Ce travail analyse la dose vectorielle et le temps d’exposition nécessaires pour induire la neuroinflammation, la neurodégénérescence et la déficience motrice dans ce modèle préclinique de la maladie de Parkinson. Ces vecteurs codant pour la α-synucléine humaine sont introduits dans la substantia nigra pour récapituler la pathologie de la synucléine associée à la maladie de Parkinson.
La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative qui implique la mort des neurones dopaminergiques de la voie nigrostriatale et, par conséquent, la perte progressive du contrôle des mouvements volontaires. Ce processus neurodégénératif est déclenché par le dépôt d’agrégats de protéines dans le cerveau, qui sont principalement constitués de α-synucléine. Plusieurs études ont indiqué que la neuroinflammation est nécessaire pour développer la neurodégénérescence associée à la maladie de Parkinson. Notamment, le processus neuro-inflammatoire implique l’activation microgliale ainsi que l’infiltration de lymphocytes T périphériques dans la substantia nigra (SN). Ce travail analyse un modèle murin de la maladie de Parkinson qui récapitule l’activation microgliale, l’infiltration des lymphocytes T dans le SN, la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques nigraux et la déficience motrice. Ce modèle murin de la maladie de Parkinson est induit par l’administration stéréotaxique de vecteurs viraux adéno-associés codant pour la α-synucléine de type sauvage humain (AAV-hαSyn) dans le SN. L’administration correcte de vecteurs viraux dans le SN a été confirmée à l’aide de vecteurs témoins codant pour la protéine fluorescente verte (GFP). Par la suite, la façon dont la dose d’AAV-hαSyn administrée dans le SN a affecté l’étendue de l’expression de hαSyn, la perte de neurones dopaminergiques nigrals et la déficience motrice ont été évaluées. De plus, la dynamique de l’expression de hαSyn, de l’activation microgliale et de l’infiltration des lymphocytes T a été déterminée tout au long du développement de la maladie. Ainsi, cette étude fournit des points temporels critiques qui peuvent être utiles pour cibler la pathologie de la synucléine et la neuroinflammation dans ce modèle préclinique de la maladie de Parkinson.
Après la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson est la deuxième maladie neurodégénérative la plus répandue dans le monde. Les neurones primaires affectés dans la maladie de Parkinson sont ceux de la voie nigrostriatale, qui produisent de la dopamine et contrôlent le mouvement volontaire. En conséquence, le symptôme le plus caractéristique associé à ce trouble est la déficience motrice. Cette pathologie implique également le dépôt d’agrégats de protéines dans le cerveau, qui sont composés principalement de α-synucléine (αSyn)1, une protéine cytosolique associée aux terminaux présynaptiques. Des preuves ont montré que la génération d’inclusions pathogènes d’αSyn est déclenchée par un mauvais repliement ou par certaines modifications post-traductionnelles de cette protéine2.
Notamment, une relation étroite a été établie entre la pathologie αSyn et la perte de neurones dopaminergiques de la voie nigrostriatale dans la maladie de Parkinson humaine et les modèles animaux 3,4. Comprendre comment les agrégats αSyn sont générés et comment ils induisent la mort neuronale représente un défi important dans le domaine. Un groupe croissant d’études a montré que, en augmentant le stress oxydatif, le dysfonctionnement mitochondrial est l’une des principales causes de la génération d’agrégats αSyn2. En effet, plusieurs gènes associés au risque de maladie de Parkinson codent pour des protéines impliquées dans la fonction mitochondriale, la morphologie et la dynamique 5,6. De plus, le dysfonctionnement lysosomal, qui entraîne l’accumulation de mitochondries dysfonctionnelles et d’αSyn mal repliés, constitue un autre événement majeur favorisant la génération d’agrégats αSyn7.
De nouvelles preuves ont indiqué que, une fois que les agrégats αSyn sont déposés dans le cerveau, ces protéines pathogènes stimulent les récepteurs de type toll (TLR) sur la microglie, déclenchant ainsi une activation microgliale et un environnement inflammatoire initial dans la substantia nigra (SN)8,9. En outre, les preuves indiquent que les agrégats αSyn sont capturés et présentés par les cellules présentatrices d’antigènes aux cellules T, induisant une réponse immunitaire adaptative spécifique à αSyn10,11. Ces lymphocytes T spécifiques d’αSyn s’infiltrent ensuite dans le cerveau et sont restimulés par des microglies activées, favorisant ainsi la sécrétion de facteurs neurotoxiques qui évoquent la mort neuronale 9,10. Fait intéressant, plusieurs sources de données ont suggéré que les agrégats αSyn sont générés d’abord dans le système nerveux entérique, puis transportés à travers le nerf vague jusqu’au tronc cérébral12.
