qPCR جاهز للاستخدام للكشف عن الحمض النووي من المثقبية الكروزية أو الكائنات المسببة للأمراض الأخرى
Summary
يصف هذا العمل خطوات إنتاج qPCR جاهز للاستخدام للكشف عن الحمض النووي T. cruzi الذي يمكن تحميله مسبقا على وعاء التفاعل وتخزينه في الثلاجة لعدة أشهر.
Abstract
يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (qPCR) تقنية حساسة ودقيقة بشكل ملحوظ تسمح بتضخيم كميات دقيقة من أهداف الحمض النووي من العديد من العينات. وقد تم استخدامه على نطاق واسع في العديد من مجالات البحث وحقق التطبيق الصناعي في مجالات مثل التشخيص البشري واختيار السمات في محاصيل الكائنات المعدلة وراثيا (GMO). ومع ذلك ، فإن qPCR ليست تقنية مقاومة للخطأ. قد يؤدي خلط جميع الكواشف في مزيج رئيسي واحد يتم توزيعه لاحقا على 96 بئرا من لوحة qPCR العادية إلى أخطاء المشغل مثل الخلط غير الصحيح للكواشف أو التوزيع غير الدقيق في الآبار. هنا ، يتم تقديم تقنية تسمى الهلام ، حيث يتم استبدال معظم الماء الموجود في المزيج الرئيسي بالكواشف التي تشكل خليط سول جل عند تقديمه إلى فراغ. نتيجة لذلك ، يتم الحفاظ على كواشف qPCR بشكل فعال لبضعة أسابيع في درجة حرارة الغرفة أو بضعة أشهر عند 2-8 درجةمئوية. يتم عرض تفاصيل تحضير كل محلول هنا جنبا إلى جنب مع الجانب المتوقع من تفاعل هلامي مصمم للكشف عن الحمض النووي للأقمار الصناعية T. cruzi (satDNA). يمكن تطبيق إجراء مماثل للكشف عن الكائنات الحية الأخرى. يعد بدء تشغيل qPCR الهلامي أمرا بسيطا مثل إزالة اللوحة من الثلاجة ، وإضافة العينات إلى الآبار الخاصة بها ، وبدء التشغيل ، وبالتالي تقليل وقت إعداد تفاعل اللوحة الكاملة إلى الوقت المستغرق لتحميل العينات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إنتاج تفاعلات PCR الهلامية والتحكم فيها من أجل الجودة على دفعات ، مما يوفر الوقت وتجنب أخطاء المشغل الشائعة أثناء تشغيل تفاعلات PCR الروتينية.
Introduction
تم اكتشاف مرض شاغاس فيأوائل القرن العشرين في المناطق الريفية في البرازيل ، حيث كان الفقر منتشرا على نطاق واسع 1,2. وحتى اليوم، لا يزال المرض مرتبطا بالمحددات الاجتماعية والاقتصادية للصحة في الأمريكتين. مرض شاغاس ثنائي الطور ، ويتألف من مرحلة حادة ومزمنة. وهو ناتج عن العدوى بطفيلي المثقبية الكروزية ، الذي ينتقل عن طريق ناقلات الحشرات ، أو نقل الدم عبر الطريق الخلقي ، أو الابتلاع الفموي للأغذية الملوثة 3,4.
يمكن إجراء تشخيص مرض شاغاس من خلال ملاحظة الأعراض السريرية (خاصة علامة رومانا) ، والفحص المجهري لطاخة الدم ، والأمصال ، والاختبارات الجزيئية مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (qPCR) أو التضخيم متساوي الحرارة4،5،6،7،8،9. تستخدم الأعراض السريرية والفحص المجهري لطاخة الدم في الحالات المشتبه في إصابتها بالعدوى الحادة ، بينما يستخدم البحث عن الأجسام المضادة كأداة فحص في المرضى الذين لا تظهر عليهم أعراض. نظرا لحساسيته وخصوصيته ، فقد تم اقتراح استخدام qPCR كأداة مراقبة للمرضى المزمنين ، للمرضى الحادين الذين يخضعون للعلاج لقياس حمل الطفيلي في الدم ، وكعلامة بديلة للفشل العلاجي6،8،10،11،12 . على الرغم من أنه أكثر حساسية وتحديدا من الاختبارات المتاحة حاليا ، إلا أن qPCR يمنع بشكل فعال من أن يعرف كأدوات تشخيصية في المناطق المحرومة في جميع أنحاء العالم بسبب متطلبات درجات الحرارة المتجمدة للنقل والتخزين13،14،15.
