Trypanosoma cruzi veya Diğer Patojenik Organizmalardan DNA Tespiti için Kullanıma Hazır qPCR
Summary
Bu çalışma, reaksiyon kabına önceden yüklenebilen ve birkaç ay boyunca buzdolabında saklanabilen T. cruzi DNA tespiti için kullanıma hazır qPCR üretme adımlarını açıklamaktadır.
Abstract
Gerçek zamanlı PCR (qPCR), çok sayıda numuneden nükleik asit hedeflerinin dakika miktarlarını yükseltmeye olanak tanıyan son derece hassas ve hassas bir tekniktir. Birçok araştırma alanında yaygın olarak kullanılmış ve genetiği değiştirilmiş organizmaların (GDO) mahsullerinin mahsullerinde insan teşhisi ve özellik seçimi gibi alanlarda endüstriyel uygulama sağlamıştır. Ancak, qPCR hatasız bir teknik değildir. Tüm reaktiflerin daha sonra normal bir qPCR plakasının 96 kuyucuğuna dağıtılan tek bir ana karışımda karıştırılması, reaktiflerin yanlış karıştırılması veya kuyucuklara yanlış dağıtılması gibi operatör hatalarına yol açabilir. Burada, jelleştirme adı verilen bir teknik sunulmaktadır, bu sayede ana karışımda bulunan suyun çoğu, bir vakuma gönderildiğinde bir sol-jel karışımı oluşturan reaktiflerle ikame edilir. Sonuç olarak, qPCR reaktifleri oda sıcaklığında birkaç hafta veya 2-8 oC’de birkaç ay boyunca etkili bir şekilde korunur Her bir çözeltinin hazırlanmasının ayrıntıları, T. cruzi uydu DNA’sını (satDNA) tespit etmek için tasarlanmış jelleştirilmiş bir reaksiyonun beklenen yönüyle birlikte burada gösterilmiştir. Diğer organizmaları tespit etmek için benzer bir prosedür uygulanabilir. Jelleştirilmiş bir qPCR çalıştırması başlatmak, plakayı buzdolabından çıkarmak, numuneleri kendi kuyularına eklemek ve çalıştırmayı başlatmak kadar basittir, böylece tam plaka reaksiyonunun kurulum süresini, numuneleri yüklemek için gereken süreye düşürür. Ek olarak, jelize PCR reaksiyonları partiler halinde kalite için üretilebilir ve kontrol edilebilir, böylece zamandan tasarruf edilir ve rutin PCR reaksiyonları çalıştırılırken yaygın operatör hatalarından kaçınılabilir.
Introduction
Chagas hastalığı, 20. yüzyılın başlarında, yoksulluğun yaygın olduğu Brezilya’nın kırsal bölgelerinde keşfedildi 1,2. Bugün bile, hastalık Amerika’da sağlığın sosyal ve ekonomik belirleyicilerine bağlı olmaya devam etmektedir. Chagas hastalığı bifaziktir, akut ve kronik bir fazdan oluşur. Trypanosoma cruzi parazitinin enfeksiyonundan kaynaklanır, böcek vektörleri tarafından bulaşır, konjenital yolla kan transfüzyonu veya kontamine gıdaların oral alımı 3,4.
Chagas hastalığının teşhisi, klinik semptomların (özellikle Romaña belirtisi), kan yayma mikroskobu, seroloji ve gerçek zamanlı PCR (qPCR) veya izotermal amplifikasyon 4,5,6,7,8,9 gibi moleküler testlerin gözlemlenmesiyle yapılabilir. Klinik semptomlar ve kan yayma mikroskobu şüpheli akut enfeksiyon vakalarında kullanılırken, asemptomatik hastalarda antikor arayışı tarama aracı olarak kullanılmaktadır. Duyarlılığı ve özgüllüğü nedeniyle, qPCR’nin kronik hastalar için bir izleme aracı olarak, kandaki parazit yükünü ölçen tedavi gören akut hastalar için ve terapötik başarısızlığın vekil bir belirteci olarak kullanılması önerilmiştir 6,8,10,11,12 . Şu anda mevcut testlerden daha hassas ve spesifik olmasına rağmen, qPCR’nin nakliye ve depolama için donma sıcaklıklarının gerekliliği nedeniyle dünya çapında imtiyazsız bölgelerde tanılama araçları olarak bilinmesi etkili bir şekilde engellenmiştir13,14,15.
