma-Aldrich S4500
L-threonine Sigma-Aldrich T8625
L-tryptophan Sigma-Aldrich T0254
L-tyrosine Sigma-Aldrich T3754
L-valine Sigma-Aldrich V0500
(4S)-fluoroproline Bachem 4033274 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression.
(4R)-fluoroproline Bachem 4033275 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
3,4-dehydroproline Bachem 4003545 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
4,4-difluoroproline Enamine EN400-17448 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-49B
Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000 Spectrum Medical Industries Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198
Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA GE Healthcare HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01
Luer-Lock syringe, 5 mL Carl Roth EP96.1
Luer-Lock syringe, 20 mL Carl Roth T550.1
Luer-Lock syringe, 50 mL Carl Roth T552.1
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL Eppendorf 30120086
Petri dishes (polystyrene, sterile) Carl Roth TA19
pQE-80L plasmid vector Qiagen no longer available replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915
Pro-auxotrophic E. coli strain JM83 Addgene 50348 https://www.addgene.org/50348/
Pro-auxotrophic E. coli strain JM83 ATCC 35607
Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL Fisher Scientific Corning Falcon, 14-959-1B
Syringe filter 0.45 µm with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Carl Roth CCY1.1
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS Sigma-Aldrich Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 µm particle size, 10 cm x 2.1 mm with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa
HPLC autosampler vials 1.5 mL Sigma-Aldrich Supelco 854165
Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS Agilent Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF
Mass spectrometry data analysis software Agilent MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00
Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf 5427 R
Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes Eppendorf 5810 R
Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system GE Healthcare ÄKTA pure 25 L
Fluorescence spectrometer Perkin Elmer LS 55
High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption Microfluidics LM series with “Z” type chamber
Orbital shaker for bacterial cultivation Infors HT Minitron
Peristaltic pump for liquid chromatography (LC) GE Healthcare P-1
Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption Omnilab Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182 with MS72 sonifier tip
UV-Vis spectrophotometer Biochrom ULTROSPEC 2100
UV-Vis/NIR spectrophotometer Perkin Elmer LAMBDA 950 UV/Vis/NIR
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agostini, F., Völler, J. -. S., Koksch, B., Acevedo-Rocha, C. G., Kubyshkin, V., Budisa, N. Biocatalysis with unnatural amino acids: Enzymology meets xenobiology. Angewandte Chemie (International ed. In English). 56 (33), 9680-9703 (2017).
  2. Minks, C., Alefelder, S., Moroder, L., Huber, R., Budisa, N. Towards new protein engineering: In vivo building and folding of protein shuttles for drug delivery and targeting by the selective pressure incorporation (SPI) method. Tetrahedron. 56 (48), 9431-9442 (2000).
  3. Hoesl, M. G., Budisa, N. Expanding and engineering the genetic code in a single expression experiment. Chembiochem: A, European Journal of Chemical Biology. 12 (4), 552-555 (2011).
  4. Wiltschi, B., Budisa, N. Natural history and experimental evolution of the genetic code. Applied Microbiology and Biotechnology. 74 (4), 739-753 (2007).
  5. Hoesl, M. G., et al. Lipase congeners designed by genetic code engineering. ChemCatChem. 3 (1), 213-221 (2011).
  6. . FPbase avGFP Available from: https://www.fpbase.org/protein/avgfp/ (2011)
  7. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
  8. Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418 (6895), 331-335 (2002).
  9. Misteli, T., Spector, D. L. Applications of the green fluorescent protein in cell biology and biotechnology. Nature Biotechnology. 15 (10), 961-964 (1997).
  10. Hanson, M. R., Köhler, R. H. GFP imaging: methodology and application to investigate cellular compartmentation in plants. Journal of Experimental Botany. 52 (356), 529-539 (2001).
  11. Sakamoto, S., Shoyama, Y., Tanaka, H., Morimoto, S. Application of green fluorescent protein in immunoassays. Advances in Bioscience and Biotechnology. 05 (6), 557-563 (2014).
  12. Akbar, M., Kim, H. Y. Green fluorescent protein tagging: A novel tool in biomedical research. Indian Journal of Biotechnology. 4, 466-470 (2005).
  13. Kobayashi, T., Morone, N., Kashiyama, T., Oyamada, H., Kurebayashi, N., Murayama, T. Engineering a novel multifunctional green fluorescent protein tag for a wide variety of protein research. PloS One. 3 (12), 3822 (2008).