Plusieurs modèles animaux de la maladie de Parkinson sont utilisés depuis de nombreuses années, y compris ceux induits par l’administration de substances neurotoxiques (c.-à-d. 6-hydroxydopamine, paraquat, roténone, 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine) et ceux impliquant des conditions génétiques (c.-à-d. α-synucléine mutante, kinase répétée 2)13 mutante riche en leucine . Malgré les modèles impliquant une neurodégénérescence induite par les neurotoxines reproduisant certains aspects de la maladie de Parkinson, aucun d’entre eux ne récapitule tous les aspects essentiels de la maladie ou n’est pas progressif13. D’autre part, bien que les modèles génétiques murins impliquant l’expression de versions mutantes de la kinase répétitive 2 riche en leucine, les versions mutantes de la α-synucléine ou la surexpression de α-synucléine de type sauvage humain entraînent une déficience motrice et, dans certains cas, le développement d’une synucléinopathie, ils ne reproduisent pas la neurodégénérescence proéminente des neurones dopaminergiques nigraux, ce qui est un aspect essentiel de la maladie de Parkinson13, 14. Un troisième type de modèle animal de neurodégénérescence a réussi à répondre à la plupart des aspects essentiels de la maladie de Parkinson, l’administration stéréotaxique de vecteurs viraux adéno-associés (AAV) codant pour la α-synucléine humaine (AAV-hαSyn)14,15. Il est important de noter que les AAV permettent la transduction des neurones avec une grande efficacité et à long terme dans le cerveau adulte des mammifères. En outre, il a été démontré que l’administration stéréotaxique d’AAV-hαSyn dans le SN reproduit de nombreux aspects essentiels de la maladie, notamment la pathologie αSyn, l’activation microgliale, la neurodégénérescence et la déficience motrice 16,17,18,19,20. Cette étude présente une analyse de la façon dont la dose de vecteur viral et le temps après l’administration du vecteur viral affectent l’étendue de l’expression hαSyn, la neurodégénérescence et la neuroinflammation dans la voie nigrostriatale, ainsi que le degré de déficience motrice dans le modèle murin d’administration stéréotaxique unilatérale de hαSyn dans le SN.
Le modèle murin de neurodégénérescence analysé ici pourrait aider à étudier de nombreux aspects critiques impliqués dans la physiopathologie de la maladie de Parkinson, y compris les mécanismes impliqués dans la pathologie αSyn et l’activation microgliale, l’implication du système immunitaire périphérique dans la régulation de la neuroinflammation et les mécanismes de la neurodégénérescence. Parmi les mécanismes impliqués dans la pathologie αSyn figurent les mécanismes subcellulaires associés à un dysfonctionnement mitochondrial, lysosomal ou protéasomal en présence d’une charge excessive d’αSyn dans les neurones dopaminergiques du SN2. Il est important de considérer que, en plus de l’expression hαSyn induite par la transduction médiée par l’AAV, la souris endogène αSyn contribue également à la charge d’expression totale d’αSyn. Les souris transgéniques surexprimant la souris αSyn développent une pathologie de la synucléine, une neuropathologie et une déficience motrice similaires à celles de ces modèles murins basées sur la surexpression de hαSyn32. En ce qui concerne l’activation microgliale, le présent modèle murin pourrait être utilisé pour étudier comment différents acteurs moléculaires et cellulaires tels que les cytokines, les neurotransmetteurs, les astrocytes, les neurones, la barrière hémato-encéphalique et les lymphocytes T pourraient réguler l’acquisition de phénotypes fonctionnels pro-inflammatoires ou anti-inflammatoires 8,10,11 . Ce modèle constitue également un outil important pour étudier le rôle du système immunitaire périphérique, comprenant non seulement les lymphocytes T mais aussi les macrophages, les monocytes et les neutrophiles, sur les processus de neuroinflammation et de neurodégénérescence des neuronesnigrals 11,33,34. Enfin, ce modèle murin représente également un système précieux pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la neurodégénérescence in vivo, y compris ceux induits par des processus cellulaires internes, tels que le stress oxydatif, les déficits énergétiques et les organites endommagés 2, ou ceux exercés par des acteurs externes, tels que les facteurs neurotoxiques produits par les cellules microgliales, les astrocytes et les lymphocytes T cytotoxiques8, 28,29,35.
