Gebrauchsfertige qPCR zum Nachweis von DNA aus Trypanosoma cruzi oder anderen pathogenen Organismen
Summary
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Schritte zur Herstellung einer gebrauchsfertigen qPCR für den T. cruzi-DNA-Nachweis, die auf das Reaktionsgefäß vorgeladen und mehrere Monate im Kühlschrank gelagert werden kann.
Abstract
Real-time PCR (qPCR) ist eine bemerkenswert empfindliche und präzise Technik, die es ermöglicht, winzige Mengen von Nukleinsäurezielen aus einer Vielzahl von Proben zu amplifizieren. Es wurde in vielen Forschungsbereichen umfassend eingesetzt und erreichte industrielle Anwendung in Bereichen wie der Humandiagnostik und der Merkmalsauswahl in Pflanzen gentechnisch veränderter Organismen (GVO). qPCR ist jedoch keine fehlersichere Technik. Das Mischen aller Reagenzien zu einer einzigen Mastermischung, die anschließend auf 96 Vertiefungen einer regulären qPCR-Platte verteilt wird, kann zu Bedienerfehlern wie falschem Mischen von Reagenzien oder ungenauer Dosierung in die Vertiefungen führen. Hier wird eine Technik namens Gelifikation vorgestellt, bei der der größte Teil des in der Mastermischung vorhandenen Wassers durch Reagenzien ersetzt wird, die beim Aufsetzen in ein Vakuum eine Sol-Gel-Mischung bilden. Infolgedessen werden qPCR-Reagenzien effektiv für einige Wochen bei Raumtemperatur oder einige Monate bei 2-8 °C konserviert. Details zur Herstellung jeder Lösung werden hier zusammen mit dem erwarteten Aspekt einer gelierten Reaktion zum Nachweis von T. cruzi-Satelliten-DNA (satDNA) gezeigt. Ein ähnliches Verfahren kann angewendet werden, um andere Organismen nachzuweisen. Das Starten eines gelierten qPCR-Laufs ist so einfach wie das Entfernen der Platte aus dem Kühlschrank, das Hinzufügen der Proben in ihre jeweiligen Vertiefungen und das Starten des Laufs, wodurch die Rüstzeit einer vollständigen Plattenreaktion auf die Zeit zum Laden der Proben verringert wird. Darüber hinaus können gelierte PCR-Reaktionen in Chargen erzeugt und auf Qualität kontrolliert werden, was Zeit spart und häufige Bedienfehler bei der Durchführung routinemäßiger PCR-Reaktionen vermeidet.
Introduction
Die Chagas-Krankheit wurde Anfang des 20. Jahrhunderts in ländlichen Regionen Brasiliens entdeckt, wo Armut weit verbreitet war 1,2. Auch heute noch ist die Krankheit mit sozialen und wirtschaftlichen Determinanten von Gesundheit in Amerika verbunden. Die Chagas-Krankheit ist biphasisch und umfasst eine akute und eine chronische Phase. Es wird durch eine Infektion durch den Parasiten Trypanosoma cruzi verursacht, der durch Insektenvektoren, Bluttransfusionen auf angeborenem Weg oder die orale Einnahme kontaminierter Lebensmittel übertragenwird 3,4.
Die Diagnose der Chagas-Krankheit kann durch die Beobachtung klinischer Symptome (insbesondere des Romaña-Zeichens), Blutausstrichmikroskopie, Serologie und molekulare Tests wie real-time PCR (qPCR) oder isotherme Amplifikation 4,5,6,7,8,9 erfolgen. Klinische Symptome und Blutausstrichmikroskopie werden bei Verdacht auf akute Infektionen eingesetzt, während die Suche nach Antikörpern als Screening-Tool bei asymptomatischen Patienten eingesetzt wird. Aufgrund seiner Sensitivität und Spezifität wurde vorgeschlagen, qPCR als Überwachungsinstrument für chronische Patienten, für akute Patienten, die sich einer Behandlung zur Messung der Parasitenlast im Blut unterziehen, und als Ersatzmarker für therapeutisches Versagen verwendet zu werden 6,8,10,11,12 . Obwohl die qPCR empfindlicher und spezifischer ist als die derzeit verfügbaren Tests, wird effektiv verhindert, dass sie in benachteiligten Regionen weltweit als Diagnosewerkzeuge bekannt ist, da für Transport und Lagerung Temperaturen unter dem Gefrierpunkt erforderlich sind13,14,15.
