Beurteilung der Schwimmausdauer und des Schwimmverhaltens bei erwachsenen Zebrafischen
Summary
Der erwachsene Zebrafisch ist in der Lage, sich nach einer Rückenmarksverletzung funktionell zu erholen und ist ein erstklassiges Modellsystem zur Aufklärung der angeborenen Mechanismen der neuronalen Regeneration. Hier beschreiben wir Schwimmausdauer- und Schwimmverhaltensassays als funktionelle Auslesungen der Rückenmarksregeneration.
Abstract
Aufgrund ihrer bekannten Regenerationsfähigkeit sind erwachsene Zebrafische ein erstklassiges Wirbeltiermodell, um Mechanismen der angeborenen Rückenmarksregeneration zu untersuchen. Nach vollständiger Durchtrennung ihres Rückenmarks verlängern Zebrafische Glia- und axonale Brücken über durchtrenntes Gewebe, regenerieren Neuronen proximal zur Läsion und erlangen ihre Schwimmfähigkeiten innerhalb von 8 Wochen nach der Verletzung wieder. Die Wiederherstellung der Schwimmfunktion ist somit eine zentrale Anzeige für die funktionelle Rückenmarksreparatur. Hier beschreiben wir eine Reihe von Verhaltensassays zur Quantifizierung der motorischen Kapazität von Zebrafischen in einem geschlossenen Schwimmtunnel. Ziel dieser Methoden ist es, quantifizierbare Messungen der Schwimmausdauer und des Schwimmverhaltens bei erwachsenen Zebrafischen zu liefern. Für die Schwimmausdauer sind Zebrafische bis zur Erschöpfung einer ständig steigenden Wasserströmungsgeschwindigkeit ausgesetzt, und es wird Zeit bei Erschöpfung gemeldet. Für die Beurteilung des Schwimmverhaltens werden Zebrafische niedrigen Strömungsgeschwindigkeiten ausgesetzt und Schwimmvideos werden mit einer dorsalen Ansicht des Fisches aufgenommen. Prozentuale Aktivität, Burst-Frequenz und Zeit, die gegen die Wasserströmung aufgewendet wird, liefern quantifizierbare Anzeigen des Schwimmverhaltens. Wir quantifizierten die Schwimmausdauer und das Schwimmverhalten bei Wildtyp-Zebrafischen vor Verletzungen und nach der Querschnitt des Rückenmarks. Wir fanden heraus, dass Zebrafische nach der Rückenmarkstransektion die Schwimmfunktion verlieren und diese Kapazität zwischen 2 und 6 Wochen nach der Verletzung allmählich wiedererlangen. Die in dieser Studie beschriebenen Methoden könnten auf neurobehaviorale, Muskel-Skelett-, Skelettmuskelregenerations- und neuronale Regenerationsstudien bei erwachsenen Zebrafischen angewendet werden.
Introduction
Erwachsene Zebrafische werden in hervorragender Weise verwendet, um Mechanismen der neuromuskulären und muskuloskelettalen Entwicklung und Krankheitsmodellierung zu untersuchen1,2,3. Zebrafische sind in der Lage, mehrere Gewebe effizient und spontan zu reparieren, einschließlich Gehirn, Rückenmark und Skelettmuskulatur4,5,6,7. Die bemerkenswerte Fähigkeit, neuromuskuläres Gewebe zu regenerieren und Krankheiten zu modellieren, zieht eine wachsende wissenschaftliche Gemeinschaft in die Forschung an erwachsenen Zebrafischen1,2,3. Während jedoch Assays der Fortbewegung und des Schwimmverhaltens für Larvenzebrafische verfügbar und standardisiert sind, besteht ein wachsender Bedarf, analoge Protokolle bei erwachsenen Fischen zu entwickeln8,9,10,11. Das Ziel dieser Studie ist es, Protokolle zur Quantifizierung der Schwimmausdauer und des Schwimmverhaltens bei erwachsenen Zebrafischen zu beschreiben. Wir stellen diese Protokolle im Rahmen der Rückenmarksregenerationsforschung vor. Die hier beschriebenen Verhaltensprotokolle sind jedoch gleichermaßen auf Studien zur neuronalen und Muskelregeneration, zur neuromuskulären und muskuloskelettalen Entwicklung sowie zur Modellierung neuromuskulärer und muskuloskelettaler Erkrankungen anwendbar.
