ACT1-CUP1 Testleri, Tomurcuklanan Mayadaki Splisozomal Mutantların Substrata Özgü Hassasiyetlerini Belirler
Summary
Bir bakır büyüme testi olan ACT1-CUP1 testi, öncü mesajcı RNA (pre-mRNA) eklemesinin ve mutant ekleme faktörlerinin spleozomal fonksiyon üzerindeki etkisinin hızlı bir şekilde okunmasını sağlar. Bu çalışma bir protokol sağlar ve ilgilenilen ekleme sorusunu ele almak için mümkün olan özelleştirmeyi vurgular.
Abstract
Splisozomda veya substratında ortaya çıkan mutasyonlar, splisozomal fonksiyonun inceliklerini anlamamıza önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Hastalıkla ilişkili veya fonksiyonel olarak seçilmiş olsun, bu mutasyonların çoğu, model organizma Saccharomyces cerevisiae’de (maya) büyüme tahlilleri kullanılarak incelenmiştir. Eklemeye özgü bakır büyüme testi veya ACT1-CUP1 testi, fenotipik düzeyde mutasyonun kapsamlı bir analizini sağlar. ACT1-CUP1 testi, doğru şekilde eklendiğinde bakır toleransı sağlayan muhabirleri kullanır. Bu nedenle, bakır varlığında, maya canlılığındaki değişiklikler, ekleme yoluyla mRNA üretimindeki değişikliklerle ilişkilidir. Tipik bir deneyde, maya ekleme uzmanına, farklı konsensüs dışı ekleme muhabirleri ve ekleme üzerindeki herhangi bir sinerjik veya antitetik etkiyi tespit etmek için ilgi çekici ekleme faktörü mutasyonu ile meydan okunur. Burada bakır levha hazırlama, maya hücrelerinin kaplanması ve veri değerlendirmesinin tam bir açıklaması verilmiştir. ACT1-CUP1 muhabirlerinin çok yönlülüğünü vurgulayan bir dizi ücretsiz deney anlatılmıştır. ACT1-CUP1 testi, mutasyonel etkilerin doğrudan okunması ve sahada devam eden kullanımdan elde edilen karşılaştırmalı olasılıklar sayesinde ekleme araç kutusunda kullanışlı bir araçtır.
Introduction
Splisozom, öncü mesajcı RNA’da (pre-mRNA) intronların, kodlamayan bölgelerin uzaklaştırılmasını katalize eden büyük, biyolojik bir makinedir1,2. Yaklaşık 100 proteinin 1’inde ve 5 kodlamayan RNA’da tek bir nokta mutantının etkisini karakterize etmek, protein veya RNA’yı izole ederken genellikle belirsizdir. Mutasyona uğramış bileşenin işlevindeki değişiklik, tam, işleyen spliceozom bağlamında in vivo olarak en iyi şekilde değerlendirilebilir.
Burada açıklanan bakır büyüme testi, Saccharomyces cerevisiae veya tomurcuklanan mayadaki ekleme verimliliğinin hızlı bir göstergesidir. C.F. Lesser ve C. Guthrie tarafından geliştirilen ve 1993 yılında yayınlanan bu tahlil, basit bir model organizma ile çalışma kolaylığını ve hücre canlılığının doğrudan okunmasınıbirleştirir 3. Canlılık, bu hücrelerdeki splisozomların muhabir transkriptini ne kadar iyi tanıyabileceği ve ekleyebileceği ile ilişkilidir.
