Beoordeling van zwemuithoudingsvermogen en zwemgedrag bij volwassen zebravissen
Summary
Volwassen zebravis is in staat tot functioneel herstel na een dwarslaesie en is een vooraanstaand modelsysteem om aangeboren mechanismen van neurale regeneratie op te helderen. Hier beschrijven we zwemuithoudingsvermogen en zwemgedragstests als functionele uitlezingen van regeneratie van het ruggenmerg.
Abstract
Vanwege hun beroemde regeneratieve vermogen zijn volwassen zebravissen een vooraanstaand gewerveld model om mechanismen van aangeboren regeneratie van het ruggenmerg te ondervragen. Na volledige transsectie van hun ruggenmerg breiden zebravissen gliale en axonale bruggen uit over afgehakt weefsel, regenereren neuronen proximaal aan de laesie en herwinnen hun zwemcapaciteiten binnen 8 weken na verwonding. Herstel van de zwemfunctie is dus een centrale uitlezing voor functioneel ruggenmergherstel. Hier beschrijven we een reeks gedragstests om de motorcapaciteit van zebravissen in een afgesloten zwemtunnel te kwantificeren. Het doel van deze methoden is om kwantificeerbare metingen te leveren van zwemuithoudingsvermogen en zwemgedrag bij volwassen zebravissen. Voor zwemuithoudingsvermogen worden zebravissen onderworpen aan een constant toenemende waterstroomsnelheid tot uitputting en tijd bij uitputting wordt gemeld. Voor de beoordeling van het zwemgedrag worden zebravissen onderworpen aan lage stroomsnelheden en worden zwemvideo’s vastgelegd met een dorsaal zicht op de vis. Procentuele activiteit, barstfrequentie en tijd doorgebracht tegen de waterstroom bieden kwantificeerbare uitlezingen van zwemgedrag. We kwantificeerden zwemuithoudingsvermogen en zwemgedrag bij wild-type zebravissen vóór letsel en na ruggenmergtranssectie. We ontdekten dat zebravissen de zwemfunctie verliezen na dwarslaesie en geleidelijk die capaciteit terugkrijgen tussen 2 en 6 weken na het letsel. De methoden die in deze studie worden beschreven, kunnen worden toegepast op neurobehaviorale, musculoskeletale, skeletspierregeneratie en neurale regeneratiestudies bij volwassen zebravissen.
Introduction
Volwassen zebravissen worden bij uitstek gebruikt om mechanismen van neuromusculaire en musculoskeletale ontwikkeling en ziektemodellering te onderzoeken1,2,3. Zebravissen zijn in staat tot efficiënt, spontaan herstel van meerdere weefsels, waaronder de hersenen, het ruggenmerg en de skeletspieren4,5,6,7. Het opmerkelijke vermogen om neuromusculaire weefsels en modelziekten te regenereren, trekt een groeiende wetenschappelijke gemeenschap aan voor onderzoek naar volwassen zebravissen1,2,3. Hoewel testen van voortbeweging en zwemgedrag beschikbaar en gestandaardiseerd zijn voor larvale zebravissen, is er een groeiende behoefte om analoge protocollen te ontwikkelen bij volwassen vissen8,9,10,11. Het doel van deze studie is om protocollen te beschrijven om zwemuithoudingsvermogen en zwemgedrag bij volwassen zebravissen te kwantificeren. We presenteren deze protocollen in het kader van ruggenmergregeneratieonderzoek. De gedragsprotocollen die hier worden beschreven, zijn echter evenzeer van toepassing op studies naar neurale en spierregeneratie, neuromusculaire en musculoskeletale ontwikkeling, evenals neuromusculaire en musculoskeletale ziektemodellering.
Zebravis omgekeerde verlamming binnen 8 weken na volledige ruggenmergtranssectie. In tegenstelling tot slecht regeneratieve zoogdieren vertonen zebravissen pro-regeneratieve immuun-, neuronale en gliale letselresponsen die nodig zijn voor functioneel ruggenmergherstel12,13,14. Een ultieme uitlezing van functioneel ruggenmergherstel is het vermogen van het laesieweefsel om zijn functie na een verwonding terug te krijgen. Een reeks gestandaardiseerde methoden om functionele regeneratie bij knaagdieren te beoordelen, omvat locomotorische, motorische, sensorische en sensomotorische tests15,16,17. Veel gebruikte tests bij dwarslaesie bij muizen omvatten de locomotorische Basso Mouse Scale (BMS), motorische tests voor de voorpoot, tactiele sensorische tests en sensomotorische tests voor het lopen van rasters15,17. In tegenstelling tot zoogdier- of larvale zebravissystemen zijn gedragstests bij volwassen zebravissen minder ontwikkeld, maar toch hard nodig om tegemoet te komen aan de groeiende behoeften van de weefselregeneratie en ziektemodelleringsgemeenschappen.
