В этой работе анализируется векторная доза и время воздействия, необходимые для индуцирования нейровоспаления, нейродегенерации и двигательных нарушений в этой доклинической модели болезни Паркинсона. Эти векторы, кодирующие α-синуклеин человека, доставляются в черную субстанцию для повторения синуклеиновой патологии, связанной с болезнью Паркинсона.
Болезнь Паркинсона – это нейродегенеративное расстройство, которое предполагает гибель дофаминергических нейронов нигростриатального пути и, как следствие, прогрессирующую потерю контроля над произвольными движениями. Этот нейродегенеративный процесс запускается отложением белковых агрегатов в головном мозге, которые в основном состоят из α-синуклеина. Несколько исследований показали, что нейровоспаление требуется для развития нейродегенерации, связанной с болезнью Паркинсона. Примечательно, что нейровоспалительный процесс включает в себя активацию микроглии, а также инфильтрацию периферических Т-клеток в черную субстанцию (SN). В этой работе анализируется мышиная модель болезни Паркинсона, которая рекапитулирует активацию микроглии, инфильтрацию Т-клеток в SN, нейродегенерацию нигральных дофаминергических нейронов и двигательные нарушения. Эта мышиная модель болезни Паркинсона индуцируется стереотаксической доставкой аденоассоциированных вирусных векторов, кодирующих α-синуклеин дикого типа человека (AAV-hαSyn) в SN. Правильная доставка вирусных векторов в SN была подтверждена с помощью контрольных векторов, кодирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP). После этого оценивалось, как доза AAV-hαSyn, вводимая в SN, влияла на степень экспрессии hαSyn, потерю нигральных дофаминергических нейронов и двигательные нарушения. Кроме того, динамика экспрессии hαSyn, активации микроглии и инфильтрации Т-клеток определялась на протяжении всего времени развития заболевания. Таким образом, это исследование предоставляет критические временные точки, которые могут быть полезны для нацеливания на синуклеиновую патологию и нейровоспаление в этой доклинической модели болезни Паркинсона.
После болезни Альцгеймера болезнь Паркинсона является вторым наиболее распространенным нейродегенеративным заболеванием во всем мире. Первичными нейронами, пораженными при болезни Паркинсона, являются нейроны нигростриатального пути, которые производят дофамин и контролируют произвольное движение. Как следствие, наиболее характерным симптомом, связанным с этим расстройством, является двигательное нарушение. Эта патология также включает в себя отложение белковых агрегатов в головном мозге, которые состоят в основном из α-синуклеина (αSyn)1, цитозольного белка, связанного с пресинаптическими терминалями. Данные показали, что генерация патогенных включений αSyn вызвана неправильным сворачиванием или некоторыми посттрансляционными модификациями этого белка2.
Примечательно, что была установлена тесная связь между патологией αSyn и потерей дофаминергических нейронов нигростриатального пути при болезни Паркинсона человека и животных моделях 3,4. Понимание того, как генерируются агрегаты αSyn и как они вызывают гибель нейронов, представляет собой значительную проблему в этой области. Растущая группа исследований показала, что, увеличивая окислительный стресс, митохондриальная дисфункция является одной из ведущих причин генерации агрегатов αSyn2. Действительно, несколько генов, связанных с риском болезни Паркинсона, кодируют белки, участвующие в митохондриальной функции, морфологии и динамике 5,6. Кроме того, лизосомальная дисфункция, которая приводит к накоплению дисфункциональных митохондрий и неправильно свернутых αSyn, представляет собой еще одно крупное событие, способствующее генерации агрегатов αSyn7.
Новые данные показали, что, как только агрегаты αSyn депонируются в мозге, эти патогенные белки стимулируют толл-подобные рецепторы (TLR) на микроглии, тем самым вызывая активацию микроглии и начальную воспалительную среду в черной субстанции (SN)8,9. Кроме того, данные указывают на то, что агрегаты αSyn захватываются и представляются антигенпрезентирующими клетками т-клеткам, вызывая адаптивный иммунный ответ, специфичный для αSyn10,11. Эти αСин-специфические Т-клетки впоследствии проникают в мозг и рестимулируются активированной микроглией, тем самым способствуя секреции нейротоксических факторов, которые вызывают гибель нейронов 9,10. Интересно, что несколько линий доказательств предполагают, что агрегаты αSyn генерируются сначала в кишечной нервной системе, а затем транспортируются через блуждающий нерв к стволу мозга12.
