زراعة الخلايا الليمفاوية في محاكاة الجاذبية الصغرى باستخدام نظام زراعة الخلايا الدوارة

لقد ثبت أن رحلات الفضاء تؤثر على العديد من جوانب علم وظائف الأعضاء البشرية ، بما في ذلك جهاز المناعة. أظهرت العديد من الدراسات أدلة على عدم التنظيم المناعي نتيجة لرحلات الفضاء في الجسم الحي والتعرض لمحاكاة الجاذبية الصغرى (SMG) في المختبر¹،²،^3،4. ومن الجوانب الرئيسية للبيئة الفضائية التي تؤثر على فسيولوجيا الإنسان الجاذبية الصغرى. تشير الجاذبية الصغرى إلى “انعدام الوزن” الذي يحدث بسبب قوى الجاذبية المنخفضة في بيئة الفضاء⁵. بينما تستعد البشرية لبعثات فضائية أطول إلى القمر والمريخ ، يجب إجراء المزيد من الأبحاث للتخفيف من المخاطر الصحية الخطيرة على رواد الفضاء.

ويمكن تحقيق ظروف الجاذبية الصغرى الحقيقية للبحث العلمي في الفضاء على متن محطة الفضاء الدولية (ISS) أو في السواتل النانوية التي تطلق في المدار؛ ومع ذلك ، يمكن أن تكون هذه الخيارات مكلفة للغاية ومعقدة للتنسيق. بالنظر إلى القيود الحالية لإجراء البحوث البيولوجية في الفضاء ، توجد عدة خيارات لإحداث جاذبية صغيرة حقيقية و SMG على الأرض. توجد عمليات واسعة النطاق يمكن أن تنتج فترات قصيرة من الجاذبية الصغرى الحقيقية على الأرض ، بما في ذلك أبراج الإسقاط ، والطيران المكافئ ، وصواريخ السبر. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق ليست مناسبة بشكل مفرط لدراسة آثار الجاذبية الصغرى على النظم البيولوجية ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى فترات قصيرة من معالجة الجاذبية الصغرى (أي ثوان إلى 20 دقيقة). تتم مناقشة هذه الأساليب بمزيد من التفصيل في مكان آخر ^5,6. تشمل الخيارات المناسبة لزراعة الخلايا البيولوجية الأجهزة الصغيرة الحجم مثل 2D clinostats أو أجهزة وعاء الجدار الدوار (RWV) و clinostats 3D أو آلات تحديد المواقع العشوائية (RPM). يمكن إعداد هذه الأجهزة داخل حاضنات زراعة الخلايا التي يتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ ، وتقوم بتدوير ثقافة الخلية إما على محور أفقي (2D) أو على محورين عموديين (3D) ⁵. ومع ذلك ، من المهم التأكيد على أن طرق الاستزراع هذه تنتج رشاشات صغيرة بدلا من الجاذبية الصغرى الحقيقية ، والتي يتم تحقيقها بشكل عملي في الفضاء لسياقات البحث البيولوجي.

الهدف من الورقة الحالية هو تحديد خطوات إخضاع الخلايا الليمفاوية ل SMG باستخدام جهاز RWV المتاح تجاريا (جدول المواد) ، والذي يندرج تحت تصنيف clinostat 2D. على الرغم من وجود بروتوكول عام متاح من الشركة المصنعة لتشغيل هذا الجهاز ، تهدف المقالة الحالية إلى تغطية خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها والتحسين بمزيد من التفصيل. تغطي هذه المقالة أيضا النظرية الكامنة وراء كيفية عمل هذا الجهاز لإنتاج SMG في ثقافة الخلايا المعلقة ، وتحديدا مع الخلايا الليمفاوية. في هذا السياق ، تشير زراعة الخلايا المعلقة إلى الخلايا التي تنمو بحرية في وسائط الاستزراع التكميلية ، دون الالتزام بأي سقالات إضافية. تزرع العديد من أنواع الخلايا في زراعة الخلايا المعلقة ، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية. الخلايا الليمفاوية هي خلايا الجهاز المناعي ، بما في ذلك الخلايا التائية والبائية والقاتلة الطبيعية (NK) ، الموجودة في الأعضاء اللمفاوية ومجرى الدم⁷.