  14. Kent, K. P., Oltrogge, L. M., Boxer, S. G. Synthetic control of green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (44), 15988-15989 (2009).
  15. Born, J., Pfeifer, F. Improved GFP variants to study gene expression in Haloarchaea. Frontiers in Microbiology. 10, 1200 (2019).
  16. Pakhomov, A. A., Martynov, V. I. GFP family: structural insights into spectral tuning. Chemistry & Biology. 15 (8), 755-764 (2008).
  17. Zimmer, M. Green fluorescent protein (GFP): applications, structure, and related photophysical behavior. Chemical Reviews. 102 (3), 759-781 (2002).
  18. Valbuena, F. M., Fitzgerald, I., Strack, R. L., Andruska, N., Smith, L., Glick, B. S. A photostable monomeric superfolder green fluorescent protein. Traffic. 21 (8), 534-544 (2020).
  19. Craggs, T. D. Green fluorescent protein: structure, folding and chromophore maturation. Chemical Society Reviews. 38 (10), 2865-2875 (2009).
  20. Maddalo, S. L., Zimmer, M. The role of the protein matrix in green fluorescent protein fluorescence. Photochemistry and Photobiology. 82 (2), 367-372 (2006).
  21. Cui, G., Lan, Z., Thiel, W. Intramolecular hydrogen bonding plays a crucial role in the photophysics and photochemistry of the GFP chromophore. Journal of the American Chemical Society. 134 (3), 1662-1672 (2012).
  22. Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
  23. Andrews, B. T., Roy, M., Jennings, P. A. Chromophore packing leads to hysteresis in GFP. Journal of Molecular Biology. 392 (1), 218-227 (2009).
  24. Xie, J. -. B., Zhou, J. -. M. Trigger factor assisted folding of green fluorescent protein. Biochemistry. 47 (1), 348-357 (2008).
  25. Steiner, T., Hess, P., Bae, J. H., Wiltschi, B., Moroder, L., Budisa, N. Synthetic biology of proteins: tuning GFPs folding and stability with fluoroproline. PloS One. 3 (3), 1680 (2008).
  26. Andrews, B. T., Schoenfish, A. R., Roy, M., Waldo, G., Jennings, P. A. The rough energy landscape of superfolder GFP is linked to the chromophore. Journal of Molecular Biology. 373 (2), 476-490 (2007).
  27. Kubyshkin, V., Davis, R., Budisa, N. Biochemistry of fluoroprolines: the prospect of making fluorine a bioelement. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 17, 439-460 (2021).
  28. Renner, C., Alefelder, S., Bae, J. H., Budisa, N., Huber, R., Moroder, L. Fluoroprolines as tools for protein design and engineering. Angewandte Chemie (International ed. In English). 40 (5), 923-925 (2001).
  29. Fukuda, H., Arai, M., Kuwajima, K. Folding of green fluorescent protein and the cycle3 mutant. Biochemistry. 39 (39), 12025-12032 (2000).
  30. Rosenman, D. J., et al. Green-lighting green fluorescent protein: faster and more efficient folding by eliminating a cis-trans peptide isomerization event. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 23 (4), 400-410 (2014).
  31. Vitagliano, L., Berisio, R., Mastrangelo, A., Mazzarella, L., Zagari, A. Preferred proline puckerings in cis and trans peptide groups: implications for collagen stability. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 10 (12), 2627-2632 (2001).
  32. Kubyshkin, V. Experimental lipophilicity scale for coded and noncoded amino acid residues. Organic and Biomolecular Chemistry. 19 (32), 7031-7040 (2021).
  33. Kubyshkin, V., Budisa, N. cis-trans-Amide isomerism of the 3,4-dehydroproline residue, the ‘unpuckered’ proline. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 12, 589-593 (2016).
  34. Budisa, N. Prolegomena to future experimental efforts on genetic code engineering by expanding its amino acid repertoire. Angewandte Chemie (International ed. In English). 43 (47), 6426-6463 (2004).
  35. Beatty, K. E., Tirrel, D. A. Noncanonical amino acids in protein science and engineering. Protein Engineering. Nucleic Acids and Molecular Biology. 22, (2009).
  36. Budisa, N. . Engineering the Genetic Code: Expanding the Amino Acid Repertoire for the Design of Novel Proteins. , (2006).
  37. Merkel, L., Budisa, N. Organic fluorine as a polypeptide building element: in vivo expression of fluorinated peptides, proteins and proteomes. Organic & Biomolecular Chemistry. 10 (36), 7241-7261 (2012).