Bu bakır büyüme testine daha yaygın olarak ACT1-CUP1 testi denir. ACT1-CUP1 adı, ekleme verimliliğinin bir raporlayıcısını oluşturmak için kaynaşmış iki genden kaynaklanmaktadır. ACT1, mayanın aktin genidir, bu da yüksek oranda eksprese edilir ve verimli bir şekilde eklenmiş bir intron 4,5’e sahiptir. Cup1p, düzenli hücresel fonksiyonlara müdahale edilmesini önlemek için hücredeki bakırı tutan bir bakır şelatördür 6,7,8. ACT1-CUP1 muhabiri bu genleri sırayla içerir, öyle ki CUP1 sadece ACT1’in intronunun mRNA öncesi eklenmesi durumunda uygun okuma çerçevesinde olur (Şekil 1). Elde edilen füzyon proteini, aktinin ilk 21 amino asidini ve bakır bakımından zengin bir ortamda maya canlılığını artıran tam uzunlukta Cup1p proteinini içerir3. Bu nedenle, muhabirin ekleme miktarındaki bir artış, daha yüksek bir Cup1p konsantrasyonu ve daha yüksek bir bakır direnci ile sonuçlanır (Şekil 1). Diğer muhabir genlerle karşılaştırıldığında, CUP1 düşük seviyelerde bile hücre canlılığını etkiler, geniş bir duyarlılık aralığına sahiptir ve 3,6,7 mutasyonlarını eklemek için doğrudan seçmek için kullanılabilir. Ek olarak, CUP1 standart maya büyümesi için gerekli değildir ve bu nedenle hücresel homeostaz bu tahlilin kurulumu sırasında etkilenmez. Delesyon veya sıcaklık büyüme testlerini tamamlayan ACT1-CUP1, aksi takdirde optimal maya büyüme koşulları altında ekleme üzerindeki etkileri hakkında bilgi sağlar.
Eklem, substratını üç intronic dizi aracılığıyla tanır: 5′ ekleme bölgesi (5′ SS), dal-site (BS) ve 3′ ekleme bölgesi (3′ SS). Bu sitelerde fikir birliği olmayan diziler içeren çok sayıda ACT1-CUP1 muhabiri oluşturulmuştur. En yaygın ACT1-CUP1 muhabirlerinin bir seçkisi Şekil 1 ve Tablo 1’de gösterilmiştir. Ekleme döngüsünün farklı noktalarında her bir ekleme bölgesi ile benzersiz bir şekilde etkileşime girdiğinden, spliceosome’un sağlamlığı, konsensüs dışı raporlayıcının kullanıldığı farklı adımlarda test edilebilir. Konsensüs dışı muhabirler, intron içindeki mutasyona uğramış pozisyon ve mutasyona uğradığı taban için adlandırılır. Örneğin, A3c, 5′ SS’de bir mutasyona sahip bir muhabirdir, özellikle konsensüs adenozinden bir sitozine kadar 3. konumdadır. Bu muhabir, 5′ SS seçimini ve kullanımını etkileyen splisozom mutasyonları ile güçlü bir şekilde etkileşime girecektir. İlk çalışmalarında, Lesser ve Guthrie, hangi 5′ SS mutasyonlarının ekleme3’ü inhibe ettiğini belirledi. Aynı yılın ilerleyen zamanlarında, her üç ekleme bölgesinde de fikir birliği olmayan muhabirler, Burgess ve Guthrie tarafından ATPase Prp16p9’daki mutasyonların baskılayıcı bir ekranında yayınlandı. Konsensüsü fikir birliği olmayan muhabirlerle karşılaştıran ACT1-CUP1 testi, maya ekleyicisinin sağlamlığını ve seçiciliğini anlamak ve diğer ökaryotların ek parçalarının işlevini çıkarmak için önemli bir anahtar olmuştur.
Konsensüs dışı ACT1-CUP1 muhabirleri splisozomu daha fazla bozulmaya duyarlı hale getirdikçe, tek bir ekleme faktörü mutasyonunun etkisi, olumlu veya olumsuz etkilediği muhabirler aracılığıyla karakterize edilebilir. Bu, araştırma sorularını çeşitli şekillerde eklemeye uygulanmıştır. İlk olarak, ACT1-CUP1 testi, ekleme faktörlerindeki mutasyonlar için genetik bir tarama olarak kullanılabilir ve kullanılmıştır. Örneğin, en büyük ekleme proteini olan Prp8p, splisozomun RNA çekirdeğinin ekleme reaksiyonunu katalize ettiği bir platform görevi görür. Bu, kısmen, Prp8p mutantlarının farklı ACT1-CUP1 muhabirlerinin 10,11,12,13,14,15,16,17 eklenmesini nasıl geliştirdiği veya azalttığı ile çıkarıldı. Eklemlemenin diğer protein bileşenleri de Hsh155p, Cwc2p, Cef1p ve Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25 dahil olmak üzere ACT1-CUP1 kullanılarak araştırılmıştır. Prp16p ve spliceosomal geçişte yer alan diğer dört ATPazın enerjik eşikleri de bu tahlil 9,26,27,28,29,30 ile incelenmiştir. Küçük nükleer RNA’lar (snRNA’lar), koordine ettikleri pre-mRNA dizilerini ve snRNA’ların 3,31,32,33,34,35,36,37 ekleme sırasında maruz kaldıkları ikincil yapıdaki değişiklikleri tanımlamak için ACT1-CUP1 kullanılarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir.
