トリパノソーマ・クルジまたは他の病原性生物由来のDNAを検出するためのすぐに使用できるqPCR

シャーガス病は、貧困が蔓延していたブラジルの農村地域で20^世紀初頭に発見されました^1,2。今日でも、この病気は南北アメリカの健康の社会的および経済的決定要因に関連し続けています。シャーガス病は二相性で、急性期と慢性期で構成されています。これは、トリパノソーマクルジ寄生虫による感染、昆虫ベクターによる感染、先天性経路を介した輸血、または汚染された食品の経口摂取によって引き起こされます^3,4。

シャーガス病の診断は、臨床症状(特にロマーニャ徴候)の観察、血液塗抹顕微鏡検査、血清学、およびリアルタイムPCR(qPCR)または等温増幅4,5,6,7,8,9などの分子検査によって行うことができます。臨床症状と血液塗抹顕微鏡検査は急性感染症の疑いのある症例に使用されますが、抗体の検索は無症候性患者のスクリーニングツールとして使用されます。qPCRは、その感度と特異性から、慢性患者のモニタリングツール、血液中の寄生虫負荷を測定する治療を受けている急性患者、および治療失敗の代理マーカーとして使用することが示唆されています6,8,10,11,12 .qPCRは、現在利用可能な検査よりも感度が高く特異的ですが、輸送および保管のための凍結温度の要件により、世界中の恵まれない地域では診断ツールとして知られることを効果的に妨げられています^13,14,15。

この障害を回避するために、凍結乾燥やゲル化などの保存技術が検討されている^16,17。凍結乾燥は何年にもわたって保存を提供しますが、酵素の安定化/保存に一般的に使用されるグリセロールの存在なしに特別に作られた試薬を必要とします¹⁸。ゲル化は数ヶ月間の保存を提供することが示されているが、それは通常の試薬の使用を可能にする¹⁹。ゲル化溶液は4つの成分を含み、それぞれがプロセスにおいて特定の役割を有する:糖トレハロースおよびメレジトースは、溶液中の遊離水分子を減少させることによって乾燥プロセス中に生体分子を保護し、グリコーゲンはより広い保護マトリックスを生成し、アミノ酸リジンは、生体分子のカルボキシル間の酸化反応を阻害するフリーラジカルスカベンジャーとして使用される。 アミノ基およびリン酸基。これらの成分は、乾燥プロセス中の三次または四次構造の喪失を防ぐゾル-ゲル混合物を定義し、したがって、再水和時に生体分子の活性を維持するのに役立ちます¹⁹。反応管内で安定化したら、反応物を通常の-20°Cではなく21-23°Cで2-8°Cで数ヶ月間、または数週間保存することができます。 このアプローチは、シャーガス病、マラリア、リーシュマニア症、結核、シクロスポリア症などの疾患の診断に役立つように設計されたテストにすでに組み込まれています¹³、^14、15、20。

本研究では、ゲル化手順に必要な溶液を調製するためのすべてのステップ、プロセスの落とし穴、および8チューブストリップ内のすぐに使用できるゲル化qPCRの予想される最終側面について説明します。同じプロトコルをシングルチューブまたは96ウェルプレートに適合させることができます。最後に、 T. cruzi DNAの検出がコントロールランとして示されます。