Ensaios de ACT1-CUP1 determinam as sensibilidades específicas do substrato de mutantes spliceossomais em leveduras em brotamento

O spliceossomo é uma grande máquina biológica que catalisa a remoção de íntrons, regiões não codificantes, no RNA mensageiro precursor (pré-mRNA)^1,2. Caracterizar o efeito de um único mutante pontual em 1 das quase 100 proteínas e 5 RNAs não codificantes é muitas vezes ambíguo ao estudar a proteína ou RNA isoladamente. A mudança na função do componente mutado pode ser melhor avaliada in vivo no contexto do spliceossomo completo e funcional.

O ensaio de crescimento de cobre descrito aqui é um indicador rápido da eficiência de splicing em Saccharomyces cerevisiae ou levedura em brotamento. Desenvolvido por C.F. Lesser e C. Guthrie e publicado em 1993, este ensaio combina a facilidade de trabalhar com um organismo modelo simples e a leitura direta da viabilidade celular³. A viabilidade se correlaciona com o quão bem os spliceossomos nessas células podem reconhecer e emendar o transcrito do repórter.

Este ensaio de crescimento de cobre é mais comumente chamado de ensaio ACT1-CUP1. O nome ACT1-CUP1 origina-se dos dois genes fundidos para criar um repórter de eficiência de splicing. ACT1 é o gene da actina da levedura, que é altamente expresso e tem um íntron eficientemente emendado ^4,5. Cup1p é um quelante de cobre que sequestra o cobre na célula para evitar interferências com as funções celulares regulares ^6,7,8. O relator ACT1-CUP1 contém esses genes em sequência tal que CUP1 está no quadro de leitura adequado somente se ocorrer splicing pré-mRNA do íntron de ACT1 (Figura 1). A proteína de fusão resultante contém os primeiros 21 aminoácidos da actina e a proteína Cup1p de comprimento total, o que aumenta a viabilidade da levedura em um ambiente rico em cobre³. Assim, um aumento na quantidade de splicing do repórter resulta em uma maior concentração de Cup1p e uma maior resistência ao cobre (Figura 1). Em comparação com outros genes repórteres, o CUP1 afeta a viabilidade celular mesmo em níveis baixos, tem uma ampla faixa de sensibilidade e pode ser usado para selecionar diretamente mutações^de splicing ^3,6,7. Além disso, a CUP1 não é essencial para o crescimento padrão de leveduras e, portanto, a homeostase celular não é afetada durante a configuração deste ensaio. Complementar aos ensaios de exclusão ou crescimento de temperatura, o ACT1-CUP1 fornece informações sobre os efeitos no splicing sob condições ideais de crescimento de leveduras.

O spliceossomo reconhece seu substrato através de três sequências intrônicas, a saber, o local de emenda de 5′ (5′ SS), o local de ramificação (BS) e o local de emenda de 3′ (3′ SS). Numerosos repórteres ACT1-CUP1 foram gerados contendo sequências não consensuais nesses locais. Uma seleção dos repórteres ACT1-CUP1 mais comuns é mostrada na Figura 1 e na Tabela 1. Como o spliceossomo interage com cada local de emenda exclusivamente em diferentes pontos do ciclo de emenda, a robustez do spliceossomo pode ser testada em diferentes etapas com base nas quais o repórter não consensual é usado. Repórteres não consensuais são nomeados para a posição mutada dentro do íntron e a base para a qual ele foi mutado. Por exemplo, A3c é um repórter com uma mutação no SS 5′, especificamente a posição 3 da adenosina de consenso para uma citosina. Este repórter irá interagir fortemente com mutações de spliceossomas que afetam a seleção e o uso de SS de 5′. Em seu estudo inicial, Lesser e Guthrie determinaram quais mutações de 5′ SS inibiram o splicing³. Mais tarde, no mesmo ano, repórteres não consensuais em todos os três locais de emenda foram publicados por Burgess e Guthrie em uma tela supressora de mutações na ATPase Prp16p⁹. Comparando o consenso com os repórteres não consensuais, o ensaio ACT1-CUP1 tem sido uma chave importante para a compreensão da robustez e seletividade do spliceossomo de levedura e para inferir a função dos spliceossomos de outros eucariotos.