يعمل كلينستات RWV 2D الموصوف هنا على مبدأ إبطال متجه الجاذبية متوسط الوقت⁵،⁶،⁸،^{9 ،} حيث يتم اختيار متجه الجاذبية بشكل عشوائي من خلال دوران ثقافة الخلية على محور أفقي. يتم تحقيق ذلك من خلال مطابقة سرعة دوران وعاء الاستزراع مع سرعة ترسيب الخلايا. وطالما أن سرعة دوران وعاء الاستزراع تتطابق بشكل جيد مع سرعة ترسيب الخلايا، فإن الخلايا تظل في حالة سقوط حر وغير قادرة على الترسب، كما حدث في بيئة الفضاء. بعد مرحلة التسريع الأولية ، تصل الوسائط في وعاء الاستزراع في النهاية إلى “دوران الجسم الصلب” بمرور الوقت. يحفز هذا الدوران الأفقي أيضا التدفق الصفحي في وعاء زراعة الخلايا. هذا يخلق بيئة “قص منخفضة” ، بالنظر إلى أن إجهاد القص الناجم عن الخلايا عن طريق التدفق الصفحي أقل بكثير من التدفق المضطرب. ومع ذلك ، بالنظر إلى أن clinostat ليس نظاما مثاليا ، فهناك بعض حركات السوائل الصفائحية الصغيرة التي يتم إدخالها ، والتي تسبب الحد الأدنى من إجهاد القص على الخلايا. على هذا النحو ، يتم سحب الخلايا المعلقة في الوسائط بواسطة هذا التدفق أثناء الدوران. أثناء الدوران الأفقي، يؤثر متجه الجاذبية على الخلايا ويضعها في مسار متذبذب، كما هو موضح في الشكل 1. مصدر صغير آخر لإجهاد القص ناتج عن “سقوط” الخلايا عبر الوسائط ، مما يتسبب في تدفق رقائقي حول الخلايا. عندما يدور وعاء الاستزراع على محور أفقي ، يدور ناقل الجاذبية الذي تتعرض له الخلايا أيضا. بمرور الوقت ، يقترب متوسط ناقل الجاذبية الدوار هذا من الصفر. تسمى هذه الظاهرة إبطال ناقل الجاذبية المتوسط الزمني وتؤدي إلى حالة SMG⁵،^6،8،9. تم استخدام هذا الجهاز لدراسة آثار SMG على العديد من أنواع الخلايا ، والتي يتم تغطية بعضها في المراجع¹⁰،^11،12. يمكن العثور على المزيد من الأمثلة على موقع الشركة المصنعة للجهاز.

يستخدم جهاز RWV هذا “أوعية ذات نسبة عرض إلى ارتفاع عالية” (HARVs) متخصصة متوفرة من خلال الشركة المصنعة للجهاز. تحتوي هذه HARVs على 10 مل من زراعة الخلايا لكل منها. ومع ذلك ، تتوفر أيضا 50 مل من HARVs. يمكن استخدام 10 مل أو 50 مل HARVs اعتمادا على عدد الخلايا اللازمة لإكمال أي فحوصات تجريبية نهائية ، والتي تم توضيحها بمزيد من التفصيل في قسم المناقشة. تصنع HARVs من البولي كربونات وتشمل غشاء أكسجة السيليكون للسماح بتبادل الغازات أثناء زراعة الخلايا. وهذا يحافظ على الأس الهيدروجيني للوسائط الخلوية ويسمح بالتنفس الخلوي بكفاءة. يوجد منفذ تعبئة رئيسي ومنفذي حقنة مغطاة على وجه الوعاء (الشكل 2 أ). بعد تحميل مزرعة الخلية من خلال منفذ التعبئة الرئيسي ، يتم تحميل حقنتين على الوعاء للمساعدة في إزالة الفقاعة. عند استخدام الأوعية سعة 10 مل ، تعمل حقنتان سعة 3 مل بشكل جيد. يتم توصيل حقنة واحدة بالجهاز فارغة ، مع الضغط التام على المحقنة ، والأخرى متصلة مملوءة ب 3 مل من زراعة الخلايا (الشكل 2E). يتم استخدامها معا لإزالة الفقاعات من الوعاء ، وهو أمر مهم للحفاظ على علاج SMG. بشكل عام ، ينصح بإعداد عنصري تحكم سلبيين ، يمكن الإشارة إليهما باسم عنصر التحكم “Flask” وعنصر التحكم “1G”. يتوافق عنصر التحكم “القارورة” مع الخلايا التي تزرع في قارورة ثقافة الخلايا المعلقة T25 القياسية. يتوافق عنصر التحكم 1G مع الخلايا التي تزرع في وعاء الاستزراع المتخصص سعة 10 مل ، والذي يتم وضعه ببساطة في الحاضنة (أي دون التعرض لعلاج SMG). يرجى الاطلاع على قسم المناقشة للحصول على مزيد من التفاصيل حول عناصر التحكم.

الطريقة الموصوفة هنا مناسبة لأي باحث يتطلع إلى دراسة آثار SMG على الخلايا الليمفاوية ، مع التركيز بشكل خاص على الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام خط الخلية NK92¹³. قد تساعدنا نتائج هذه الدراسات على فهم أفضل وتخفيف الآثار الضارة لرحلات الفضاء على جهاز المناعة البشري.