Het kweken van lymfocyten in gesimuleerde microzwaartekracht met behulp van een roterend celkweeksysteem

Van ruimtevaart is aangetoond dat het vele aspecten van de menselijke fysiologie beïnvloedt, waaronder het immuunsysteem. Veel studies hebben bewijs aangetoond van immuunontregeling als gevolg van ruimtevluchten in vivo en blootstelling aan gesimuleerde microzwaartekracht (SMG) in vitro 1,2,3,4. Een belangrijk aspect van de ruimteomgeving dat de menselijke fysiologie beïnvloedt, is microzwaartekracht. Microzwaartekracht verwijst naar de “gewichtloosheid” die wordt ervaren als gevolg van lage zwaartekrachten in de ruimteomgeving⁵. Terwijl de mensheid zich voorbereidt op langere ruimtemissies naar de maan en Mars, moet er meer onderzoek worden gedaan om ernstige gezondheidsrisico’s bij astronauten te beperken.

Echte microzwaartekrachtcondities voor wetenschappelijk onderzoek kunnen worden bereikt in de ruimte aan boord van het International Space Station (ISS) of in nanosatellieten die in een baan om de aarde worden gelanceerd; Deze opties kunnen echter ongelooflijk duur en complex zijn om te orkestreren. Gezien de huidige beperkingen van het uitvoeren van biologisch onderzoek in de ruimte, bestaan er verschillende opties voor het induceren van echte microzwaartekracht en SMG op aarde. Er bestaan grootschalige operaties die korte perioden van echte microzwaartekracht op aarde kunnen produceren, waaronder valtorens, parabolische vluchten en klinkende raketten. Deze methoden zijn echter niet overdreven geschikt voor het bestuderen van de effecten van microzwaartekracht op biologische systemen, grotendeels vanwege hun korte perioden van microzwaartekrachtbehandeling (d.w.z. seconden tot 20 minuten). Deze methoden worden elders nader besproken ^5,6. Opties die geschikt zijn voor biologische celkweek zijn kleinschalige apparaten zoals 2D-clinostaten of rwv-apparaten (rotating wall vat) en 3D-clinostaten of random positioning machines (RPM). Deze apparaten kunnen worden opgesteld in celkweekincubatoren die op 37 °C en 5% CO₂ worden gehouden, en ze roteren de celcultuur op een horizontale as (2D) of op twee loodrechte assen (3D)⁵. Het is echter belangrijk om te benadrukken dat deze kweekmethoden SMG produceren in tegenstelling tot echte microzwaartekracht, die het meest haalbaar is in de ruimte voor biologische onderzoekscontexten.

Het doel van dit artikel is om de stappen te schetsen voor het onderwerpen van lymfocyten aan SMG met behulp van een in de handel verkrijgbaar RWV-apparaat (Table of Materials), dat onder de 2D-clinostatclassificatie valt. Hoewel er een algemeen protocol beschikbaar is van de fabrikant voor het gebruik van dit apparaat, is het huidige artikel bedoeld om de stappen voor probleemoplossing en optimalisatie in meer detail te behandelen. Dit artikel behandelt ook de theorie achter hoe dit apparaat werkt om SMG te produceren in suspensiecelcultuur, met name met lymfocyten. In deze context verwijst suspensiecelcultuur naar cellen die vrij groeien in aangevulde kweekmedia, zonder zich te hechten aan extra steigers. Veel celtypen worden gekweekt in suspensiecelcultuur, waaronder lymfocyten. Lymfocyten zijn cellen van het immuunsysteem, waaronder T-, B- en Natural Killer (NK) -cellen, die zich in lymfoïde organen en de bloedbaan bevinden⁷.