Bu engeli aşmak için, liyofilizasyon ve jelleştirme gibi koruma teknikleri araştırılmıştır16,17. Liyofilizasyon yıllarca koruma sağlarken, enzim stabilizasyonu / konservasyonu için yaygın olarak kullanılan gliserol varlığı olmadan özel olarak yapılmış reaktifler gerektirir18. Jelleşmenin aylarca koruma sağladığı gösterilmiş olsa da, düzenli reaktiflerin kullanılmasına izin verir19. Jelifikasyon çözeltisi, her biri proseste belirli rollere sahip dört bileşenden oluşur: şekerler trehaloz ve melozitoz, çözeltideki serbest su moleküllerini azaltarak kuruma işlemi sırasında biyomolekülleri korur, glikojen daha geniş bir koruyucu matris üretir ve amino asit lizini, biyomolekülün karboksili arasındaki oksitleyici reaksiyonları inhibe etmek için serbest radikal temizleyici olarak kullanılır, amino ve fosfat grupları. Bu bileşenler, kuruma işlemi sırasında üçüncül veya kuaterner yapının kaybını önleyen bir sol-jel karışımı tanımlar, böylece biyomoleküllerin rehidrasyon üzerine aktivitesini korumaya yardımcı olur19. Reaksiyon tüplerinin içinde stabilize edildikten sonra, reaksiyonlar normal -20 ° C yerine 2-8 ° C’de birkaç ay veya 21-23 ° C’de birkaç hafta saklanabilir. Bu yaklaşım, Chagas hastalığı, sıtma, leishmaniasis, tüberküloz ve siklosporiyazis13,14,15,20 gibi hastalıkların teşhisine yardımcı olmak için tasarlanmış testlere dahil edilmiştir.
Bu çalışma, jelleştirme prosedürü için gerekli çözümleri hazırlamak için tüm adımları, süreçteki tuzakları ve sekiz tüplü şeritler içinde kullanıma hazır jelleştirilmiş bir qPCR’nin beklenen son yönünü açıklamaktadır. Aynı protokol tek tüpler veya 96 delikli plakalar için uyarlanabilir. Son olarak, T. cruzi DNA’sının tespiti bir kontrol çalışması olarak gösterilecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Son yıllarda, tropikal ve ihmal edilmiş hastalıkların teşhisine yardımcı olmak için daha hassas ve spesifik teknolojiler bulma ihtiyacı vurgulanmıştır. Epidemiyolojik kontrol için önemli olmakla birlikte, parazitolojik (optik mikroskopi) ve serolojik testlerin özellikle duyarlılık ve bakım noktası uygulanabilirliği açısından sınırlamaları vardır. PCR, izotermal amplifikasyon ve ilgili varyasyonlar gibi DNA amplifikasyon teknikleri laboratuvar ortamlarında uzun zamandır kullanılmaktadır, anc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, vakumlu fırınla ilgili teknik yardım için Aline Burda Farias’a ve söz konusu ekipmana erişime izin verdikleri için Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Curitiba, Brezilya) yönetimine şükranlarını sunmak isterler. Bu çalışma kısmen hibe CNPq 445954/2020-5 tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Bentonite clay bags (activated) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) | 026157/STD | Not to be confused with silica gel packs |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysine | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nuclease-free water | preferred vendor | ||
| Oligonucleotides | preferred vendor | ||
| PCR mastermix | preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycler | preferred vendor | ||
| software for vacuum oven | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC | ||
| Vacuum oven | Memmert Gmbh | VO-400 |
References
- Lewinsohn, R. Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas’s disease). Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).
- Bern, C., et al. Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review. The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).
- Pereira, K. S., et al. Chagas’ disease as a foodborne illness. Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).
- Tanowitz, H. B., et al. Chagas’ disease. Clinical Microbiology Reviews. 5 (4), 400-419 (1992).
- Rassi, A., Marin-Neto, J. A. Chagas disease. Lancet. 375 (9723), 1388-1402 (2010).
- Ramírez, J. C., et al. Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients. The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).
- Rivero, R., et al. Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).
- Schijman, A. G. Molecular diagnosis of Trypanosoma cruzi. Acta Tropica. 184, 59-66 (2018).
- Besuschio, S. A., et al. Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation. Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).
- Duffy, T., et al. Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients. Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).
- Melo, M. F., et al. Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients. Parasites & Vectors. 8 (1), 154 (2015).
- Parrado, R., et al. Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).
- de Rampazzo, R. C. P., et al. A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs. Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).
- Rampazzo, R. C. P., et al. Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases. The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).
- Costa, A. D. T., et al. Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices. Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).
- Sun, Y., et al. Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis. Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).
- Kamau, E., et al. Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria. Malaria Journal. 13, 158 (2014).
- Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. Recent advances and further challenges in lyophilization. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).
- Rosado, P. M. F. S., López, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures. PubChem. , (2002).
- Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study. PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).
- Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR. Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).
- Iglesias, N., et al. Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR. Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).
- Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies. Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).