Une limitation de ce modèle murin est l’étude de la façon dont l’agrégation pathologique d’αSyn dans des emplacements extra-cérébraux pourrait constituer les premiers stades du développement de la maladie de Parkinson36. À cet égard, il existe de plus en plus de preuves indiquant que, avant la neurodégénérescence des neurones nigral et la déficience motrice, la pathologie αSyn commence dans la muqueuse intestinale et l’épithélium olfactif36 et, probablement, la réponse des lymphocytes T spécifiques à αSyn ainsi que12. Par la suite, les agrégats αSyn migreraient à travers le nerf vague vers le tronc cérébral, déclenchant la neuroinflammation et la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques12. Bien que le modèle AAV-hαSyn récapitule la plupart des aspects de la maladie de Parkinson, il n’y a pas d’implication évidente de l’agrégation pathologique d’αSyn dans des emplacements extra-cérébraux dans ce modèle. Un modèle alternatif impliquant la pathologie hαSyn approprié pour étudier ces aspects de la maladie de Parkinson pourrait être des souris transgéniques surexprimant hαSyn sous le contrôle du promoteur Thy1, le modèle Thy1-SNCA 37, dans lequel le développement de la maladie dépend du microbiote intestinal et implique une déficience gastro-intestinale évidente38.
Bien qu’il soit utile pour l’étude des divers processus associés à la physiopathologie de la maladie de Parkinson, le présent modèle murin implique des étapes critiques qui doivent être minutieusement vérifiées, y compris la livraison correcte des vecteurs viraux dans les coordonnées spatiales correspondantes, l’expression sélective de hαSyn dans les neurones (qui dépend du sérotype AAV et de la construction vectorielle), et la dose et le moment appropriés de l’AAV avant d’analyser le phénotype parkinsonien. L’analyse de la bonne administration des vecteurs viraux dans le SN est nécessaire, car l’utilisation des coordonnées spatiales correctes du SN peut ne pas suffire lorsque l’aiguille n’est pas entièrement droite, ce qui est parfois imperceptible à l’œil humain. De plus, la diffusion des vecteurs AAV dépend du sérotypeAAV 39. Pour ces raisons, il est nécessaire d’effectuer des contrôles de qualité périodiques vérifiant l’administration et la diffusion correctes des vecteurs AAV-GFP injectés après l’observation de GFP dans des tranches de cerveau contenant la zone du SN.
En ce qui concerne l’expression sélective de hαSyn dans les neurones, en principe, l’expression de hαSyn pourrait être conçue pour être contrôlée par un promoteur sélectif pour les neurones ou, plus précisément encore, sélectif pour les neurones dopaminergiques, comme l’utilisation du promoteur TH dans les vecteurs AAV pour induire l’expression sélective des gènes dans les neurones dopaminergiques40 . Cependant, cette stratégie ne fonctionne pas lorsque ce qui est recherché est la surexpression du gène d’intérêt. Pour cette raison, dans le présent modèle, il est essentiel d’utiliser un promoteur fort (un promoteur induisant une forte expression du gène en aval) et des sérotypes AAV avec tropisme neuronal. Dans cette étude, le promoteur de l’ACA a été utilisé comme promoteur puissant pour induire la surexpression de hαSyn, et le sérotype AAV5 a été utilisé pour le vecteur viral. Ce sérotype a déjà été utilisé pour transduire les neurones de souris et de rats41,42. Ici, les résultats ont démontré que, 12 semaines après l’administration d’AAV5-GFP dans le SN de souris, la fluorescence verte était sélectivement présente sur le côté ipsilatéral du SN et du striatum (Figure 1), indiquant la transduction efficace des neurones de la voie nigrostriatale.