ACT1-CUP1 testi, CUP1 geninin tüm kopyalarının nakavt edildiği bir maya suşu gerektirir. CUP1, 6,38 kopya numarasına sahip olabileceğinden, tam bir nakavt suşunun hazırlanması birden fazla tur veya kapsamlı tarama gerektirebilir. Sonuç olarak, cup1Δ maya suşları, muhabirler gibi laboratuvarlar arasında sıklıkla paylaşılmıştır.
Bir ekleme faktöründeki mutasyon (lar) bir plazmid kopyasından değerlendiriliyorsa, bu faktör için vahşi tip gen nakavt edilmelidir. Ek olarak, maya arka planı, biri ACT1-CUP1 muhabiri içeren, tarihsel olarak bir lösin besin seçimi plazmidi üzerinde ve diğeri çalışılacak ekleme makinesinde bir mutasyon veya pertürbasyon içeren en az iki plazmidin seçilmesine izin vermelidir (Şekil 2). Genellikle, tek bir tahlilde, her biri sorgu ekleme pertürbasyonunu (QSP) ve farklı bir raporlayıcıyı taşıyan birden çok maya türü, sorgunun ekleme üzerindeki etkisini test eder.
ACT1-CUP1 tahlilindeki bağımsız değişkenler, bir araştırmacının QSP’nin ciddiyetini değerlendirmesine izin verir. Bu bağımsız değişkenler, bakır konsantrasyonu ve birden fazla konsensüs dışı ekleme muhabirinin seçimidir. İlk olarak, maya suşları bir dizi bakır konsantrasyonu içeren plakalar üzerinde yetiştirildiğinden (Şekil 2), tahlilin kurulması, kullanılan konsantrasyonların gradyanının seçilmesini içerir. Çalışmalar, canlılığın ilk okumasını elde etmek için bir kurs bakır konsantrasyon gradyanı kullanabilir ve daha sonra ince canlılık farklılıklarını tanımlamak için tahlili daha ince bir gradanla tekrarlayabilir. İkinci değişken, test edilmesi mümkün olan çok çeşitli ACT1-CUP1 muhabirleridir (Şekil 1 ve Tablo 1). QSP, yabani tipe karşı fikir birliği olmayan bir muhabirin varlığında maya canlılığını farklı şekilde etkilerse, QSP’nin, intron’un bu bölgesinin tanınması veya işlenmesi sırasında önemli olan eklemedeki bir adımı veya spliceosome’un bir bölgesini etkilediği sonucuna varılabilir.
Maya alet kutusu kapsamlıdır ve ACT1-CUP1 testi, ekleme araştırmasının ayrılmaz bir parçasıdır. ACT1-CUP1 testi genellikle bir QSP’nin etkisi üzerinde daha derinlemesine genetik, yapısal ve / veya biyokimyasal bir analizle birlikte gerçekleştirilir. Bu daha ayrıntılı çalışmalar genellikle daha uzun bir prosedüre ve / veya daha yüksek fiyat etiketine sahip olduğundan, sık bir yaklaşım ilk önce ACT1-CUP1 ile ilginç mutantları taramaktır.