للتحايل على هذه العقبة ، تم استكشاف تقنيات الحفظ مثل التجفيد والهلام16,17. في حين أن التجفيد يوفر الحفظ لسنوات ، فإنه يتطلب كواشف مصنوعة خصيصا دون وجود الجلسرين ، والذي يستخدم عادة لتثبيت / حفظ الإنزيم18. بينما ثبت أن الهلام يوفر الحفظ لعدة أشهر ، فإنه يسمح باستخدام الكواشف العادية19. يتكون محلول الهلام من أربعة مكونات ، لكل منها أدوار محددة في العملية: السكريات trehalose و melezitose تحمي الجزيئات الحيوية أثناء عملية التجفيف عن طريق تقليل جزيئات الماء الحرة في المحلول ، ينتج الجليكوجين مصفوفة واقية أوسع ، ويستخدم ليسين الأحماض الأمينية ككاسح للجذور الحرة لمنع التفاعلات المؤكسدة بين كربوكسيل الجزيء الحيوي ، المجموعات الأمينية والفوسفات. تحدد هذه المكونات خليط سول جل يمنع فقدان البنية الثلاثية أو الرباعية أثناء عملية التجفيف ، مما يساعد على الحفاظ على نشاط الجزيئات الحيوية عند الإماهة19. بمجرد الاستقرار داخل أنابيب التفاعل ، يمكن تخزين التفاعلات لبضعة أشهر عند 2-8 درجة مئوية أو بضعة أسابيع عند 21-23 درجة مئوية بدلا من -20 درجة مئوية العادية. تم بالفعل دمج هذا النهج في الاختبارات المصممة للمساعدة في تشخيص أمراض مثل مرض شاغاس والملاريا وداء الليشمانيات والسل وداء السيكلوسبوريا13،14،15،20.
يصف هذا العمل جميع الخطوات لإعداد الحلول المطلوبة لإجراء الهلام ، والمزالق في العملية ، والجانب النهائي المتوقع من qPCR الهلامي الجاهز للاستخدام داخل شرائط ثمانية أنابيب. يمكن تكييف نفس البروتوكول مع الأنابيب المفردة أو ألواح 96 بئرا. أخيرا ، سيتم عرض اكتشاف الحمض النووي T. cruzi كتشغيل تحكم.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أبرزت السنوات الأخيرة الحاجة إلى إيجاد تكنولوجيات أكثر حساسية وتحديدا للمساعدة في تشخيص الأمراض المدارية والمهملة. على الرغم من أهمية الاختبارات الطفيلية (المجهر الضوئي) والاختبارات المصلية للمكافحة الوبائية ، إلا أن لها قيودا ، خاصة فيما يتعلق بالحساسية وقابلية التطبيق في نقطة الر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يعربوا عن امتنانهم لألين بوردا فارياس للمساعدة التقنية في فرن التفريغ ، وكذلك للإدارة في معهد البيولوجيا الجزيئية في بارانا (IBMP ، كوريتيبا ، البرازيل) للسماح بالوصول إلى المعدات المذكورة. تم تمويل هذا العمل جزئيا من خلال منحة CNPq 445954 / 2020-5.
Materials
| Bentonite clay bags (activated) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) | 026157/STD | Not to be confused with silica gel packs |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysine | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nuclease-free water | preferred vendor | ||
| Oligonucleotides | preferred vendor | ||
| PCR mastermix | preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycler | preferred vendor | ||
| software for vacuum oven | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC | ||
| Vacuum oven | Memmert Gmbh | VO-400 |
References
- Lewinsohn, R. Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas’s disease). Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).
- Bern, C., et al. Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review. The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).
- Pereira, K. S., et al. Chagas’ disease as a foodborne illness. Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).
- Tanowitz, H. B., et al. Chagas’ disease. Clinical Microbiology Reviews. 5 (4), 400-419 (1992).
- Rassi, A., Marin-Neto, J. A. Chagas disease. Lancet. 375 (9723), 1388-1402 (2010).
- Ramírez, J. C., et al. Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients. The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).
- Rivero, R., et al. Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).
- Schijman, A. G. Molecular diagnosis of Trypanosoma cruzi. Acta Tropica. 184, 59-66 (2018).
- Besuschio, S. A., et al. Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation. Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).
- Duffy, T., et al. Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients. Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).
- Melo, M. F., et al. Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients. Parasites & Vectors. 8 (1), 154 (2015).
- Parrado, R., et al. Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).
- de Rampazzo, R. C. P., et al. A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs. Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).
- Rampazzo, R. C. P., et al. Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases. The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).
- Costa, A. D. T., et al. Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices. Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).
- Sun, Y., et al. Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis. Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).
- Kamau, E., et al. Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria. Malaria Journal. 13, 158 (2014).
- Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. Recent advances and further challenges in lyophilization. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).
- Rosado, P. M. F. S., López, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures. PubChem. , (2002).
- Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study. PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).
- Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR. Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).
- Iglesias, N., et al. Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR. Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).
- Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies. Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).