Un autre aspect critique de ce modèle murin de la maladie de Parkinson est le temps nécessaire pour analyser un processus particulier après la chirurgie. À cet égard, ce travail montre une étude cinétique des différents processus impliqués dans la pathologie. Étant donné que les points temporels clés changent avec la dose de génomes viraux administrée par souris, le sérotype d’AAV utilisé, ou même avec le lot d’AAV utilisé, une analyse dose-réponse de la quantité d’AAV-αSyn nécessaire pour induire une perte significative de neurones TH + et une déficience motrice a d’abord été effectuée. Des études antérieures ont montré une déficience motrice significative et une perte de neurones TH + de la voie nigrostriatale après 12 semaines d’injections d’AAV-αSyn chez la souris à des doses allant de 6 x 108–3 x10 10 génomes viraux par souris 16,17,30,31. En conséquence, la dose d’AAV-hαSyn utilisée pour induire l’expression de hαSyn dans la voie nigrostriatale, la perte de neurones TH+ et la déficience motrice chez la souris variait de 1 x 108–1 x 1010 génomes viraux par souris. De plus, pour contrôler que la perte de neurones TH+ et la déficience motrice étaient induites par la surexpression de hαSyn dans le SN et non par l’infection AAV des neurones du SN, des groupes témoins ont été inclus dans lesquels le codage AAV pour un gène rapporteur (AAV-eGFP) a été administré unilatéralement dans le SN de souris et la neurodégénérescence et la déficience motrice ont été déterminées. Les résultats ont montré que, 12 semaines après la chirurgie stéréotaxique, 1 x 1010 génomes viraux par souris était une dose appropriée d’AAV5-hαSyn, car les souris recevant cette charge virale présentaient une hαSyn significative dans la voie nigrostriatale (Figure 2 et Figure 3), une perte de neurones TH+ (Figure 4) et une déficience motrice (Figure 5). En revanche, des doses plus faibles d’AAV5-hαSyn (1 x 108 génomes viraux par souris et 1 x 109 génomes viraux par souris) n’étaient pas assez fortes pour atteindre des changements significatifs dans tous ces paramètres ensemble (figures 2-4). Il est à noter que l’administration d’AAV-GFP à 1 x10 10 génomes viraux par souris a induit un degré faible (~20%), mais significatif de perte des neurones TH+ des neurones dopaminergiques nigrals (Figure 4A,B). Ce résultat concorde avec les observations précédentes utilisant ce modèle41 et est probablement la conséquence d’un faible niveau de neuroinflammation induit par l’administration de vecteurs AAV dans le SN. Néanmoins, l’étendue de la perte de neurones TH+ était significativement plus élevée chez les souris recevant AAV5-hαSyn par rapport à celles recevant la même dose d’AAV-GFP (Figure 4C). Il est à noter que la cinétique de l’expression de hαSyn dépend non seulement de l’efficacité de la transduction, mais aussi de l’étendue de la diffusion de l’AAV39. Étant donné que la diffusion de l’AAV dépend du sérotype de l’AAV, les points temporels clés précis de ce modèle animal peuvent varier lors de l’utilisation d’un autre sérotype d’AAV différent de l’AAV5.
Par la suite, une analyse cinétique a été réalisée en utilisant 1 x 1010 génomes viraux par souris pour déterminer les points temporels clés dans ce modèle murin. Étant donné que les preuves actuelles ont montré certains symptômes précoces qui apparaissent avant la déficience motrice, ce qui permettrait le diagnostic précoce de la maladie de Parkinson 43,44, ces expériences ont cherché à trouver le moment où l’expression de hαSyn était déjà évidente, mais en l’absence de déficience motrice. Les résultats montrent que l’apparition de l’expression de hαSyn dans le SN a eu lieu 5 semaines après l’administration stéréotaxique d’AAV-hαSyn (Figure 6). Ce point temporel constitue un point temporel intéressant pour commencer à administrer des thérapies adaptées pour arrêter les processus neuro-inflammatoires et neurodégénératifs. D’autres points temporels clés déterminés ici étaient les heures de pointe pour deux événements critiques associés au processus de neuroinflammation: le moment où la microglie atteint le degré maximal d’activation et le temps d’infiltration maximale des lymphocytes T dans le SN. Les résultats ont montré une courbe avec une tendance atteignant deux vagues d’activation microgliale maximale, la première à 10 semaines après la chirurgie et la seconde à 15 semaines après la chirurgie (Figure 7). L’analyse cinétique de l’infiltration des lymphocytes T a montré le pic d’infiltration du Treg dans le SN à 11 semaines après la chirurgie stéréotaxique (Figure 8). Étonnamment, aucun lymphocyte T effecteur (CD4+ Foxp3–) n’a été détecté infiltrant le SN au cours de la période analysée (semaines 8 à 13 après la chirurgie). Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent un laps de temps approprié pour commencer à administrer des thérapies visant à arrêter le processus de neuroinflammation et à atténuer l’infiltration des lymphocytes T dans le SN à l’aide de ce modèle préclinique, qui varie entre la semaine 5 après la chirurgie (le début de la surexpression de hαSyn) et la semaine 10 après la chirurgie (la première vague de neuroinflammation et d’infiltration des lymphocytes T) (Figure 9).