В течение многих лет использовалось несколько животных моделей болезни Паркинсона, в том числе те, которые индуцировались введением нейротоксических веществ (т.е. 6-гидроксидофамин, паракват, ротенон, 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин) и те, которые связаны с генетическими условиями (т.е. мутантная α-синуклеин, мутантная лейцин-богатая повторная киназа 2)13 . Несмотря на модели, включающие нейротоксин-индуцированную нейродегенерацию, воспроизводящую некоторые аспекты болезни Паркинсона, ни одна из них не повторяет все существенные аспекты заболевания или не прогрессирует13. С другой стороны, хотя генетические мышиные модели, включающие экспрессию мутантных версий богатой лейцином повторной киназы 2, мутантные версии α-синуклеина или сверхэкспрессию человеческих α-синуклеина дикого типа, приводят к двигательным нарушениям, а в некоторых случаях также к развитию синуклеинопатии, они не воспроизводят заметную нейродегенерацию нигральных дофаминергических нейронов, что является существенным аспектом болезни Паркинсона13, 14. Третий вид животной модели нейродегенерации сумел удовлетворить большинство существенных аспектов болезни Паркинсона, стереотаксическую доставку аденоассоциированных вирусных векторов (AAV), кодирующих человеческий α-синуклеин (AAV-hαSyn)14,15. Важно отметить, что AAV позволяют трансдукцию нейронов с высокой эффективностью и в долгосрочной перспективе в мозг взрослых млекопитающих. Кроме того, было показано, что стереотаксическая доставка AAV-hαSyn в SN воспроизводит многие из основных аспектов заболевания, включая патологию αSyn, активацию микроглии, нейродегенерацию и двигательные нарушения 16,17,18,19,20. В этом исследовании представлен анализ того, как доза вирусного вектора и время после доставки вирусного вектора влияют на степень экспрессии hαSyn, нейродегенерации и нейровоспаления в нигростриатальном пути, а также на степень двигательных нарушений в мышиной модели односторонней стереотаксической доставки hαSyn в SN.
Анализируемая здесь мышиная модель нейродегенерации может помочь изучить многие критические аспекты, связанные с патофизиологией болезни Паркинсона, включая механизмы, участвующие в патологии αSyn и активации микроглии, вовлечение периферической иммунной системы в регуляцию нейровоспаления и механизмы нейродегенерации. К числу механизмов, участвующих в патологии αSyn, относятся субклеточные механизмы, связанные с митохондриальной, лизосомальной или протеазомальной дисфункцией при наличии чрезмерной нагрузки αSyn в дофаминергических нейронах SN2. Важно учитывать, что в дополнение к экспрессии hαSyn, индуцированной AAV-опосредованной трансдукцией, эндогенная мышь αSyn также вносит свой вклад в нагрузку общей экспрессии αSyn. У трансгенных мышей, чрезмерно экспрессирующих мышь αSyn, развивается аналогичная патология синуклеина, невропатология и двигательные нарушения, чем у этих моделей мышей, основанных на гиперэкспрессии hαSyn32. Что касается активации микроглии, настоящая модель мыши может быть использована для изучения того, как различные молекулярные и клеточные игроки, такие как цитокины, нейротрансмиттеры, астроциты, нейроны, гематоэнцефалический барьер и Т-клетки, могут регулировать приобретение провоспалительных или противовоспалительных функциональных фенотипов 8,10,11 . Данная модель также представляет собой важный инструмент для изучения роли периферической иммунной системы, включающей не только Т-клетки, но и макрофаги, моноциты и нейтрофилы, на процессы нейровоспаления и нейродегенерации нигральных нейронов 11,33,34. Наконец, эта модель мыши также представляет собой ценную систему для изучения клеточных и молекулярных механизмов нейродегенерации in vivo, включая те, которые индуцируются внутренними клеточными процессами, такими как окислительный стресс, дефицит энергии и поврежденные органеллы 2, или те, которые проявляются внешними игроками, такими как нейротоксические факторы, продуцируемые микроглиальными клетками, астроцитами и цитотоксическими Т-клетками8. 28,29,35.