Volledige dwarslaesietranssecties resulteren in volledige verlamming caudaal naar de plaats van het letsel. Kort na het letsel zijn verlamde dieren minder actief en vermijden ze zoveel mogelijk zwemmen. Om de verloren zwemcapaciteit te compenseren, vertonen verlamde dieren korte, frequente uitbarstingen door hun borstvinnen te veel te gebruiken, die rostrale aan de laesie liggen. Deze compenserende zwemstrategie resulteert in snelle uitputting en een lagere zwemcapaciteit. Naarmate het ruggenmerg van de zebravis regenereert, krijgen dieren een soepele oscillerende zwemfunctie terug die dicht bij de laesie ligt, waardoor een verhoogd zwemuithoudingsvermogen en verbeterde zwemgedragsparameters mogelijk zijn. Hier beschrijven we methoden om het uithoudingsvermogen van zebravissen te kwantificeren bij toenemende waterstroomsnelheden en zwemgedrag bij lage stroomsnelheden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Volwassen zebravissen zijn een populair gewerveld systeem voor het modelleren van menselijke ziekten en het bestuderen van mechanismen van weefselregeneratie. CRISPR/Cas9-genoombewerking heeft een revolutie teweeggebracht in omgekeerde genetische studies voor het modelleren van ziekten bij zebravissen; grootschalige genetica in volwassen zebravissen is echter gehinderd door biologische en technische uitdagingen, waaronder de onbeschikbaarheid van volwassen zebravisweefsels tot fenotypering met hoge doorvoer. Gezien de co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken de Washington University Zebrafish Shared Resource voor de verzorging van dieren. Dit onderzoek werd ondersteund door de NIH (R01 NS113915 tot M.H.M.).
Materials
| AutoSwim software | Loligo Systems | MI10000 | Optional – for Automatic control of current velocity |
| Customized lid | Loligo Systems | MI10001 | This customized lid is used for swim endurance |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Optional – for Automatic control of current velocity |
| Eheim pump | Loligo Systems | PU10160 | 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank. |
| Fiji | Fiji | Freely available through Image J (Fiji) | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Handheld digital flow meter – for calibration |
| High Speed Camera | Loligo Systems | VE10380 | USB 3.0 color video camera (4MP) |
| IR light panel | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel chamber |
| Monofocal lens | Loligo Systems | VE10388 | 25mm manual lens |
| PVC Tubing | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Wall thickness: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Freely available. Version 3.6 with extra packages. | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Swim tunnel respirometer | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration |
| uEye Cockpit | IDS | Freely available software to control camera parameters | Alternative cameras and accompanying softwares could be used |
| Vane wheel flow probe | Loligo Systems | AC10002 | Digital flow probe – for calibration |
References
- Becker, C. G., Becker, T. Neuronal regeneration from ependymo-radial glial cells: cook, little pot, cook. Developmental Cell. 32 (4), 516-527 (2015).
- Mokalled, M. H., Poss, K. D. A regeneration toolkit. Developmental Cell. 47 (3), 267-280 (2018).
- Orger, M. B., de Polavieja, G. G. Zebrafish behavior: opportunities and challenges. Annual Review of Neuroscience. 40, 125-147 (2017).
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmental Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Wolman, M. A., et al. A genome-wide screen identifies PAPP-AA-mediated IGFR signaling as a novel regulator of habituation learning. Neuron. 85 (6), 1200-1211 (2015).
- Granato, M., et al. Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva. Development. 123, 399-413 (1996).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (23), 10545-10549 (1995).
- Moens, C. B., Yan, Y. L., Appel, B., Force, A. G., Kimmel, C. B. Valentino: a zebrafish gene required for normal hindbrain segmentation. Development. 122 (12), 3981-3990 (1996).
- Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
- Reimer, M. M., et al. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).
- Klatt Shaw, D., et al. Localized EMT reprograms glial progenitors to promote spinal cord repair. Developmental Cell. 56 (5), 613-626 (2021).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), 01324 (2019).
- Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Fatemi, G., Faden, A. I. A combined scoring method to assess behavioral recovery after mouse spinal cord injury. Neuroscience Research. 67 (2), 117-125 (2010).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Scheff, S. W., Saucier, D. A., Cain, M. E. A statistical method for analyzing rating scale data: the BBB locomotor score. Journal of Neurotrauma. 19 (10), 1251-1260 (2002).
- Li, Q., et al. Differential behavioral responses of zebrafish larvae to yohimbine treatment. Psychopharmacology (Berl). 232 (1), 197-208 (2015).
- Wakamatsu, Y., Ogino, K., Hirata, H. Swimming capability of zebrafish is governed by water temperature, caudal fin length and genetic background. Scientific Reports. 9 (1), 16307 (2019).
- Ahmed, O., Seguin, D., Gerlai, R. An automated predator avoidance task in zebrafish. Behavioral Brain Research. 216 (1), 166-171 (2011).
- Conradsen, C., McGuigan, K. Sexually dimorphic morphology and swimming performance relationships in wild-type zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology. 87 (5), 1219-1233 (2015).
- Leris, I., Sfakianakis, D. G., Kentouri, M. Are zebrafish Danio rerio males better swimmers than females. Journal of Fish Biology. 83 (5), 1381-1386 (2013).