Um dieses Hindernis zu umgehen, wurden Konservierungstechniken wie Lyophilisation und Gelierung erforscht16,17. Während die Lyophilisation jahrelang Konservierung bietet, erfordert sie speziell hergestellte Reagenzien ohne die Anwesenheit von Glycerin, das üblicherweise zur Enzymstabilisierung / -konservierung verwendet wird18. Während die Gelierung nachweislich monatelang konserviert wird, ermöglicht sie die Verwendung von regulären Reagenzien19. Die Gelierungslösung besteht aus vier Komponenten, von denen jede eine spezifische Rolle im Prozess spielt: Die Zucker Trehalose und Melezitose schützen die Biomoleküle während des Austrocknungsprozesses, indem sie freie Wassermoleküle in der Lösung reduzieren, Glykogen erzeugt eine breitere Schutzmatrix, und die Aminosäure Lysin wird als Radikalfänger verwendet, um die oxidierenden Reaktionen zwischen dem Carboxyl des Biomoleküls zu hemmen. Amino- und Phosphatgruppen. Diese Komponenten definieren eine Sol-Gel-Mischung, die den Verlust der tertiären oder quartären Struktur während des Austrocknungsprozesses verhindert und so dazu beiträgt, die Aktivität der Biomoleküle bei Rehydratation aufrechtzuerhalten19. Einmal in den Reaktionsröhrchen stabilisiert, können die Reaktionen für einige Monate bei 2-8 °C oder einige Wochen bei 21-23 °C statt der regulären -20 °C gelagert werden. Dieser Ansatz wurde bereits in Tests zur Diagnose von Krankheiten wie Chagas-Krankheit, Malaria, Leishmaniose, Tuberkulose und Cyclosporiasis aufgenommen13,14,15,20.
Die vorliegende Arbeit beschreibt alle Schritte zur Vorbereitung der erforderlichen Lösungen für das Gelierungsverfahren, die Fallstricke im Prozess und den erwarteten Endaspekt einer gebrauchsfertigen gelierten qPCR in Achtröhrchenstreifen. Das gleiche Protokoll kann für einzelne Rohre oder 96-Well-Platten angepasst werden. Schließlich wird der Nachweis von T. cruzi-DNA als Kontrolllauf gezeigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die letzten Jahre haben gezeigt, dass empfindlichere und spezifischere Technologien gefunden werden müssen, um tropische und vernachlässigte Krankheiten zu diagnostizieren. Obwohl für die epidemiologische Kontrolle wichtig, haben parasitologische (optische Mikroskopie) und serologische Tests Einschränkungen, insbesondere in Bezug auf Empfindlichkeit und Point-of-Care-Anwendbarkeit. DNA-Amplifikationstechniken wie PCR, isotherme Amplifikation und entsprechende Variationen werden seit langem im Labor eingesetzt, aber t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Aline Burda Farias für die technische Unterstützung beim Vakuumofen sowie der Verwaltung des Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Curitiba, Brasilien) für den Zugang zu den genannten Geräten. Diese Arbeit wurde teilweise durch den Zuschuss CNPq 445954/2020-5 finanziert.
Materials
| Bentonite clay bags (activated) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) | 026157/STD | Not to be confused with silica gel packs |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysine | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nuclease-free water | preferred vendor | ||
| Oligonucleotides | preferred vendor | ||
| PCR mastermix | preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycler | preferred vendor | ||
| software for vacuum oven | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC | ||
| Vacuum oven | Memmert Gmbh | VO-400 |
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