Ограничением этой мышиной модели является изучение того, как патологическая агрегация αSyn во внецеребральных местах может представлять собой начальные стадии развития болезни Паркинсона36. В связи с этим появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что до нейродегенерации нигральных нейронов и двигательных нарушений в слизистой оболочке кишечника и обонятельном эпителии36 начинается патология αSyn и, вероятно, специфический для αSyn Т-клеточный ответ12. После этого агрегаты αSyn мигрируют через блуждающий нерв к стволу мозга, вызывая нейровоспаление и нейродегенерацию дофаминергических нейронов12. Хотя модель AAV-hαSyn повторяет большинство аспектов болезни Паркинсона, в этой модели нет очевидного участия патологической агрегации αSyn во внецеребральных местах. Альтернативной моделью, включающей патологию hαSyn, подходящей для изучения этих аспектов болезни Паркинсона, могут быть трансгенные мыши, чрезмерно экспрессирующие hαSyn под контролем промотора Thy1, модели Thy1-SNCA37, в которой развитие заболевания зависит от микробиоты кишечника и включает в себя очевидные желудочно-кишечные нарушения38.
Хотя она полезна для изучения разнообразных процессов, связанных с патофизиологией болезни Паркинсона, настоящая модель мыши включает в себя критические шаги, которые должны быть тщательно проверены, включая правильную доставку вирусных векторов в соответствующих пространственных координатах, селективную экспрессию hαSyn в нейронах (которая зависит от серотипа AAV и векторной конструкции), и правильная доза И сроки AAV перед анализом фенотипа Паркинсона. Анализ правильной доставки вирусных векторов в SN необходим, так как использования правильных пространственных координат SN может быть недостаточно, когда игла не совсем прямая, что иногда незаметно для человеческого глаза. Кроме того, диффузия векторов AAV зависит от серотипа AAV39. По этим причинам необходимо проводить периодический контроль качества, проверяя правильную доставку и диффузию введенных векторов AAV-GFP после наблюдения GFP в срезах мозга, содержащих область SN.
Что касается селективной экспрессии hαSyn в нейронах, в принципе, экспрессия hαSyn может быть спроектирована так, чтобы контролироваться промотором, селективным для нейронов или, что еще более точно, селективным для дофаминергических нейронов, таким как использование промотора TH в векторах AAV для индуцирования селективной экспрессии генов в дофаминергических нейронах40 . Однако эта стратегия не работает, когда речь идет о чрезмерной экспрессии интересующего гена. По этой причине в настоящей модели важно использовать сильный промотор (промотор, индуцирующий высокую экспрессию нисходящего гена) и серотипы AAV с нейрональным тропизмом. В этом исследовании промотор CBA использовался в качестве сильного промотора для индуцирования сверхэкспрессии hαSyn, а серотип AAV5 использовался для вирусного вектора. Этот серотип использовался ранее для трансдукции нейронов мыши и крысы41,42. Здесь результаты показали, что через 12 недель после доставки AAV5-GFP в SN мышей зеленая флуоресценция избирательно присутствовала на ипсилатеральной стороне как SN, так и полосатого тела (рисунок 1), что указывает на эффективную трансдукцию нейронов нигростриатального пути.
