Культивирование лимфоцитов в условиях смоделированной микрогравитации с использованием роторной системы культивирования клеток

Было показано, что космический полет влияет на многие аспекты физиологии человека, включая иммунную систему. Многие исследования продемонстрировали доказательства иммунной дисрегуляции в результате космического полета in vivo и воздействия моделируемой микрогравитации (SMG) in vitro^1,2,3,4. Одним из основных аспектов космической среды, влияющих на физиологию человека, является микрогравитация. Микрогравитация относится к «невесомости», испытываемой из-за низких гравитационных сил в космической среде⁵. По мере того, как человечество готовится к более длительным космическим миссиям на Луну и Марс, необходимо провести дополнительные исследования, чтобы снизить серьезные риски для здоровья астронавтов.

Реальные условия микрогравитации для научных исследований могут быть достигнуты в космосе на борту Международной космической станции (МКС) или в наноспутниках, выводимых на орбиту; Однако эти варианты могут быть невероятно дорогостоящими и сложными в управлении. Учитывая текущие ограничения проведения биологических исследований в космосе, существует несколько вариантов индуцирования реальной микрогравитации и SMG на Земле. Существуют крупномасштабные операции, которые могут создавать короткие периоды реальной микрогравитации на Земле, включая падающие башни, параболический полет и зондирующие ракеты. Однако эти методы не слишком подходят для изучения воздействия микрогравитации на биологические системы, в основном из-за их коротких периодов обработки в условиях микрогравитации (т.е. от секунд до 20 минут). Эти методы более подробно обсуждаются в другом месте ^5,6. Варианты, которые подходят для биологической культуры клеток, включают в себя небольшие устройства, такие как 2D-клиностаты или устройства с вращающимися стенками (RWV), а также 3D-клиностаты или машины случайного позиционирования (RPM). Эти устройства могут быть установлены внутри инкубаторов клеточных культур, поддерживаемых при температуре 37 °C и 5% CO₂, и они вращают клеточную культуру либо по горизонтальной оси (2D), либо по двум перпендикулярным осям (3D)⁵. Тем не менее, важно подчеркнуть, что эти методы культивирования производят SMG в отличие от реальной микрогравитации, которая наиболее реально достигается в космосе для биологических исследований.

Цель настоящей статьи состоит в том, чтобы описать этапы воздействия на лимфоциты SMG с использованием коммерчески доступного устройства RWV (таблица материалов), которое подпадает под классификацию 2D-клиностата. Несмотря на то, что от производителя доступен общий протокол для работы с этим устройством, текущая статья направлена на более подробное рассмотрение шагов по устранению неполадок и оптимизации. В этой статье также рассматривается теория, лежащая в основе того, как это устройство работает для производства SMG в культуре суспензионных клеток, особенно с лимфоцитами. В этом контексте суспензионная клеточная культура относится к клеткам, свободно растущим в добавленных питательных средах, без прилипания к каким-либо дополнительным каркасам. Многие типы клеток выращиваются в культуре суспензионных клеток, включая лимфоциты. Лимфоциты – это клетки иммунной системы, включая Т, В и естественные клетки-киллеры (NK), которые находятся в лимфоидных органах и кровотоке⁷.

Описанный здесь клиностат RWV 2D работает по принципу усредненного по времени обнуления вектора гравитации 5,6,8,9^, при котором вектор силы тяжести рандомизируется путем вращения культуры клеток вокруг горизонтальной оси. Это достигается путем согласования скорости вращения культивального сосуда со скоростью осаждения клеток. До тех пор, пока скорость вращения культурального сосуда хорошо согласуется со скоростью осаждения клеток, клетки находятся в свободном падении и не могут осаждаться, как это происходит в космической среде. После начальной фазы ускорения среда в сосуде для культивирования со временем достигает «вращения твердого тела». Это горизонтальное вращение также индуцирует ламинарный поток в сосуде клеточной культуры. Это создает среду «с низким сдвигом», учитывая, что напряжение сдвига, индуцированное на ячейки ламинарным потоком, намного меньше, чем у турбулентного потока. Однако, учитывая, что клиностат не является идеальной системой, вводятся небольшие движения ламинарной жидкости, которые оказывают минимальное напряжение сдвига на клетки. Таким образом, клетки, взвешенные в среде, увлекаются этим потоком во время вращения. Во время горизонтального вращения вектор силы тяжести воздействует на клетки и выводит их на колеблющуюся траекторию, как показано на рисунке 1. Другой небольшой источник напряжения сдвига вызван тем, что клетки «падают» через среду, вызывая ламинарный поток вокруг клеток. Когда культуральный сосуд вращается вокруг горизонтальной оси, вектор тяжести, испытываемый клетками, также вращается. Со временем этот вращающийся вектор гравитации в среднем приближается к нулю; это явление называется усредненным по времени обнулением вектора гравитации и индуцирует состояние SMG 5,6,8,9. Это устройство использовалось для изучения воздействия SMG на многие типы клеток, некоторые из которых описаны в ссылках^10,11,12. Больше примеров можно найти на сайте производителя устройства.

В этом устройстве RWV используются специализированные «сосуды с высоким соотношением сторон» (HARV), доступные у производителя устройства. Каждый из этих HARV содержит 10 мл клеточной культуры; тем не менее, 50 мл HARV также доступны. Можно использовать либо 10 мл, либо 50 мл HARV в зависимости от того, сколько клеток необходимо для завершения любых последующих экспериментальных анализов, которые описаны далее в разделе обсуждения. HARV изготовлены из поликарбоната и включают силиконовую мембрану оксигенации, обеспечивающую газообмен во время культивирования клеток. Это поддерживает рН клеточной среды и обеспечивает эффективное клеточное дыхание. На лицевой стороне сосуда имеется основное заливное отверстие и два закрытых отверстия для шприцев (рис. 2A). После загрузки клеточной культуры через основное заливное отверстие в сосуд загружаются два шприца, чтобы помочь в удалении пузырьков. При использовании сосудов объемом 10 мл хорошо работают два шприца по 3 мл. Один шприц прикрепляется к устройству пустым, при этом шприц полностью нажат, а другой прикрепляется заполненным 3 мл клеточной культуры (рис. 2E). Они используются в комбинации для удаления пузырьков из сосуда, что важно для поддержания лечения SMG. Как правило, рекомендуется установить два отрицательных элемента управления, которые можно назвать контролем «Колба» и контролем «1G». Контроль «Колба» соответствует клеткам, которые выращиваются в стандартной колбе для культуры суспензионных клеток T25. Контроль 1G соответствует клеткам, которые выращиваются в специализированном сосуде для культивирования объемом 10 мл, который просто помещается в инкубатор (т.е. без обработки SMG). Дополнительные сведения об элементах управления см. в разделе «Обсуждение».

Описанный здесь метод подходит для любого исследователя, желающего изучить влияние SMG на лимфоциты, с особым акцентом на NK-клетки с использованием клеточной линии^{NK92 13}. Результаты этих исследований могут помочь нам лучше понять и смягчить неблагоприятное воздействие космического полета на иммунную систему человека.