Bir Döner Hücre Kültür Sistemi Kullanarak Simüle Edilmiş Mikrogravitede Lenfositlerin Kültürlenmesi

Uzay uçuşunun, bağışıklık sistemi de dahil olmak üzere insan fizyolojisinin birçok yönünü etkilediği gösterilmiştir. Birçok çalışma, in vivo uzay uçuşu ve in vitro 1,2,3,4 simüle edilmiş mikro yerçekimine (SMG) maruz kalmanın bir sonucu olarak immün disregülasyonun kanıtlarını göstermiştir. İnsan fizyolojisini etkileyen uzay ortamının önemli bir yönü mikro yerçekimidir. Mikro yerçekimi, uzay ortamındaki düşük yerçekimi kuvvetleri nedeniyle yaşanan “ağırlıksızlığı” ifade eder⁵. İnsanlık Ay ve Mars’a daha uzun uzay görevlerine hazırlanırken, astronotlardaki ciddi sağlık risklerini azaltmak için daha fazla araştırma yapılması gerekiyor.

Bilimsel araştırmalar için gerçek mikro yerçekimi koşulları, Uluslararası Uzay İstasyonu’ndaki (ISS) uzayda veya yörüngeye fırlatılan nanouydularda elde edilebilir; ancak, bu seçeneklerin düzenlenmesi inanılmaz derecede maliyetli ve karmaşık olabilir. Uzayda biyolojik araştırma yapmanın mevcut sınırlamaları göz önüne alındığında, Dünya’da gerçek mikro yerçekimi ve SMG’yi indüklemek için çeşitli seçenekler mevcuttur. Düşme kuleleri, parabolik uçuş ve sondaj roketleri de dahil olmak üzere Dünya’da kısa süreli gerçek mikro yerçekimi üretebilen büyük ölçekli operasyonlar mevcuttur. Bununla birlikte, bu yöntemler, büyük ölçüde kısa süreli mikro yerçekimi muamelesi (yani, saniyeler ila 20 dakika) nedeniyle, mikro yerçekiminin biyolojik sistemler üzerindeki etkilerini incelemek için aşırı derecede uygun değildir. Bu yöntemler başka yerlerde daha ayrıntılı olarak tartışılmıştır ^5,6. Biyolojik hücre kültürü için uygun olan seçenekler arasında 2D klinostatlar veya döner duvar kabı (RWV) cihazları ve 3D klinostatlar veya rastgele konumlandırma makineleri (RPM) gibi küçük ölçekli cihazlar bulunur. Bu cihazlar, 37 ° C ve% 5 CO_2’de tutulan hücre kültürü inkübatörlerinin içine kurulabilir ve hücre kültürünü yatay bir eksende (2D) veya iki dikey eksende (3D)⁵ döndürürler. Bununla birlikte, bu kültürleme yöntemlerinin, biyolojik araştırma bağlamları için uzayda en uygun şekilde elde edilen gerçek mikro yerçekiminin aksine SMG ürettiğini vurgulamak önemlidir.

Bu makalenin amacı, 2D klinostat sınıflandırmasına giren ticari olarak temin edilebilen bir RWV cihazı (Malzeme Tablosu) kullanarak lenfositleri SMG’ye maruz bırakma adımlarını özetlemektir. Bu cihazı çalıştırmak için üreticiden genel bir protokol mevcut olsa da, mevcut makale sorun giderme ve optimizasyon adımlarını daha ayrıntılı olarak ele almayı amaçlamaktadır. Bu makale ayrıca, bu cihazın süspansiyon hücre kültüründe, özellikle lenfositlerle SMG üretmek için nasıl çalıştığının arkasındaki teoriyi de kapsamaktadır. Bu bağlamda, süspansiyon hücre kültürü, herhangi bir ek iskeleye bağlı kalmadan, takviye edilmiş kültür ortamında serbestçe büyüyen hücreleri ifade eder. Birçok hücre tipi, lenfositler de dahil olmak üzere süspansiyon hücre kültüründe yetiştirilir. Lenfositler, lenfoid organlarda ve kan dolaşımında bulunan T, B ve Doğal Öldürücü (NK) hücreleri de dahil olmak üzere bağışıklık sisteminin hücreleridir⁷.