Другим важным аспектом этой мышиной модели болезни Паркинсона является точка времени, необходимая для анализа конкретного процесса после операции. В связи с этим данная работа показывает кинетическое исследование различных процессов, участвующих в патологии. Поскольку ключевые временные точки изменяются с дозой вирусных геномов, данных на мышь, используемым серотипом AAV или даже с используемой партией AAV, сначала был проведен анализ «доза-реакция» количества AAV-αSyn, необходимого для индуцирования значительной потери нейронов TH+ и двигательных нарушений. Предыдущие исследования показали значительные двигательные нарушения и потерю нейронов TH+ нигростриатального пути после 12 недель инъекций AAV-αSyn у мышей в дозах от 6 х 108–3 х 1010 вирусных геномов на мышь 16,17,30,31. Соответственно, доза AAV-hαSyn, используемая для индуцирования экспрессии hαSyn в нигростриатальном пути, потери нейронов TH+ и двигательных нарушений у мышей, варьировалась от 1 x 108–1 x 1010 вирусных геномов на мышь. Более того, чтобы контролировать, что потеря нейронов TH+ и двигательные нарушения были вызваны сверхэкспрессией hαSyn в SN, а не AAV-инфекцией нейронов SN, были включены контрольные группы, в которые AAV кодирование репортерного гена (AAV-eGFP) доставлялось в одностороннем порядке в SN мышей и определяли нейродегенерацию и двигательные нарушения. Результаты показали, что через 12 недель после стереотаксической операции 1 х 1010 вирусных геномов на мышь была правильной дозой AAV5-hαSyn, поскольку мыши, получавшие эту вирусную нагрузку, демонстрировали значительный hαSyn в нигростриатальном пути (рисунок 2 и рисунок 3), потерю нейронов TH+ (рисунок 4) и двигательные нарушения (рисунок 5). Напротив, более низкие дозы AAV5-hαSyn (1 x 108 вирусных геномов на мышь и 1 x 109 вирусных геномов на мышь) были недостаточно сильными, чтобы достичь значительных изменений во всех этих параметрах вместе (рисунки 2–4). Следует отметить, что введение AAV-GFP при 1 х 1010 вирусных геномах на мышь индуцировало низкую (~20%), но значительную степень потери нейронов TH+ нигральных дофаминергических нейронов (рисунок 4A,B). Этот результат согласуется с предыдущими наблюдениями с использованием этой модели41 и, вероятно, является следствием низкого уровня нейровоспаления, вызванного введением векторов AAV в SN. Тем не менее, степень потери нейронов TH+ была значительно выше у мышей, получавших AAV5-hαSyn, по сравнению с теми, кто получал ту же дозу AAV-GFP (рисунок 4C). Следует отметить, что кинетика экспрессии hαSyn зависит не только от эффективности трансдукции, но и от степени диффузии AAV39. Поскольку диффузия AAV зависит от серотипа AAV, точные ключевые моменты времени в этой модели животных могут варьироваться при использовании другого серотипа AAV, отличного от AAV5.
После этого был проведен кинетический анализ с использованием 1 x 1010 вирусных геномов на мышь для определения ключевых временных точек в этой модели мыши. Поскольку современные данные показали некоторые ранние симптомы, которые появляются до двигательных нарушений, что позволило бы раннюю диагностику болезни Паркинсона 43,44, эти эксперименты стремились найти точку времени, в которой экспрессия hαSyn уже была очевидна, но при отсутствии двигательных нарушений. Результаты показывают, что начало экспрессии hαSyn в SN произошло через 5 недель после стереотаксической доставки AAV-hαSyn (рисунок 6). Этот момент времени представляет собой интересную временную точку для начала применения терапии, предназначенной для остановки нейровоспалительных и нейродегенеративных процессов. Другими ключевыми временными точками, определенными здесь, были пиковые времена для двух критических событий, связанных с процессом нейровоспаления: время, в которое микроглия достигает максимальной степени активации и время максимальной инфильтрации Т-клеток в SN. Результаты показали кривую с тенденцией, достигающей двух волн максимальной активации микроглии, первая через 10 недель после операции, а вторая через 15 недель после операции (рисунок 7). Кинетический анализ инфильтрации Т-клеток показал пиковое время инфильтрации Treg в SN через 11 недель после стереотаксической операции (рисунок 8). Удивительно, но не было обнаружено никаких эффекторных Т-клеток (CD4 + Foxp3-), проникающих в SN в течение анализируемого периода времени (8-13 недель после операции). В целом, эти результаты предполагают надлежащие временные рамки для начала введения терапии, направленной на остановку процесса нейровоспаления и ослабление инфильтрации Т-клеток в SN с использованием этой доклинической модели, которая колеблется между неделей 5 после операции (начало гиперэкспрессии hαSyn) и неделей 10 после операции (первая волна нейровоспаления и инфильтрации Т-клеток) (рисунок 9).
Рисунок 9: Сводка ключевых временных точек, найденных для этой модели животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим д-ра Себастьяна Валенсуэлу и д-ра Микаэлу Рикку за их ценную ветеринарную помощь в нашем учреждении для животных. Эта работа была поддержана “Financiamiento Basal para Centros Científicos y Tecnológicos de Excelencia de ANID” Centro Ciencia & Vida, FB210008 (для Fundación Ciencia & Vida) и Geroscience Center for Brain Health and Metabolism, FONDAP-15150012. Эта работа также финансировалась грантами FONDECYT-1210013 (для R.P.) и FONDECYT-1150766 (для F.C.) от «Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo de Chile (ANID)» и MJFF-10332.01 (для R.P.) и MJFF-17303 (для F.C.) от Фонда Майкла Джей Фокса для исследований Паркинсона.
