qPCR מוכן לשימוש לזיהוי דנ"א מטריפנוזומה קרוזי או אורגניזמים פתוגניים אחרים
Summary
העבודה הנוכחית מתארת את השלבים לייצור qPCR מוכן לשימוש עבור זיהוי DNA T. cruzi שניתן לטעון מראש על כלי התגובה ולאחסן במקרר במשך מספר חודשים.
Abstract
PCR בזמן אמת (qPCR) היא טכניקה רגישה ומדויקת להפליא המאפשרת להגביר כמויות זעירות של מטרות חומצות גרעין משלל דגימות. הוא היה בשימוש נרחב בתחומי מחקר רבים והשיג יישום תעשייתי בתחומים כגון אבחון אנושי ובחירת תכונות בגידולים של אורגניזמים מהונדסים גנטית (GMO). עם זאת, qPCR אינה טכניקה חסינת שגיאות. ערבוב כל הריאגנטים לתערובת ראשית אחת המופצת לאחר מכן על 96 בארות של צלחת qPCR רגילה עלול להוביל לטעויות מפעיל כגון ערבוב שגוי של ריאגנטים או חלוקה לא מדויקת לבארות. כאן מוצגת טכניקה הנקראת ג’ליפיקציה, לפיה רוב המים הנמצאים בתערובת האב מוחלפים על ידי ריאגנטים היוצרים תערובת סול-ג’ל כאשר הם מוגשים לוואקום. כתוצאה מכך, ריאגנטים qPCR נשמרים ביעילות במשך כמה שבועות בטמפרטורת החדר או כמה חודשים ב 2-8 oC. פרטים על הכנת כל פתרון מוצגים כאן יחד עם ההיבט הצפוי של תגובה ג’לסית שנועדה לזהות דנ”א לווייני T. cruzi (satDNA). הליך דומה יכול להיות מיושם כדי לזהות אורגניזמים אחרים. התחלת ריצת qPCR ג’ל היא פשוטה כמו הוצאת הצלחת מהמקרר, הוספת הדגימות לבארות המתאימות והתחלת הריצה, ובכך להקטין את זמן ההתקנה של תגובת צלחת מלאה לזמן שלוקח לטעון את הדגימות. בנוסף, ניתן לייצר ולשלוט בתגובות PCR ג’לריות לאיכות בקבוצות, ובכך לחסוך זמן ולהימנע מטעויות נפוצות של המפעיל תוך הפעלת תגובות PCR שגרתיות.
Introduction
מחלת צ’אגאס התגלתה בתחילת המאהה-20 באזורים הכפריים של ברזיל, שם העוני היה נפוץ 1,2. גם כיום, המחלה ממשיכה להיות קשורה לגורמים חברתיים וכלכליים של בריאות ביבשת אמריקה. מחלת צ’אגאס היא דו-פאזית, המורכבת משלב חריף וכרוני. זה נגרם על ידי זיהום על ידי טפיל Tripanosoma cruzi, להיות מועבר על ידי וקטורים חרקים, עירויי דם דרך נתיב מולד, או בליעה אוראלית של מזון מזוהם 3,4.
אבחון של מחלת Chagas יכול להיעשות באמצעות תצפית של סימפטומים קליניים (במיוחד סימן Romaña), מיקרוסקופיה כתם דם, סרולוגיה, ובדיקות מולקולריות כגון PCR בזמן אמת (qPCR) או הגברה איזותרמית 4,5,6,7,8,9. תסמינים קליניים ומיקרוסקופיה של מריחת דם משמשים במקרים חשודים של זיהומים חריפים, בעוד החיפוש אחר נוגדנים משמש ככלי סינון בחולים אסימפטומטיים. בשל רגישותו וספציפיותו, הוצע כי qPCR ישמש ככלי ניטור לחולים כרוניים, לחולים אקוטיים העוברים טיפול המודד את עומס הטפילים בדם, וכסמן פונדקאי לכישלון טיפולי 6,8,10,11,12 . למרות שהוא רגיש וספציפי יותר מהבדיקות הזמינות כיום, qPCR נמנע למעשה מלהיות מוכר ככלי אבחון באזורים מוחלשים ברחבי העולם בשל הדרישה להקפאת טמפרטורות להובלה ואחסון13,14,15.