Zebrafisch-Spiegelung kehrt die Lähmung innerhalb von 8 Wochen nach vollständiger Rückenmarkstransektion um. Im Gegensatz zu schlecht regenerativen Säugetieren zeigen Zebrafische pro-regenerative Immun-, neuronale und gliale Verletzungsreaktionen, die für eine funktionelle Rückenmarksreparatur erforderlich sind12,13,14. Eine ultimative Anzeige der funktionellen Rückenmarksreparatur ist die Fähigkeit des läsionierten Gewebes, seine Funktion nach einer Verletzung wiederzuerlangen. Eine Reihe standardisierter Methoden zur Beurteilung der funktionellen Regeneration bei Nagetieren umfasst lokomotorische, motorische, sensorische und sensomotorische Tests15,16,17. Zu den weit verbreiteten Tests bei Rückenmarksverletzungen bei Maus-Rückenmarksverletzungen gehören die lokomotorische Basso Mouse Scale (BMS), motorische Tests der Vordergliedmaßen, taktile sensorische Tests und Grid Walking Sensomotoriktests15,17. Im Gegensatz zu Säugetier- oder Larven-Zebrafischsystemen sind Verhaltenstests bei erwachsenen Zebrafischen weniger entwickelt, aber dringend erforderlich, um den wachsenden Bedürfnissen der Geweberegenerations- und Krankheitsmodellierungsgemeinschaften gerecht zu werden.
Vollständige Rückenmarkstransektionen führen zu einer vollständigen Lähmung der Verletzungsstelle. Kurz nach der Verletzung sind gelähmte Tiere weniger aktiv und vermeiden das Schwimmen so weit wie möglich. Um die verlorene Schwimmkapazität auszugleichen, zeigen gelähmte Tiere kurze, häufige Ausbrüche, indem sie ihre Brustflossen, die rostral zur Läsion liegen, überbeanspruchen. Diese kompensatorische Schwimmstrategie führt zu schneller Erschöpfung und geringerer Schwimmkapazität. Wenn sich das Rückenmark des Zebrafischs regeneriert, erhalten die Tiere eine glatte oszillierende Schwimmfunktion zurück, die mit der Läsion konudal ist, was eine erhöhte Schwimmausdauer und verbesserte Schwimmverhaltensparameter ermöglicht. Hier beschreiben wir Methoden zur Quantifizierung der Schwimmausdauer von Zebrafischen bei steigenden Wasserströmungsgeschwindigkeiten und des Schwimmverhaltens bei niedrigen Strömungsgeschwindigkeiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Erwachsene Zebrafische sind ein beliebtes Wirbeltiersystem zur Modellierung menschlicher Krankheiten und zur Untersuchung von Mechanismen der Geweberegeneration. CRISPR/Cas9 Genome Editing hat umgekehrte genetische Studien zur Modellierung von Krankheiten bei Zebrafischen revolutioniert; Die großflächige Genetik bei erwachsenen Zebrafischen wurde jedoch durch biologische und technische Herausforderungen behindert, einschließlich der Nichtverfügbarkeit von erwachsenem Zebrafischgewebe für die Phänotypisierung mit ho…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der Washington University Zebrafish Shared Resource für die Tierpflege. Diese Forschung wurde vom NIH unterstützt (R01 NS113915 bis M.H.M.).
Materials
| AutoSwim software | Loligo Systems | MI10000 | Optional – for Automatic control of current velocity |
| Customized lid | Loligo Systems | MI10001 | This customized lid is used for swim endurance |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Optional – for Automatic control of current velocity |
| Eheim pump | Loligo Systems | PU10160 | 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank. |
| Fiji | Fiji | Freely available through Image J (Fiji) | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Handheld digital flow meter – for calibration |
| High Speed Camera | Loligo Systems | VE10380 | USB 3.0 color video camera (4MP) |
| IR light panel | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel chamber |
| Monofocal lens | Loligo Systems | VE10388 | 25mm manual lens |
| PVC Tubing | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Wall thickness: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Freely available. Version 3.6 with extra packages. | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Swim tunnel respirometer | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration |
| uEye Cockpit | IDS | Freely available software to control camera parameters | Alternative cameras and accompanying softwares could be used |
| Vane wheel flow probe | Loligo Systems | AC10002 | Digital flow probe – for calibration |
References
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