  38. van Eldijk, M. B., van Hest, J. C. M. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids for protein engineering. Methods in Molecular Biology. 1728, 137-145 (2018).
  39. Hartman, M. C. T. Non-canonical amino acid substrates of E. coli aminoacyl-tRNA synthetases. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. , (2021).
  40. Gomez, M. A. R., Ibba, M. Aminoacyl-tRNA synthetases. RNA. 26 (8), 910-936 (2020).
  41. Grant, M. M., Brown, A. S., Corwin, L. M., Troxler, R. F., Franzblau, C. Effect of l-azetidine 2-carboxylic acid on growth and proline metabolism in Escherichia coli. Biochimica et Biophysica Acta. 404 (2), 180-187 (1975).
  42. Budisa, N., Steipe, B., Demange, P., Eckerskorn, C., Kellermann, J., Huber, R. High-level biosynthetic substitution of methionine in proteins by its analogs 2-aminohexanoic acid, selenomethionine, telluromethionine and ethionine in Escherichia coli. European Journal of Biochemistry. 230 (2), 788-796 (1995).
  43. Budisa, N., Pal, P. P. Designing novel spectral classes of proteins with a tryptophan-expanded genetic code. Biological Chemistry. 385 (10), 893-904 (2004).
  44. Hoesl, M. G., Budisa, N. Recent advances in genetic code engineering in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 751-757 (2012).
  45. Nickling, J. H., et al. Antimicrobial peptides produced by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57551 (2018).
  46. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. JoVE Science Education Database. , (2021).
  47. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. JoVE Science Education Database. , (2021).
  48. Sarkisyan, K. S., et al. fluorescent protein with anionic tryptophan-based chromophore and long fluorescence lifetime. Biophysical Journal. 109 (2), 380-389 (2015).
  49. Sarkisyan, K. S., et al. KillerOrange, a genetically encoded photosensitizer activated by blue and green light. PloS One. 10 (12), 0145287 (2015).
  50. Grigorenko, B. L., Krylov, A. I., Nemukhin, A. V. Molecular modeling clarifies the mechanism of chromophore maturation in the green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 139 (30), 10239-10249 (2017).
  51. Pletnev, V. Z., et al. Structure of the green fluorescent protein NowGFP with an anionic tryptophan-based chromophore. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 71, 1699-1707 (2015).
  52. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  53. Hörnsten, E. G. On culturing Escherichia coli on a mineral salts medium during anaerobic conditions. Bioprocess Engineering. 12 (3), 157-162 (1995).
  54. Davis, B. D. The Isolation of biochemically deficient mutants of bacteria by means of penicillin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 35 (1), 1-10 (1949).
  55. Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
  56. Wang, Y. -. S., et al. The de novo engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase for genetic incorporation of L-phenylalanine and its derivatives. Molecular bioSystems. 7 (3), 714-717 (2011).
  57. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE Science Education Database. , (2021).
  58. . ImageJ Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2021)
  59. Baumann, T., et al. Engineering ‘Golden’ fluorescence by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids and protein analysis by mass spectrometry and fluorescence. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57017 (2018).
  60. . FPbase NowFFP Available from: https://www.fpbase.org/protein/nowgfp/ (2021)
  61. Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PloS One. 6 (3), 17896 (2011).
  62. Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. Chromophore isomer stabilization is critical to the efficient fluorescence of cyan fluorescent proteins. Biochemistry. 56 (49), 6418-6422 (2017).
  63. Lelimousin, M., et al. Intrinsic dynamics in ECFP and Cerulean control fluorescence quantum yield. Biochemistry. 48 (42), 10038-10046 (2009).
  64. . FPbase mKillerOrange Available from: https://www.fpbase.org/protein/mkillerorange/ (2021)
  65. Pletneva, N. V., et al. Crystal structure of phototoxic orange fluorescent proteins with a tryptophan-based chromophore. PloS One. 10 (12), 0145740 (2015).
  66. Royant, A., Noirclerc-Savoye, M. Stabilizing role of glutamic acid 222 in the structure of Enhanced Green Fluorescent Protein. Journal of Structural Biology. 174 (2), 385-390 (2011).
  67. Larregola, M., Moore, S., Budisa, N. Congeneric bio-adhesive mussel foot proteins designed by modified prolines revealed a chiral bias in unnatural translation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421 (4), 646-650 (2012).
