Los ensayos ACT1-CUP1 determinan las sensibilidades específicas del sustrato de los mutantes espliceosomales en levaduras en ciernes

El espliceosoma es una gran máquina biológica que cataliza la eliminación de intrones, regiones no codificantes en el ARN mensajero precursor (pre-ARNm)^1,2. La caracterización del efecto de un mutante de un solo punto en 1 de las casi 100 proteínas y 5 ARN no codificantes es a menudo ambigua cuando se estudia la proteína o el ARN de forma aislada. El cambio en la función del componente mutado se puede evaluar mejor in vivo en el contexto del espliceosoma completo y funcional.

El ensayo de crecimiento de cobre descrito aquí es un indicador rápido de la eficiencia de empalme en Saccharomyces cerevisiae o levadura en ciernes. Desarrollado por C.F. Lesser y C. Guthrie y publicado en 1993, este ensayo combina la facilidad de trabajar con un organismo modelo simple y la lectura directa de la viabilidad celular³. La viabilidad se correlaciona con qué tan bien los espliceosomas en estas células pueden reconocer y empalmar la transcripción del reportero.

Este ensayo de crecimiento de cobre se denomina más comúnmente ensayo ACT1-CUP1. El nombre ACT1-CUP1 se origina a partir de los dos genes fusionados para crear un reportero de eficiencia de empalme. ACT1 es el gen de la actina de la levadura, que está altamente expresado y tiene un intrón empalmado eficientemente ^4,5. Cup1p es un quelante de cobre que secuestra cobre en la célula para evitar la interferencia con las funciones celulares regulares ^6,7,8. El reportero ACT1-CUP1 contiene estos genes en secuencia tal que CUP1 está en el marco de lectura adecuado solo si se produce un empalme previo al ARNm del intrón de ACT1 (Figura 1). La proteína de fusión resultante contiene los primeros 21 aminoácidos de actina y la proteína Cup1p de longitud completa, lo que aumenta la viabilidad de la levadura en un ambiente rico en cobre³. Por lo tanto, un aumento en la cantidad de empalme del reportero da como resultado una mayor concentración de Cup1p y una mayor resistencia al cobre (Figura 1). En comparación con otros genes reporteros, CUP1 afecta la viabilidad celular incluso a niveles bajos, tiene un amplio rango de sensibilidad y puede usarse para seleccionar directamente mutaciones de empalme ^3,6,7. Además, CUP1 no es esencial para el crecimiento estándar de la levadura y, por lo tanto, la homeostasis celular no se ve afectada durante la configuración de este ensayo. Complementario a los ensayos de deleción o crecimiento de temperatura, ACT1-CUP1 proporciona información sobre los efectos sobre el empalme en condiciones óptimas de crecimiento de levadura.

El espliceosoma reconoce su sustrato a través de tres secuencias intrónicas, a saber, el sitio de empalme de 5′ (5′ SS), el sitio de ramificación (BS) y el sitio de empalme de 3′ (3′ SS). Se han generado numerosos reporteros ACT1-CUP1 que contienen secuencias no consensuadas en estos sitios. Una selección de los reporteros ACT1-CUP1 más comunes se muestra en la Figura 1 y la Tabla 1. Como el espliceosoma interactúa con cada sitio de empalme de forma única en diferentes puntos del ciclo de empalme, la robustez del espliceosoma se puede probar en diferentes pasos en función de qué informador sin consenso se utiliza. Los reporteros sin consenso se nombran por la posición mutada dentro del intrón y la base a la que fue mutado. Por ejemplo, A3c es un reportero con una mutación en el SS 5′, específicamente la posición 3 de la adenosina de consenso a una citosina. Este reportero interactuará fuertemente con las mutaciones del espliceosoma que afectan la selección y el uso de 5′ SS. En su estudio inicial, Lesser y Guthrie determinaron qué mutaciones 5′ SS inhibían el empalme³. Más tarde, el mismo año, Burgess y Guthrie publicaron reporteros sin consenso en los tres sitios de empalme en una pantalla supresora de mutaciones en la ATPasa Prp16p⁹. Comparando el consenso con los reporteros sin consenso, el ensayo ACT1-CUP1 ha sido una clave importante para comprender la robustez y selectividad del espliceosoma de levadura e inferir la función de los espliceosomas de otros eucariotas.