כדי לעקוף מכשול זה, נחקרו טכניקות שימור כגון ליופיליזציה וג’ליפיקציה16,17. בעוד שליאופיליזציה מספקת שימור במשך שנים, היא דורשת ריאגנטים מיוצרים במיוחד ללא נוכחות של גליצרול, המשמש בדרך כלל לייצוב/שימור אנזימים18. אמנם הודגם כי ג’ליפיקציה מספקת שימור במשך חודשים, אך היא מאפשרת שימוש בריאגנטיםרגילים 19. תמיסת הג’ליפיקציה מורכבת מארבעה מרכיבים, שלכל אחד מהם תפקידים ספציפיים בתהליך: הסוכרים טרהלוז ומלזיטוז מגנים על הביומולקולות בתהליך הדסיקציה על ידי הפחתת מולקולות מים חופשיים בתמיסה, גליקוגן מייצר מטריצת הגנה רחבה יותר, וחומצת האמינו ליזין משמשת כמנטרלת רדיקלים חופשיים כדי לעכב את התגובות המחמצנות בין קרבוקסיל של הביומולקולה, קבוצות אמינו ופוספטים. רכיבים אלה מגדירים תערובת סול-ג’ל המונעת את אובדן המבנה השלישוני או הרבעוני במהלך תהליך הייבוש, ובכך מסייעים בשמירה על פעילות הביומולקולות עם התייבשות19. לאחר התייצבותן בתוך צינורות התגובה, ניתן לאחסן את התגובות במשך מספר חודשים בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס או מספר שבועות בטמפרטורה של 21-23 מעלות צלזיוס במקום 20 מעלות צלזיוס רגילות. גישה זו כבר שולבה בבדיקות שנועדו לסייע באבחון מחלות כגון מחלת צ’אגאס, מלריה, לישמניאזיס, שחפת וציקלוספוריזיס13,14,15,20.
העבודה הנוכחית מתארת את כל השלבים להכנת הפתרונות הנדרשים להליך הג’ליפיקציה, את המלכודות בתהליך ואת ההיבט הסופי הצפוי של qPCR ג’ל מוכן לשימוש בתוך רצועות של שמונה צינורות. ניתן להתאים את אותו פרוטוקול לצינורות בודדים או לצלחות 96 בארות. לבסוף, זיהוי הדנ”א של T. cruzi יוצג כריצת בקרה.
Protocol
Representative Results
Discussion
השנים האחרונות הדגישו את הצורך במציאת טכנולוגיות רגישות וספציפיות יותר שיסייעו באבחון מחלות טרופיות ומוזנחות. למרות חשיבותן לבקרה אפידמיולוגית, לבדיקות פרזיטולוגיות (מיקרוסקופיה אופטית) וסרולוגיות יש מגבלות, במיוחד לגבי רגישות וישימות נקודתית. טכניקות הגברה של דנ”א כגון PCR, הגברה איזות?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להביע את תודתם לאלין בורדה פאריאס על הסיוע הטכני עם תנור הוואקום, כמו גם לממשל במכון הביולוגי המולקולרי דו פרנה (IBMP, קוריטיבה, ברזיל) על שאיפשר גישה לציוד האמור. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מענק CNPq 445954/2020-5.
Materials
| Bentonite clay bags (activated) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) | 026157/STD | Not to be confused with silica gel packs |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysine | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nuclease-free water | preferred vendor | ||
| Oligonucleotides | preferred vendor | ||
| PCR mastermix | preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycler | preferred vendor | ||
| software for vacuum oven | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC | ||
| Vacuum oven | Memmert Gmbh | VO-400 |
References
- Lewinsohn, R. Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas’s disease). Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).
- Bern, C., et al. Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review. The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).
- Pereira, K. S., et al. Chagas’ disease as a foodborne illness. Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).
- Tanowitz, H. B., et al. Chagas’ disease. Clinical Microbiology Reviews. 5 (4), 400-419 (1992).
- Rassi, A., Marin-Neto, J. A. Chagas disease. Lancet. 375 (9723), 1388-1402 (2010).
- Ramírez, J. C., et al. Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients. The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).
- Rivero, R., et al. Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).
- Schijman, A. G. Molecular diagnosis of Trypanosoma cruzi. Acta Tropica. 184, 59-66 (2018).
- Besuschio, S. A., et al. Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation. Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).
- Duffy, T., et al. Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients. Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).
- Melo, M. F., et al. Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients. Parasites & Vectors. 8 (1), 154 (2015).
- Parrado, R., et al. Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).
- de Rampazzo, R. C. P., et al. A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs. Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).
- Rampazzo, R. C. P., et al. Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases. The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).
- Costa, A. D. T., et al. Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices. Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).
- Sun, Y., et al. Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis. Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).
- Kamau, E., et al. Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria. Malaria Journal. 13, 158 (2014).
- Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. Recent advances and further challenges in lyophilization. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).
- Rosado, P. M. F. S., López, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures. PubChem. , (2002).
- Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study. PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).
- Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR. Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).
- Iglesias, N., et al. Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR. Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).
- Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies. Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).