  68. Yamaguchi, H., Miyazaki, M. Refolding techniques for recovering biologically active recombinant proteins from inclusion bodies. Biomolecules. 4 (1), 235-251 (2014).
  69. Ghisaidoobe, A. B. T., Chung, S. J. Intrinsic tryptophan fluorescence in the detection and analysis of proteins: A focus on Förster resonance energy transfer techniques. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 22518-22538 (2014).
  70. Pal, P. P., et al. Structural and spectral response of Aequorea victoria green fluorescent proteins to chromophore fluorination. Biochemistry. 44 (10), 3663-3672 (2005).
  71. Pletnev, S., et al. Structural basis for phototoxicity of the genetically encoded photosensitizer KillerRed. The Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 32028-32039 (2009).
  72. Kubyshkin, V., Budisa, N. Anticipating alien cells with alternative genetic codes: away from the alanine world. Current Opinion in Biotechnology. 60, 242-249 (2019).
  73. Minks, C., Huber, R., Moroder, L., Budisa, N. Atomic mutations at the single tryptophan residue of human recombinant annexin V: effects on structure, stability, and activity. Biochemistry. 38 (33), 10649-10659 (1999).
  74. Budisa, N., Huber, R., Golbik, R., Minks, C., Weyher, E., Moroder, L. Atomic mutations in annexin V thermodynamic studies of isomorphous protein variants. European Journal of Biochemistry. 253, 1-9 (1998).
  75. Lin, X., Yu, A. C. S., Chan, T. F. Efforts and challenges in engineering the genetic code. Life. 7, (2017).
  76. Völler, J. -. S., Budisa, N. Coupling genetic code expansion and metabolic engineering for synthetic cells. Current Opinion in Biotechnology. 48, 1-7 (2017).
  77. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annual Review of Biochemistry. 79, 413-444 (2010).
  78. Lukesch, M. S., Pavkov-Keller, T., Gruber, K., Zangger, K., Wiltschi, B. Substituting the catalytic proline of 4-oxalocrotonate tautomerase with non-canonical analogues reveals a finely tuned catalytic system. Scientific Reports. 9 (1), 2697 (2019).
  79. Acevedo-Rocha, C. G., et al. Non-canonical amino acids as a useful synthetic biological tool for lipase-catalysed reactions in hostile environments. Catalysis Science & Technology. 3 (5), 1198 (2013).
  80. Holzberger, B., Marx, A. Replacing 32 proline residues by a non-canonical amino acid results in a highly active DNA polymerase. Journal of the American Chemical Society. 132 (44), 15708-15713 (2010).
  81. Mosesso, R., Dougherty, D. A., Lummis, S. C. R. Proline residues in the transmembrane/extracellular domain interface loops have different behaviors in 5-HT3 and nACh receptors. ACS Chemical Neuroscience. 10 (7), 3327-3333 (2019).
  82. Mosesso, R., Dougherty, D. A., Lummis, S. C. R. Probing proline residues in the prokaryotic ligand-gated ion channel, ELIC. Biochemistry. 57 (27), 4036-4043 (2018).
  83. Torbeev, V. Deciphering protein folding using chemical protein synthesis. Total Chemical Synthesis of Proteins. 1st ed. , (2021).
  84. Torbeev, V. Y., Hilvert, D. Both the cis-trans equilibrium and isomerization dynamics of a single proline amide modulate β2-microglobulin amyloid assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20051-20056 (2013).
  85. Kawakami, T., Ishizawa, T., Murakami, H. Extensive reprogramming of the genetic code for genetically encoded synthesis of highly N-alkylated polycyclic peptidomimetics. Journal of the American Chemical Society. 135 (33), 12297-12304 (2013).
  86. Cui, Z., Johnston, W. A., Alexandrov, K. Cell-free approach for non-canonical amino acids incorporation into polypeptides. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1031 (2020).

Tags

Proline AnalogNon-canonical Amino AcidProtein FoldingProtein StabilityMolecular SurgeryFluorescent ProteinSite-directed MutagenesisRibosomal Protein TranslationProtein EngineeringE. Coli CultureNMM MediumOptical DensityCell SuspensionCentrifugationAmino Acid DepletionAmpicillin

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Thi To, T. M., Kubyshkin, V., Schmitt, F., Budisa, N., Friedrich, T. Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How “Molecular Surgery” of the Backbone Affects Folding and Stability. J. Vis. Exp. (180), e63320, doi:10.3791/63320 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image