A medida que los reporteros ACT1-CUP1 sin consenso sensibilizan al espliceosoma a una mayor perturbación, el impacto de una sola mutación del factor de empalme puede caracterizarse a través de los reporteros que impacta positiva o negativamente. Esto se ha aplicado al empalme de preguntas de investigación de varias maneras. En primer lugar, el ensayo ACT1-CUP1 puede y ha sido utilizado como una pantalla genética para mutaciones en los factores de empalme. Por ejemplo, Prp8p, la proteína de empalme más grande, sirve como una plataforma sobre la cual el núcleo de ARN del espliceosoma cataliza la reacción de empalme. Esto se dedujo, en parte, a través de cómo los mutantes Prp8p mejoraron o redujeron el empalme de diferentes reporteros ACT1-CUP1 10,11,12,13,14,15,16,17. Otros componentes proteicos del espliceosoma también se han investigado utilizando ACT1-CUP1, incluyendo Hsh155p, Cwc2p, Cef1p y Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. Los umbrales energéticos para Prp16p y otras cuatro ATPasas involucradas en la transición espliceosomal también se han estudiado con este ensayo 9,26,27,28,29,30. Los ARN nucleares pequeños (snRNAs) también se han estudiado ampliamente utilizando ACT1-CUP1 para identificar las secuencias de pre-ARNm que coordinan y los cambios en la estructura secundaria que sufren los snRNAs durante el empalme 3,31,32,33,34,35,36,37.

El ensayo ACT1-CUP1 requiere una cepa de levadura donde todas las copias del gen CUP1 han sido eliminadas. Como CUP1 puede tener un alto número de copias ^6,38, la preparación de una cepa knock-out completa puede requerir múltiples rondas o un cribado extenso. Como resultado, las cepas de levadura cup1Δ a menudo se han compartido entre laboratorios, al igual que los reporteros.

Si se evalúan mutaciones en un factor de empalme a partir de una copia plásmida, el gen de tipo salvaje para este factor debe ser eliminado. Además, el fondo de levadura debe permitir la selección de al menos dos plásmidos, uno que contenga un reportero ACT1-CUP1, históricamente en un plásmido de selección de nutrientes de leucina, y otro que contenga una mutación o perturbación en la maquinaria de empalme que se estudiará (Figura 2). Por lo general, en un solo ensayo, varias cepas de levadura, cada una con la perturbación de empalme de consulta (QSP) y un reportero diferente, probarán el impacto de la consulta en el empalme.

Las variables independientes en el ensayo ACT1-CUP1 permiten al investigador evaluar la gravedad de un QSP. Estas variables independientes son la concentración de cobre y la selección de múltiples reporteros de empalme sin consenso. En primer lugar, como las cepas de levadura se cultivan en placas que contienen un rango de concentraciones de cobre (Figura 2), la configuración del ensayo incluye la selección del gradiente de concentraciones utilizadas. Los estudios pueden utilizar un gradiente de concentración de cobre de curso para obtener una lectura inicial de la viabilidad y luego repetir el ensayo con un gradiente más fino para identificar diferencias sutiles de viabilidad. La segunda variable es la amplia gama de reporteros ACT1-CUP1 posibles de probar (Figura 1 y Tabla 1). Si el QSP afecta la viabilidad de la levadura de manera diferente en presencia de un informador sin consenso versus de tipo salvaje, se puede concluir que el QSP afecta un paso en el empalme o una región del espliceosoma importante durante el reconocimiento o procesamiento de esa región del intrón.

La caja de herramientas de levadura es extensa, y el ensayo ACT1-CUP1 es una parte integral de la investigación de empalme. El ensayo ACT1-CUP1 a menudo se realiza junto con un análisis genético, estructural y / o bioquímico más profundo sobre el impacto de un QSP. Como estos estudios más detallados generalmente tienen un procedimiento más largo y / o un precio más alto, un enfoque frecuente es la detección de mutantes interesantes con ACT1-CUP1 primero.

Aquí se proporciona un protocolo de ensayo ACT1-CUP1, incluida la preparación de la placa de cobre. Este ensayo proporciona a los investigadores una respuesta inicial al efecto de un QSP en el empalme y qué regiones intrónicas se ven más afectadas por la perturbación.