QPCR pronto para uso para detecção de DNA de Trypanosoma cruzi ou outros organismos patogênicos
Summary
O presente trabalho descreve as etapas para a produção de qPCR pronta para uso para detecção de DNA de T. cruzi que pode ser pré-carregada no vaso de reação e armazenada na geladeira por vários meses.
Abstract
A PCR em tempo real (qPCR) é uma técnica notavelmente sensível e precisa que permite amplificar quantidades minúsculas de alvos de ácido nucleico a partir de uma infinidade de amostras. Tem sido amplamente utilizado em muitas áreas de pesquisa e alcançou aplicação industrial em campos como diagnóstico humano e seleção de características em culturas de culturas de culturas de organismos geneticamente modificados (OGM). No entanto, a qPCR não é uma técnica à prova de erros. A mistura de todos os reagentes em uma única mistura mestra subsequentemente distribuída em 96 poços de uma placa qPCR regular pode levar a erros do operador, como mistura incorreta de reagentes ou dispensação imprecisa nos poços. Aqui, é apresentada uma técnica chamada gelificação, em que a maior parte da água presente na mistura mestre é substituída por reagentes que formam uma mistura sol-gel quando submetida a vácuo. Como resultado, os reagentes de qPCR são efetivamente preservados por algumas semanas à temperatura ambiente ou alguns meses a 2-8 o C. Os detalhes da preparação de cada solução são mostrados aqui, juntamente com o aspecto esperado de uma reação gelificada projetada para detectar oDNA satélite de T. cruzi (satDNA). Um procedimento semelhante pode ser aplicado para detectar outros organismos. Iniciar uma corrida de qPCR gelificada é tão simples quanto remover a placa da geladeira, adicionar as amostras aos seus respectivos poços e iniciar a corrida, diminuindo assim o tempo de configuração de uma reação de placa cheia para o tempo que leva para carregar as amostras. Além disso, as reações de PCR gelificadas podem ser produzidas e controladas quanto à qualidade em lotes, economizando tempo e evitando erros comuns do operador durante a execução de reações de PCR de rotina.
Introduction
A doença de Chagas foi descoberta no início doséculo 20 em regiões rurais do Brasil, onde a pobreza era generalizada 1,2. Ainda hoje, a doença continua ligada aos determinantes sociais e econômicos da saúde nas Américas. A doença de Chagas é bifásica, compreendendo uma fase aguda e uma crônica. É causada pela infecção pelo parasita Trypanosoma cruzi, sendo transmitida por insetos vetores, transfusões de sangue por via congênita ou ingestão oral de alimentos contaminados 3,4.
O diagnóstico da doença de Chagas pode ser feito por meio da observação de sintomas clínicos (especialmente o sinal de Romaña), baciloscopia sanguínea, sorologia e testes moleculares como PCR em tempo real (qPCR) ou amplificação isotérmica 4,5,6,7,8,9. Os sintomas clínicos e a baciloscopia de sangue são utilizados em casos suspeitos de infecções agudas, enquanto a busca de anticorpos é utilizada como ferramenta de triagem em pacientes assintomáticos. Devido à sua sensibilidade e especificidade, a qPCR tem sido sugerida para ser utilizada como ferramenta de monitoramento para pacientes crônicos, para pacientes agudos submetidos a tratamento medindo a carga parasitária no sangue e como marcador substituto de falha terapêutica 6,8,10,11,12 . Embora mais sensível e específica do que os testes atualmente disponíveis, a qPCR é efetivamente impedida de ser conhecida como ferramenta diagnóstica em regiões desfavorecidas em todo o mundo devido à exigência de temperaturas de congelamento para transporte e armazenamento13,14,15.
Para contornar esse obstáculo, técnicas de conservação como a liofilização e a gelificação têm sido exploradas16,17. Embora a liofilização proporcione conservação por anos, requer reagentes especialmente feitos sem a presença de glicerol, que é comumente usado para estabilização/conservação enzimática18. Embora a gelificação tenha demonstrado proporcionar conservação por meses, ela permite o uso de reagentes regulares19. A solução de gelificação compreende quatro componentes, cada um com papéis específicos no processo: os açúcares trealose e melezitose protegem as biomoléculas durante o processo de dessecação, reduzindo as moléculas de água livre na solução, o glicogênio produz uma matriz protetora mais ampla e o aminoácido lisina é usado como um eliminador de radicais livres para inibir as reações oxidantes entre o carboxila da biomolécula, grupos amino e fosfato. Esses componentes definem uma mistura sol-gel que evita a perda da estrutura terciária ou quaternária durante o processo de dessecação, ajudando a manter a atividade das biomoléculas na reidratação19. Uma vez estabilizadas dentro dos tubos de reação, as reações podem ser armazenadas por alguns meses a 2-8 °C ou algumas semanas a 21-23 °C em vez do regular -20 °C. Essa abordagem já foi incorporada em testes destinados a auxiliar no diagnóstico de doenças como doença de Chagas, malária, leishmaniose, tuberculose e ciclosporíase13,14,15,20.
O presente trabalho descreve todas as etapas para preparar as soluções necessárias para o procedimento de gelificação, as armadilhas no processo e o aspecto final esperado de uma qPCR gelificada pronta para uso dentro de tiras de oito tubos. O mesmo protocolo pode ser adaptado para tubos únicos ou placas de 96 poços. Finalmente, a detecção do DNA de T. cruzi será mostrada como uma corrida de controle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os últimos anos têm destacado a necessidade de encontrar tecnologias mais sensíveis e específicas para ajudar a diagnosticar doenças tropicais e negligenciadas. Embora importantes para o controle epidemiológico, os testes parasitológicos (microscopia óptica) e sorológicos apresentam limitações, principalmente no que se refere à sensibilidade e aplicabilidade no local de atendimento. Técnicas de amplificação de DNA, como PCR, amplificação isotérmica e respectivas variações, têm sido usadas há muito t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Aline Burda Farias pela assistência técnica com o forno a vácuo, bem como à administração do Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brasil) por permitir o acesso aos referidos equipamentos. Este trabalho foi parcialmente financiado pela bolsa CNPq 445954/2020-5.
Materials
| Bentonite clay bags (activated) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) | 026157/STD | Not to be confused with silica gel packs |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysine | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nuclease-free water | preferred vendor | ||
| Oligonucleotides | preferred vendor | ||
| PCR mastermix | preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycler | preferred vendor | ||
| software for vacuum oven | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC | ||
| Vacuum oven | Memmert Gmbh | VO-400 |
References
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