Burada tarif edilen RWV 2D klinostat, zaman ortalamalı yerçekimi vektörü nullification 5,6,8,9 prensibi üzerinde çalışır^, bu sayede yerçekimi vektörü, hücre kültürünün yatay bir eksen üzerinde dönmesiyle randomize edilir. Bu, kültür kabının dönme hızını hücrelerin çökeltme hızıyla eşleştirerek elde edilir. Kültür kabının dönme hızı, hücrelerin çökelme hızıyla iyi eşleştiği sürece, hücreler serbest düşüşte tutulur ve uzay ortamında yaşandığı gibi çökelemez. İlk hızlanma aşamasından sonra, kültür kabındaki ortam zamanla “katı vücut rotasyonuna” ulaşır. Bu yatay rotasyon aynı zamanda hücre kültürü damarında laminer akışı indükler. Bu, laminer akışla hücreler üzerinde indüklenen kayma stresinin türbülanslı akıştan çok daha az olduğu göz önüne alındığında, “düşük kesme” ortamı yaratır. Bununla birlikte, klinostatın mükemmel bir sistem olmadığı göz önüne alındığında, hücreler üzerinde minimum kayma stresi yaratan bazı küçük, laminer sıvı hareketleri vardır. Bu nedenle, medyada asılı kalan hücreler, dönme sırasında bu akış tarafından sürüklenir. Yatay dönme sırasında, yerçekimi vektörü hücrelere etki eder ve onları Şekil 1’de görselleştirildiği gibi salınımlı bir yörüngeye getirir. Bir başka küçük kayma stresi kaynağı, hücrelerin ortamdan “düşmesi” ve hücrelerin etrafında laminer akışa neden olmasından kaynaklanır. Kültür kabı yatay bir eksen üzerinde dönerken, hücrelerin deneyimlediği yerçekimi vektörü de döner. Zamanla, bu dönen yerçekimi vektörü sıfıra yaklaşmak için ortalamaya ulaşır; Bu fenomene zaman ortalamalı yerçekimi vektörü nullifikasyonu denir ve SMG ^5,6,8,9 durumunu indükler. Bu cihaz, SMG’nin bazıları^10,11,12 referanslarında ele alınan birçok hücre tipi üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılmıştır. Daha fazla örnek, cihaz üreticisinin web sitesinde bulunabilir.

Bu RWV cihazı, cihaz üreticisi tarafından sunulan özel “yüksek en boy oranlı kaplar” (HARV’ler) kullanır. Bu HARR’ların her biri 10 mL hücre kültürü tutar; ancak 50 mL HARV’ler de mevcuttur. 10 mL veya 50 mL HARV’ler, tartışma bölümünde daha ayrıntılı olarak özetlenen herhangi bir aşağı akış deneysel tahlilini tamamlamak için kaç hücreye ihtiyaç duyulduğuna bağlı olarak kullanılabilir. HARV’ler polikarbonattan yapılmıştır ve hücre kültürü sırasında gaz değişimine izin vermek için bir silikon oksijenasyon membranı içerir. Bu, hücre ortamının pH’ını korur ve verimli hücresel solunuma izin verir. Kabın yüzünde bir ana dolum portu ve iki adet kapaklı şırınga portu bulunmaktadır (Şekil 2A). Hücre kültürünü ana dolum portundan yükledikten sonra, kabarcığın çıkarılmasına yardımcı olmak için kaba iki şırınga yüklenir. 10 mL’lik damarları kullanırken, iki adet 3 mL’lik şırınga iyi çalışır. Bir şırınga cihaza boş olarak bağlanır, şırınga tamamen bastırılır ve diğeri 3 mL hücre kültürü ile doldurulur (Şekil 2E). Bunlar, SMG tedavisini sürdürmek için önemli olan kabarcıkları damardan çıkarmak için kombinasyon halinde kullanılır. Genel olarak, “Flask” kontrolü ve “1G” kontrolü olarak adlandırılabilecek iki negatif kontrolün kurulması önerilir. “Flask” kontrolü, standart bir T25 süspansiyon hücre kültürü şişesinde yetiştirilen hücrelere karşılık gelir. 1G kontrolü, inkübatöre basitçe yerleştirilen (yani, SMG işlemine tabi tutulmadan) özel 10 mL kültür kabında yetiştirilen hücrelere karşılık gelir. Denetimler hakkında daha fazla ayrıntı için lütfen Tartışma bölümüne bakın.

Burada açıklanan yöntem, SMG’nin lenfositler üzerindeki etkilerini incelemek isteyen herhangi bir araştırmacı için, NK92 hücre hattı^13’ü kullanarak NK hücrelerine özel bir odaklanma ile uygundur. Bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar, uzay uçuşunun insan bağışıklık sistemi üzerindeki olumsuz etkilerini daha iyi anlamamıza ve hafifletmemize yardımcı olabilir.