Burada bakır levha hazırlığı da dahil olmak üzere bir ACT1-CUP1 tahlil protokolü verilmiştir. Bu tahlil, araştırmacılara QSP’nin ekleme üzerindeki etkisine ve hangi intronic bölgelerinin pertürbasyondan en çok etkilendiğine dair ilk cevabı verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
ACT1-CUP1 bir büyüme testidir ve gözlemlenen büyüme farklılıklarının yalnızca ekleme kusurlarına atfedilebilmesini sağlamak için özen gösterilmelidir. Tüm suşlar, benzer uzunluk ve büyüme ve depolama koşullarına sahip olmak da dahil olmak üzere, kaplamadan önce benzer bir şekilde ele alınmalıdır. Sıcaklığa duyarlı suşlar kullanılıyorsa, ACT1-CUP1 testleri yalnızca bu suşların vahşi tiple karşılaştırılabilir şekilde büyüdüğü koşullar altında yapılmalıdır. İlgili olara…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Aaron Hoskins ve Wisconsin-Madison Üniversitesi’ndeki Hoskins laboratuvar üyelerine, şekil 3-5 neslinde maya suşlarının ve ekipmanlarının kullanımı için teşekkür ederiz. Harpreet Kaur ve Xingyang Fu’ya el yazması hakkındaki anlayışlı yorumları için teşekkür ederiz. Northwest University’deki destekleyici öğrencilere, personele ve fakülteye bu makalenin yazılması, düzenlenmesi ve filme alınması sırasında teşekkür ederiz. Bu yöntemin filme alınmasında yardım için Isabelle Marasigan’a teşekkür ederiz.
Materials
| 1.5 mL sterile microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 2 mL sterile microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-138 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Fisher Scientific | 07-201-332 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 96-well round bottom microplate | Fisher Scientific | 07-200-760 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 190 proof ethanol | Fisher Scientific | 22-032-600 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 500 mL Filter System (0.22 µm) | CellTreat Scientific Products | 229707 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | Any molecular grade agar will work. |
| Autoclave | Tuttnauer | 3870EA | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Bunsen burner | Humboldt | PN6200.1 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Cell Density Meter | VWR | 490005-906 | Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm. |
| Copper sulfate Pentahydrate | Fisher Scientific | LC134051 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Digital imaging system | Cytiva | 29399481 | ImageQuant 4000 (used for Figure 3), Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer. |
| Dropout mix (-Leu) | USBiological Life Sciences | D9525 | Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu |
| D-Glucose | Fisher Scientific | AAA1682836 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Gel band quantifying software | Cytiva | 29-0006-05 | ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer. |
| Hand held camera | Nikon | D3500 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Near infra-red gel imaging device | Cytiva | 29238583 | Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer. |
| Laboratory grade clamp | Fisher Scientific | 05-769-7Q | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Laboratory grade stand and clamp | Fisher Scientific | 12-000-101 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Magnetic stir bars | Fisher Scientific | 14-513-51 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Pin replicator | VP Scientific | VP 407AH | |
| Semi-micro disposable cuvettes | VWR | 97000-590 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Shaker | JEIO Tech | IST-3075 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Spectrophotometer | Biowave | 80-3000-45 | Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm. |
| Square plates | VWR | 102091-156 | Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator. |
| Stir plate | Fisher Scientific | 11-520-16S | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Yeast nitrogen base | USBiological Life Sciences | Y2025 | Or comparable item from a different manufacturer. |
References
- Wahl, M. C., Will, C. L., Luhrmann, R. The spliceosome: Design principles of a dynamic RNP machine. Cell. 136 (4), 701-718 (2009).
- Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
- Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutational analysis of pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae using a sensitive new reporter gene, CUP1. Genetics. 133 (4), 851-863 (1993).
- Ng, R., Abelson, J. Isolation and sequence of the gene for actin in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (7), 3912-3916 (1980).
- Gallwitz, D., Sures, I. Structure of a split yeast gene: Complete nucleotide sequence of the actin gene in I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (5), 2546-2550 (1980).
- Fogel, S., Welch, J. W., Cathala, G., Karin, M. Gene amplification in yeast: CUP1 copy number regulates copper resistance. Current Genetics. 7 (5), 347-355 (1983).
- Hamer, D. H., Thiele, D. J., Lemontt, J. E. Function and autoregulation of yeast copperthionein. Science. 228 (4700), 685-690 (1985).
- Winge, D. R., Nielson, K. B., Gray, W. R., Hamer, D. H. Yeast metallothionein. Sequence and metal-binding properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14464-14470 (1985).
- Burgess, S. M., Guthrie, C. A mechanism to enhance mRNA splicing fidelity: The RNA-dependent ATPase Prp16 governs usage of a discard pathway for aberrant lariat intermediates. Cell. 73 (7), 1377-1391 (1993).
- Collins, C. A., Guthrie, C. Allele-specific genetic interactions between Prp8 and RNA active site residues suggest a function for Prp8 at the catalytic core of the spliceosome. Genes & Development. 13 (15), 1970-1982 (1999).