ANIMALS AND ANIMAL FOOD | |||
Foxp3-GFP C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock No: 023800 | |
Laboratory Rodent Diet | LabDiet | Rodent Diet 5001 | Standard Rodent diet |
Wild-type C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock No: 000664 | |
VIRAL VECTORS | |||
AAV5-CBA-αSyn | University of Iowa Viral Vector Core Facility | N/A | Stock concentration at 10E13 vg/mL |
AAV5-CBA-eGFP | University of Iowa Viral Vector Core Facility | N/A | Stock concentration at 9.5 x 10E12 vg/mL |
ANESTHETICS AND ANALGESICS | |||
Isoflurane | Baxter | 218082 | 1% for stereotaxic surgery |
Ketamine | Drag Pharma | CHE30 | 70 mg/Kg for stereotaxic surgery |
Sevoflurane | Baxter | VE2L9117 | For before transcardial perfusion |
Tramadol | Drag Pharma | DPH134 | 30 mg/Kg every 24 h |
Xylazine | Centrovet | EHL40 | 9 mg/kg for stereotaxic surgery |
EQUIPMENT | |||
Beam test | Home made | N/A | horizontal beam 25 cm length and 3 cm width. The beam surface was covered by a metallic grid (1 cm2). |
Cryostate | Leica | CM1520 | |
Digital camera | Nikon | S2800 Coolpix | For recording the beam test performance |
Microscope | Olympus | BX51 | Used for IHC analysis (section 4.4) |
Microscope | Olympus | IX71 | Used for IF analysis (section 5.3) |
Microscope | Leica | DMI8 | Used for IF analysis (section 5.7) |
New Standard Stereotaxic, mouse | Stoelting, Wood Dale, IL, USA | 51500 | stereotaxic frame for surgery |
Peristaltic Pump | Masterflex | C-flex L/S16 | |
Power supply unit | Olympus | U-RFL-T | Used for IF analysis (section 5.3) |
Surgical suture | Sylkam®, B Braun | C0760171 | |
Syringe 100 U | BD | 324918 | For anesthesia before transcardial perfusion, 29G needle |
Syringe RN 5uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | HA-7641-01 | For viral vector innoculation |
BUFFERS AND REAGENTS | |||
Aviden, Peroxidase Conjugate | Merck, Darmstadt, Germany | 189728 | |
Bovine Serum Albumin | Merck, Darmstadt, Germany | 9048-46-8 | |
Cryotrotection buffer | Home made | N/A | 20% glycerine and 2% DMSO in PBS |
DAPI | Abcam | ab228549 | |
Diaminobenzidine | Merck, Darmstadt, Germany | D8001 | |
Fluoromount -G T | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
Gelatin | Merck, Darmstadt, Germany | 104078 | |
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 5000121 | |
Paraformaldehyde | Merck, Darmstadt, Germany | 104005 | |
PBS | Home made | N/A | 0.125 M, pH 7.4 |
Peroxidase inactivating buffer | Home made | N/A | 0.03% H2O2 in methanol |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | |
Trizma Hydrochloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1185-53-1 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | 822184 | |
ANTIBODIES | |||
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 111065003 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A11010 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A21244 | |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A11081 | |
Rabbit monoclonal anti-alpha-Synuclein | Abcam | ab138501 | |
Rabbit monoclonal anti-Iba-1 | Abcam | EPR16588 | |
Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | |
Rat monoclonal anti-CD4 | Biolegend | 100402 | |
SOFTWARES | |||
GraphPad | Prism | 6.0 | Fos stats analysis |
ImageJ | National Institute of Health | N/A | For image analysis |
LAS X | Leica | N/A | For image capture with Leica microscope |
ProgRes Capture Pro | Jenoptik | N/A | For image capture with Olympus microscope |
VLC media player | VideoLAN Organization | N/A | For analysis of behavioural tests |