À medida que os repórteres ACT1-CUP1 não consensuais sensibilizam o spliceossomo para uma perturbação adicional, o impacto de uma única mutação do fator de splicing pode ser caracterizado através dos repórteres que impacta positiva ou negativamente. Isso tem sido aplicado ao splicing de perguntas de pesquisa de várias maneiras. Primeiro, o ensaio ACT1-CUP1 pode e tem sido usado como uma triagem genética para mutações em fatores de splicing. Por exemplo, Prp8p, a maior proteína de splicing, serve como uma plataforma sobre a qual o núcleo de RNA do spliceossomo catalisa a reação de splicing. Isso foi deduzido, em parte, através de como os mutantes Prp8p melhoraram ou reduziram o splicing de diferentes repórteres ACT1-CUP1 10,11,12,13,14,15,16,17. Outros componentes proteicos do spliceossomo também foram investigados usando ACT1-CUP1, incluindo Hsh155p, Cwc2p, Cef1p e Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. Os limiares energéticos para Prp16p e outras quatro ATPases envolvidas na transição spliceossômica também foram estudados com este ensaio 9,26,27,28,29,30. Os pequenos RNAs nucleares (snRNAs) também têm sido extensivamente estudados utilizando ACT1-CUP1 para identificar as sequências de pré-mRNA que coordenam e as mudanças na estrutura secundária que os snRNAs sofrem durante o splicing 3,31,32,33,34,35,36,37.

O ensaio ACT1-CUP1 requer uma cepa de levedura onde todas as cópias do gene CUP1 foram eliminadas. Como o CUP1 pode ter um número de cópia alto ^6,38, a preparação de uma cepa completa de nocaute pode exigir várias rodadas ou triagem extensiva. Como resultado, as cepas de levedura cup1Δ têm sido frequentemente compartilhadas entre laboratórios, assim como os repórteres.

Se a(s) mutação(ões) em um fator de splicing estiver sendo avaliada a partir de uma cópia plasmídica, o gene do tipo selvagem para esse fator deve ser eliminado. Além disso, o fundo de levedura deve permitir a seleção de pelo menos dois plasmídeos, um contendo um repórter ACT1-CUP1, historicamente em um plasmídeo de seleção de nutrientes de leucina, e outro contendo uma mutação ou perturbação na maquinaria de splicing que será estudada (Figura 2). Normalmente, em um único ensaio, várias cepas de levedura, cada uma carregando a perturbação de emenda de consulta (QSP) e um repórter diferente, testarão o impacto da consulta no splicing.

As variáveis independentes no ensaio ACT1-CUP1 permitem ao pesquisador avaliar a gravidade de um QSP. Essas variáveis independentes são a concentração de cobre e a seleção de múltiplos repórteres de splicing não consensuais. Em primeiro lugar, uma vez que as estirpes de levedura são cultivadas em placas contendo uma gama de concentrações de cobre (Figura 2), a configuração do ensaio inclui a selecção do gradiente de concentrações utilizadas. Os estudos podem utilizar um gradiente de concentração de cobre de curso para obter uma leitura inicial da viabilidade e, em seguida, repetir o ensaio com um gradiente mais fino para identificar diferenças sutis de viabilidade. A segunda variável é a ampla gama de repórteres ACT1-CUP1 possíveis de testar (Figura 1 e Tabela 1). Se o QSP impacta a viabilidade da levedura de forma diferente na presença de um repórter não consensual versus do tipo selvagem, pode-se concluir que o QSP afeta uma etapa no splicing ou uma região do spliceossomo importante durante o reconhecimento ou processamento dessa região do intron.

A caixa de ferramentas de levedura é extensa e o ensaio ACT1-CUP1 é parte integrante da pesquisa de emenda. O ensaio ACT1-CUP1 é frequentemente realizado juntamente com uma análise genética, estrutural e/ou bioquímica mais aprofundada sobre o impacto de um QSP. Como esses estudos mais detalhados geralmente têm um procedimento mais demorado e / ou preço mais alto, uma abordagem frequente é a triagem de mutantes interessantes com ACT1-CUP1 primeiro.

Fornecido aqui é um protocolo de ensaio ACT1-CUP1, incluindo a preparação da placa de cobre. Este ensaio fornece aos pesquisadores uma resposta inicial para o efeito de um QSP no splicing e quais regiões intrônicas são mais afetadas pela perturbação.