- Siatecka, M., Reyes, J. L., Konarska, M. M. Functional interactions of Prp8 with both splice sites at the spliceosomal catalytic center. Genes & Development. 13 (15), 1983-1993 (1999).
- Umen, J. G., Guthrie, C. Mutagenesis of the yeast gene PRP8 reveals domains governing the specificity and fidelity of 3′ splice site selection. Genetics. 143 (2), 723-739 (1996).
- Grainger, R. J., Beggs, J. D. Prp8 protein: At the heart of the spliceosome. RNA. 11 (5), 533-557 (2005).
- Query, C. C., Konarska, M. M. Suppression of multiple substrate mutations by spliceosomal prp8 alleles suggests functional correlations with ribosomal ambiguity mutants. Molecular Cell. 14 (3), 343-354 (2004).
- Konarska, M. M., Vilardell, J., Query, C. C. Repositioning of the reaction intermediate within the catalytic center of the spliceosome. Molecular Cell. 21 (4), 543-553 (2006).
- Liu, L., Query, C. C., Konarska, M. M. Opposing classes of prp8 alleles modulate the transition between the catalytic steps of pre-mRNA splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (6), 519-526 (2007).
- MacRae, A. J., et al. Prp8 positioning of U5 snRNA is linked to 5′ splice site recognition. RNA. 24 (6), 769-777 (2018).
- Query, C. C., Konarska, M. M. CEF1/CDC5 alleles modulate transitions between catalytic conformations of the spliceosome. RNA. 18 (5), 1001-1013 (2012).
- Tang, Q., et al. SF3B1/Hsh155 HEAT motif mutations affect interaction with the spliceosomal ATPase Prp5, resulting in altered branch site selectivity in pre-mRNA splicing. Genes & Development. 30 (24), 2710-2723 (2016).
- Carrocci, T. J., Zoerner, D. M., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. SF3b1 mutations associated with myelodysplastic syndromes alter the fidelity of branchsite selection in yeast. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4837-4852 (2017).
- Kaur, H., Groubert, B., Paulson, J. C., McMillan, S., Hoskins, A. A. Impact of cancer-associated mutations in Hsh155/SF3b1 HEAT repeats 9-12 on pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 15 (4), 0229315 (2020).
- vander Feltz, C., et al. Saccharomyces cerevisiae Ecm2 modulates the catalytic steps of pre-mRNA splicing. RNA. 27 (5), 591-603 (2021).
- Carrocci, T. J., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. Functional analysis of Hsh155/SF3b1 interactions with the U2 snRNA/branch site duplex. RNA. 24 (8), 1028-1040 (2018).
- Hogg, R., de Almeida, R. A., Ruckshanthi, J. P., O’Keefe, R. T. Remodeling of U2-U6 snRNA helix I during pre-mRNA splicing by Prp16 and the NineTeen Complex protein Cwc2. Nucleic Acids Research. 42 (12), 8008-8023 (2014).
- Hansen, S. R., Nikolai, B. J., Spreacker, P. J., Carrocci, T. J., Hoskins, A. A. Chemical inhibition of pre-mRNA splicing in living Saccharomyces cerevisiae. Cell Chemical Biology. 26 (3), 443-448 (2019).
- Xu, Y. Z., Query, C. C. Competition between the ATPase Prp5 and branch region-U2 snRNA pairing modulates the fidelity of spliceosome assembly. Molecular Cell. 28 (5), 838-849 (2007).
- Staley, J. P., Guthrie, C. An RNA switch at the 5′ splice site requires ATP and the DEAD box protein Prp28p. Molecular Cell. 3 (1), 55-64 (1999).
- Bousquet-Antonelli, C., Presutti, C., Tollervey, D. Identification of a regulated pathway for nuclear pre-mRNA turnover. Cell. 102 (6), 765-775 (2000).
- Villa, T., Guthrie, C. The Isy1p component of the NineTeen complex interacts with the ATPase Prp16p to regulate the fidelity of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 19 (16), 1894-1904 (2005).
- Mayas, R. M., Maita, H., Staley, J. P. Exon ligation is proofread by the DExD/H-box ATPase Prp22p. Nature Structure and Molecular Biology. 13 (6), 482-490 (2006).
- Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutations in U6 snRNA that alter splice site specificity: Implications for the active site. Science. 262 (5142), 1982-1988 (1993).