Figure 9: Résumé des principaux points temporels trouvés pour ce modèle animal. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le Dr Sebastián Valenzuela et le Dr Micaela Ricca pour leur précieuse assistance vétérinaire dans notre établissement pour animaux. Ce travail a été soutenu par « Financiamiento Basal para Centros Científicos y Tecnológicos de Excelencia de ANID » Centro Ciencia & Vida, FB210008 (à la Fundación Ciencia & Vida), et le Geroscience Center for Brain Health and Metabolism, FONDAP-15150012. Ce travail a également été financé par les subventions FONDECYT-1210013 (à R.P.) et FONDECYT-1150766 (à F.C.) de « Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo de Chile (ANID) » et MJFF-10332.01 (à R.P.) et MJFF-17303 (à F.C.) de la Fondation Michael J Fox pour la recherche sur la maladie de Parkinson.
ANIMALS AND ANIMAL FOOD | |||
Foxp3-GFP C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock No: 023800 | |
Laboratory Rodent Diet | LabDiet | Rodent Diet 5001 | Standard Rodent diet |
Wild-type C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock No: 000664 | |
VIRAL VECTORS | |||
AAV5-CBA-αSyn | University of Iowa Viral Vector Core Facility | N/A | Stock concentration at 10E13 vg/mL |
AAV5-CBA-eGFP | University of Iowa Viral Vector Core Facility | N/A | Stock concentration at 9.5 x 10E12 vg/mL |
ANESTHETICS AND ANALGESICS | |||
Isoflurane | Baxter | 218082 | 1% for stereotaxic surgery |
Ketamine | Drag Pharma | CHE30 | 70 mg/Kg for stereotaxic surgery |
Sevoflurane | Baxter | VE2L9117 | For before transcardial perfusion |
Tramadol | Drag Pharma | DPH134 | 30 mg/Kg every 24 h |
Xylazine | Centrovet | EHL40 | 9 mg/kg for stereotaxic surgery |
EQUIPMENT | |||
Beam test | Home made | N/A | horizontal beam 25 cm length and 3 cm width. The beam surface was covered by a metallic grid (1 cm2). |
Cryostate | Leica | CM1520 | |
Digital camera | Nikon | S2800 Coolpix | For recording the beam test performance |
Microscope | Olympus | BX51 | Used for IHC analysis (section 4.4) |
Microscope | Olympus | IX71 | Used for IF analysis (section 5.3) |
Microscope | Leica | DMI8 | Used for IF analysis (section 5.7) |
New Standard Stereotaxic, mouse | Stoelting, Wood Dale, IL, USA | 51500 | stereotaxic frame for surgery |
Peristaltic Pump | Masterflex | C-flex L/S16 | |
Power supply unit | Olympus | U-RFL-T | Used for IF analysis (section 5.3) |
Surgical suture | Sylkam®, B Braun | C0760171 | |
Syringe 100 U | BD | 324918 | For anesthesia before transcardial perfusion, 29G needle |
Syringe RN 5uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | HA-7641-01 | For viral vector innoculation |
BUFFERS AND REAGENTS | |||
Aviden, Peroxidase Conjugate | Merck, Darmstadt, Germany | 189728 | |
Bovine Serum Albumin | Merck, Darmstadt, Germany | 9048-46-8 | |
Cryotrotection buffer | Home made | N/A | 20% glycerine and 2% DMSO in PBS |
DAPI | Abcam | ab228549 | |
Diaminobenzidine | Merck, Darmstadt, Germany | D8001 | |
Fluoromount -G T | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
Gelatin | Merck, Darmstadt, Germany | 104078 | |
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 5000121 | |
Paraformaldehyde | Merck, Darmstadt, Germany | 104005 | |
PBS | Home made | N/A | 0.125 M, pH 7.4 |
Peroxidase inactivating buffer | Home made | N/A | 0.03% H2O2 in methanol |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | |
Trizma Hydrochloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1185-53-1 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | 822184 | |
ANTIBODIES | |||
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 111065003 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A11010 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A21244 | |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A11081 | |
Rabbit monoclonal anti-alpha-Synuclein | Abcam | ab138501 | |
Rabbit monoclonal anti-Iba-1 | Abcam | EPR16588 | |
Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | |
Rat monoclonal anti-CD4 | Biolegend | 100402 | |
SOFTWARES | |||
GraphPad | Prism | 6.0 | Fos stats analysis |
ImageJ | National Institute of Health | N/A | For image analysis |
LAS X | Leica | N/A | For image capture with Leica microscope |
ProgRes Capture Pro | Jenoptik | N/A | For image capture with Olympus microscope |
VLC media player | VideoLAN Organization | N/A | For analysis of behavioural tests |