qPCR pronta all'uso per la rilevazione del DNA da Trypanosoma cruzi o altri organismi patogeni
Summary
Il presente lavoro descrive le fasi per la produzione di qPCR pronta all’uso per il rilevamento del DNA di T. cruzi che può essere precaricata sul recipiente di reazione e conservata in frigorifero per diversi mesi.
Abstract
La PCR in tempo reale (qPCR) è una tecnica straordinariamente sensibile e precisa che consente di amplificare piccole quantità di bersagli di acidi nucleici da una moltitudine di campioni. È stato ampiamente utilizzato in molte aree di ricerca e ha raggiunto l’applicazione industriale in campi come la diagnostica umana e la selezione dei tratti nelle colture di colture di organismi geneticamente modificati (OGM). Tuttavia, la qPCR non è una tecnica a prova di errore. La miscelazione di tutti i reagenti in un’unica miscela master successivamente distribuita su 96 pozzetti di una normale piastra qPCR potrebbe portare a errori dell’operatore come una miscelazione errata dei reagenti o un’erogazione imprecisa nei pozzetti. Qui viene presentata una tecnica chiamata gelificazione, in base alla quale la maggior parte dell’acqua presente nella miscela master viene sostituita da reagenti che formano una miscela sol-gel quando viene sottoposta al vuoto. Di conseguenza, i reagenti qPCR vengono efficacemente conservati per alcune settimane a temperatura ambiente o alcuni mesi a 2-8 °C. I dettagli della preparazione di ciascuna soluzione sono mostrati qui insieme all’aspetto atteso di una reazione gelificata progettata per rilevare il DNA satellite di T. cruzi (satDNA). Una procedura simile può essere applicata per rilevare altri organismi. Avviare una qPCR gelificata è semplice come rimuovere la piastra dal frigorifero, aggiungere i campioni ai rispettivi pozzetti e iniziare la corsa, riducendo così il tempo di configurazione di una reazione a piastra intera al tempo necessario per caricare i campioni. Inoltre, le reazioni PCR gelificate possono essere prodotte e controllate per la qualità in lotti, risparmiando tempo ed evitando errori comuni dell’operatore durante l’esecuzione di reazioni PCR di routine.
Introduction
La malattia di Chagas è stata scoperta all’inizio del 20° secolo nelle regioni rurali del Brasile, dove la povertà era diffusa 1,2. Ancora oggi, la malattia continua ad essere collegata ai determinanti sociali ed economici della salute nelle Americhe. La malattia di Chagas è bifasica, comprendente una fase acuta e una cronica. È causata dall’infezione da parte del parassita Trypanosoma cruzi, trasmessa da insetti vettori, trasfusioni di sangue per via congenita o ingestione orale di alimenti contaminati 3,4.
La diagnosi della malattia di Chagas può essere effettuata attraverso l’osservazione dei sintomi clinici (in particolare il segno di Romaña), la microscopia dello striscio di sangue, la sierologia e i test molecolari come la PCR in tempo reale (qPCR) o l’amplificazione isotermica 4,5,6,7,8,9. I sintomi clinici e la microscopia a striscio di sangue sono utilizzati nei casi sospetti di infezioni acute, mentre la ricerca di anticorpi viene utilizzata come strumento di screening nei pazienti asintomatici. A causa della sua sensibilità e specificità, la qPCR è stata suggerita per essere utilizzata come strumento di monitoraggio per i pazienti cronici, per i pazienti acuti sottoposti a trattamento che misura il carico parassitario nel sangue e come marker surrogato di fallimento terapeutico 6,8,10,11,12 . Sebbene più sensibile e specifico dei test attualmente disponibili, la qPCR è effettivamente impedita di essere conosciuta come strumento diagnostico nelle regioni svantaggiate di tutto il mondo a causa della necessità di temperature di congelamento per il trasporto e lo stoccaggio13,14,15.
Per aggirare questo ostacolo, sono state esplorate tecniche di conservazione come la liofilizzazione e la gelificazione16,17. Mentre la liofilizzazione fornisce la conservazione per anni, richiede reagenti appositamente realizzati senza la presenza di glicerolo, che è comunemente usato per la stabilizzazione / conservazione degli enzimi18. Mentre la gelificazione ha dimostrato di fornire conservazione per mesi, consente l’uso di reagenti regolari19. La soluzione di gelificazione comprende quattro componenti, ciascuno con ruoli specifici nel processo: gli zuccheri trealosio e melezitosio proteggono le biomolecole durante il processo di essiccazione riducendo le molecole di acqua libera nella soluzione, il glicogeno produce una matrice protettiva più ampia e l’amminoacido lisina viene utilizzato come scavenger dei radicali liberi per inibire le reazioni ossidanti tra il carbossile della biomolecola, gruppi amminico e fosfato. Questi componenti definiscono una miscela sol-gel che impedisce la perdita della struttura terziaria o quaternaria durante il processo di essiccazione, contribuendo così a mantenere l’attività delle biomolecole dopo la reidratazione19. Una volta stabilizzate all’interno delle provette di reazione, le reazioni possono essere conservate per alcuni mesi a 2-8 °C o alcune settimane a 21-23 °C invece dei normali -20 °C. Questo approccio è già stato incorporato in test progettati per aiutare a diagnosticare malattie come la malattia di Chagas, la malaria, la leishmaniosi, la tubercolosi e la ciclosporiasi13,14,15,20.
Il presente lavoro descrive tutte le fasi per preparare le soluzioni richieste per la procedura di gelificazione, le insidie del processo e l’aspetto finale previsto di una qPCR gelificata pronta all’uso all’interno di strisce a otto tubi. Lo stesso protocollo può essere adattato per tubi singoli o piastre a 96 pozzetti. Infine, la rilevazione del DNA di T. cruzi sarà mostrata come una corsa di controllo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli ultimi anni hanno evidenziato la necessità di trovare tecnologie più sensibili e specifiche per aiutare a diagnosticare le malattie tropicali e trascurate. Sebbene importanti per il controllo epidemiologico, i test parassitologici (microscopia ottica) e sierologici hanno dei limiti, soprattutto per quanto riguarda la sensibilità e l’applicabilità al punto di cura. Le tecniche di amplificazione del DNA come la PCR, l’amplificazione isotermica e le rispettive variazioni sono state a lungo utilizzate in ambienti di …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano esprimere la loro gratitudine ad Aline Burda Farias per l’assistenza tecnica con il forno a vuoto, nonché all’amministrazione dell’Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Curitiba, Brasile) per aver permesso l’accesso a tali apparecchiature. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dalla sovvenzione CNPq 445954/2020-5.
Materials
| Bentonite clay bags (activated) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) | 026157/STD | Not to be confused with silica gel packs |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysine | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nuclease-free water | preferred vendor | ||
| Oligonucleotides | preferred vendor | ||
| PCR mastermix | preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycler | preferred vendor | ||
| software for vacuum oven | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC | ||
| Vacuum oven | Memmert Gmbh | VO-400 |
References
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