- McPheeters, D. S. Interactions of the yeast U6 RNA with the pre-mRNA branch site. RNA. 2 (11), 1110-1123 (1996).
- Perriman, R. J., Ares, M. Rearrangement of competing U2 RNA helices within the spliceosome promotes multiple steps in splicing. Genes & Development. 21 (7), 811-820 (2007).
- Mefford, M. A., Staley, J. P. Evidence that U2/U6 helix I promotes both catalytic steps of pre-mRNA splicing and rearranges in between these steps. RNA. 15 (7), 1386-1397 (2009).
- Hilliker, A. K., Mefford, M. A., Staley, J. P. U2 toggles iteratively between the stem IIa and stem IIc conformations to promote pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (7), 821-834 (2007).
- Wu, G., et al. Pseudouridines in U2 snRNA stimulate the ATPase activity of Prp5 during spliceosome assembly. EMBO Journal. 35 (6), 654-667 (2016).
- Crotti, L. B., Bacikova, D., Horowitz, D. S. The Prp18 protein stabilizes the interaction of both exons with the U5 snRNA during the second step of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (10), 1204-1216 (2007).
- Fogel, S., Welch, J. W. Tandem gene amplification mediates copper resistance in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5342-5346 (1982).
- Gardner, J. M., Jaspersen, S. L. Manipulating the yeast genome: Deletion, mutation, and tagging by PCR. Methods Molecular Biology. 1205, 45-78 (2014).
- JoVE. Yeast Transformation and Cloning. In Biology I: yeast, Drosophila and C. Elegant. JoVE Science Education Database. , (2021).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. Yeast transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods Molecular Biology. 313, 107-120 (2006).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. Genetic transformation of yeast. Biotechniques. 30 (4), 816 (2001).
- Mayerle, M., et al. Structural toggle in the RNaseH domain of Prp8 helps balance splicing fidelity and catalytic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4739-4744 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Beier, D. H., et al. Dynamics of the DEAD-box ATPase Prp5 RecA-like domains provide a conformational switch during spliceosome assembly. Nucleic Acids Research. 47 (20), 10842-10851 (2019).
- vander Feltz, C., DeHaven, A. C., Hoskins, A. A. Stress-induced pseudouridylation alters the structural equilibrium of yeast U2 snRNA Stem II. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 524-536 (2018).
- Rodgers, M. L., Didychuk, A. L., Butcher, S. E., Brow, D. A., Hoskins, A. A. A multi-step model for facilitated unwinding of the yeast U4/U6 RNA duplex. Nucleic Acids Research. 44 (22), 10912-10928 (2016).
- Stutz, F., Rosbash, M. A functional interaction between Rev and yeast pre-mRNA is related to splicing complex formation. EMBO Journal. 13 (17), 4096-4104 (1994).
- Libri, D., Lescure, A., Rosbash, M. Splicing enhancement in the yeast rp51b intron. RNA. 6 (3), 352-368 (2000).
- Libri, D., Stutz, F., McCarthy, T., Rosbash, M. RNA structural patterns and splicing: Molecular basis for an RNA-based enhancer. RNA. 1 (4), 425-436 (1995).
- Howe, K. J., Kane, C. M., Ares, M. Perturbation of transcription elongation influences the fidelity of internal exon inclusion in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 9 (8), 993-1006 (2003).
- Cuenca-Bono, B., et al. SUS1 introns are required for efficient mRNA nuclear export in yeast. Nucleic Acids Research. 39 (19), 8599-8611 (2011).
- Scherrer, F. W., Spingola, M. A subset of Mer1p-dependent introns requires Bud13p for splicing activation and nuclear retention. RNA. 12 (7), 1361-1372 (2006).
- Hálová, M., et al. Nineteen complex-related factor Prp45 is required for the early stages of cotranscriptional spliceosome assembly. RNA. 23 (10), 1512-1524 (2017).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3′ splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
- Crotti, L. B., Horowitz, D. S. Exon sequences at the splice junctions affect splicing fidelity and alternative splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 18954-18959 (2009).
- Perriman, R., Ares, M. Invariant U2 snRNA nucleotides form a stem loop to recognize the intron early in splicing. Molecular Cell. 38 (3), 416-427 (2010).