De hier beschreven RWV 2D-clinostaat werkt volgens het principe van tijdgemiddelde zwaartekrachtvector-nullificatie 5,6,8,9^, waarbij de zwaartekrachtvector wordt gerandomiseerd door rotatie van de celcultuur op een horizontale as. Dit wordt bereikt door de rotatiesnelheid van het kweekvat af te stemmen op de sedimentatiesnelheid van de cellen. Zolang de rotatiesnelheid van het kweekvat goed is afgestemd op de sedimentatiesnelheid van de cellen, worden de cellen in vrije val gehouden en kunnen ze niet bezinken, zoals ervaren in de ruimteomgeving. Na een eerste versnellingsfase bereiken de media in het kweekvat uiteindelijk na verloop van tijd “vaste lichaamsrotatie”. Deze horizontale rotatie induceert ook laminaire stroming in het celkweekvat. Dit creëert een “low shear” -omgeving, aangezien de schuifspanning die door laminaire stroming op de cellen wordt veroorzaakt, veel minder is dan die van turbulente stroming. Aangezien de clinostaat echter geen perfect systeem is, zijn er enkele kleine, laminaire vloeistofbewegingen geïntroduceerd, die minimale schuifspanning op de cellen veroorzaken. Als zodanig worden de cellen die in de media zweven tijdens de rotatie door deze stroom meegesleurd. Tijdens horizontale rotatie werkt de zwaartekrachtvector op de cellen en brengt ze in een oscillerende baan, zoals gevisualiseerd in figuur 1. Een andere kleine bron van schuifspanning wordt veroorzaakt doordat de cellen door de media “vallen”, waardoor laminaire stroming rond de cellen ontstaat. Terwijl het kweekvat om een horizontale as draait, roteert ook de zwaartekrachtvector die de cellen ervaren. Na verloop van tijd nadert deze roterende zwaartekrachtvector gemiddeld nul; dit fenomeen wordt tijdgemiddelde zwaartekrachtvector-nullificatie genoemd en induceert een toestand van SMG 5,6,8,9. Dit apparaat is gebruikt om de effecten van SMG op vele soorten cellen te bestuderen, waarvan sommige worden behandeld in referenties^10,11,12. Meer voorbeelden zijn te vinden op de website van de fabrikant van het apparaat.

Dit RWV-apparaat maakt gebruik van gespecialiseerde “high aspect ratio vessels” (HARV’s) die beschikbaar zijn via de fabrikant van het apparaat. Deze HARV’s bevatten elk 10 ml celkweek; er zijn echter ook 50 ml HARV’s beschikbaar. 10 ml of 50 ml HARV’s kunnen worden gebruikt, afhankelijk van het aantal cellen dat nodig is om eventuele downstream experimentele assays te voltooien, wat verder wordt beschreven in de discussiesectie. De HARV’s zijn gemaakt van polycarbonaat en bevatten een siliconen oxygenatiemembraan om gasuitwisseling tijdens celkweek mogelijk te maken. Dit handhaaft de pH van de celmedia en zorgt voor een efficiënte cellulaire ademhaling. Er is een hoofdvulpoort en twee afgedekte spuitpoorten aan de voorkant van het vat (figuur 2A). Na het laden van de celcultuur door de hoofdvulpoort, worden twee spuiten op het vat geladen om te helpen bij het verwijderen van de luchtbel. Bij gebruik van de vaten van 10 ml werken twee spuiten van 3 ml goed. Eén spuit is leeg aan het apparaat bevestigd, met de spuit volledig ingedrukt, en de andere is gevuld met 3 ml celkweek (figuur 2E). Deze worden in combinatie gebruikt om bubbels uit het vat te verwijderen, wat belangrijk is voor het behoud van de SMG-behandeling. Over het algemeen wordt geadviseerd om twee negatieve controles in te stellen, die kunnen worden aangeduid als de “Flask” -controle en de “1G” -controle. De “Kolf”-regeling komt overeen met cellen die worden gekweekt in een standaard T25-suspensiecelkweekkolf. De 1G-controle komt overeen met cellen die worden gekweekt in het gespecialiseerde kweekvat van 10 ml, dat eenvoudig in de couveuse wordt geplaatst (d.w.z. zonder te worden onderworpen aan de SMG-behandeling). Zie het gedeelte Discussie voor meer informatie over besturingselementen.

De hier beschreven methode is geschikt voor elke onderzoeker die de effecten van SMG op lymfocyten wil bestuderen, met een specifieke focus op NK-cellen met behulp van de NK92-cellijn¹³. De resultaten van deze studies kunnen ons helpen de nadelige effecten van ruimtevaart op het menselijk immuunsysteem beter te begrijpen en te verzachten.