回転細胞培養システムを用いた模擬微小重力下でのリンパ球の培養

宇宙飛行は、免疫系を含む人間の生理学の多くの側面に影響を与えることが示されています。多くの研究は、in vivoでの宇宙飛行およびin vitroでのシミュレートされた微小重力(SMG)への曝露の結果としての免疫調節不全の証拠を示しています 1,2,3,4。人間の生理学に影響を与える宇宙環境の主要な側面の1つは、微小重力です。微小重力とは、宇宙環境における低い重力によって経験される「無重力」を指します⁵。人類が月と火星へのより長い宇宙ミッションの準備をするにつれて、宇宙飛行士の深刻な健康リスクを軽減するためにより多くの研究が行われる必要があります。

科学研究のための実際の微小重力条件は、国際宇宙ステーション(ISS)に搭載された宇宙または軌道に打ち上げられた超小型衛星で達成することができます。ただし、これらのオプションは、調整に非常にコストがかかり、複雑になる可能性があります。宇宙で生物学的研究を行うことの現在の限界を考えると、地球上で実際の微小重力とSMGを誘発するためのいくつかの選択肢が存在します。ドロップタワー、放物線飛行、観測ロケットなど、地球上で短期間の実際の微小重力を生み出すことができる大規模な操作が存在します。しかしながら、これらの方法は、主にそれらの短期間の微小重力処理(すなわち、数秒から20分)のために、生物学的システムに対する微小重力の影響を研究するのにあまり適していない。これらの方法については、他の場所でより詳細に説明^{されています5,6}。生物学的細胞培養に適したオプションには、2Dクリノスタットまたは回転壁容器(RWV)デバイス、3Dクリノスタットまたはランダムポジショニングマシン(RPM)などの小規模デバイスが含まれます。これらのデバイスは、37°Cおよび5%_CO2に維持された細胞培養インキュベーター内に設置することができ、水平軸(2D)または2つの垂直軸(3D⁾⁵のいずれかで細胞培養を回転させます。ただし、これらの培養方法は、生物学的研究のコンテキストで宇宙で最も実現可能な実際の微小重力とは対照的に、SMGを生成することを強調することが重要です。

現在の論文の目的は、2Dクリノスタット分類に該当する市販のRWVデバイス(材料表)を使用してリンパ球をSMGにさらすための手順を概説することです。このデバイスを操作するための一般的なプロトコルは製造元から入手できますが、現在の記事では、トラブルシューティングと最適化の手順をより詳細に説明することを目的としています。この記事では、このデバイスが浮遊細胞培養、特にリンパ球でSMGを生成するためにどのように機能するかの背後にある理論についても説明します。これに関連して、浮遊細胞培養とは、追加の足場に付着することなく、補充された培養培地中で自由に増殖する細胞を指す。リンパ球を含む多くの細胞型が浮遊細胞培養で増殖します。リンパ球は、T、B、およびナチュラルキラー(NK)細胞を含む免疫系の細胞であり、リンパ器官および血流に存在する⁷。

ここで説明するRWV 2Dクリノスタットは、時間平均重力ベクトル無効化5,6,8,9の原理に基づいて動作し、重力ベクトルは細胞培養物を水平軸上で回転させることによってランダム化される。これは、培養容器の回転速度を細胞の沈降速度に一致させることによって達成される。培養容器の回転速度が細胞の沈降速度とよく一致している限り、細胞は自由落下に保たれ、宇宙環境で経験したように沈降することはできません。最初のスピードアップ段階の後、培養容器内の培地は最終的に時間の経過とともに「固体回転」に達します。この水平回転はまた、細胞培養容器内の層流を誘導する。これは、層流によって細胞に誘発されるせん断応力が乱流のせん断応力よりもはるかに小さいことを考えると、「低せん断」環境を作り出します。ただし、クリノスタットが完全なシステムではないことを考えると、細胞に与えるせん断応力を最小限に抑える小さな層流運動が導入されています。そのため、培地に浮遊している細胞は、回転中にこの流れによって引きずられます。水平回転中、重力ベクトルは細胞に作用し、図1に示すように細胞を振動軌道に導きます。せん断応力の別の小さな原因は、細胞が培地を通って「落下」し、細胞の周囲に層流を引き起こすことによって引き起こされます。培養容器が水平軸を中心に回転すると、細胞が経験する重力ベクトルも回転します。時間の経過とともに、この回転する重力ベクトルは平均してゼロに近づきます。この現象は時間平均重力ベクトル無効化と呼ばれ、SMG ^5,6,8,9の状態を誘発する。この装置は、多くの種類の細胞に対するSMGの影響を研究するために使用されており、そのうちのいくつかは参考文献10^、11、12でカバーされています。その他の例は、デバイスの製造元の Web サイトにあります。

このRWVデバイスは、デバイスメーカーから入手できる特殊な「高アスペクト比船舶」(HARV)を使用しています。これらのHARVはそれぞれ10 mLの細胞培養を保持します。ただし、50mLのHARVも入手可能です。10 mLまたは50 mLのHARVは、ダウンストリームの実験アッセイを完了するために必要な細胞数に応じて使用できます。HARVはポリカーボネート製で、細胞培養中のガス交換を可能にするシリコーン酸素化膜を備えています。これにより、細胞培地のpHが維持され、効率的な細胞呼吸が可能になります。容器の表面には、メイン充填ポートと2つのキャップ付きシリンジポートがあります(図2A)。細胞培養物をメイン充填ポートにロードした後、2つのシリンジを容器にロードして、気泡の除去を支援します。10 mL容器を使用する場合は、2つの3 mLシリンジがうまく機能します。一方のシリンジを空のデバイスに取り付け、シリンジを完全に押し下げ、もう一方のシリンジを3 mLの細胞培養液で満たして取り付けます(図2E)。これらは、SMG処理を維持するために重要な容器から気泡を除去するために組み合わせて使用されます。一般に、「フラスコ」コントロールと「1G」コントロールと呼ばれる2つのネガティブコントロールを設定することをお勧めします。「フラスコ」コントロールは、標準的なT25浮遊細胞培養フラスコ中で増殖される細胞に対応する。1Gコントロールは、インキュベーターに入れるだけの特殊な10 mL培養容器内で増殖する細胞に対応します(つまり、SMG処理を受けることなく)。コントロールの詳細については、「ディスカッション」セクションを参照してください。

ここで説明する方法は、NK92細胞株¹³を使用してNK細胞に特に焦点を当てて、リンパ球に対するSMGの影響を研究しようとしている研究者に適しています。これらの研究の結果は、宇宙飛行が人間の免疫系に及ぼす悪影響をよりよく理解し、軽減するのに役立つ可能性があります。