JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

מבחני ACT1-CUP1 קובעים את הרגישויות הספציפיות למצע של מוטנטים שחבורים בשמרים ניצנים

Published: June 30, 2022
doi:
10.3791/63232
1College of Arts and Sciences,Northwest University

Summary

בדיקת ACT1-CUP1, בדיקת גידול נחושת, מספקת קריאה מהירה של שחבור RNA שליח מבשר (pre-mRNA) וההשפעה שיש לגורמי שחבור מוטנטיים על תפקוד השחבור השחבור. מחקר זה מספק פרוטוקול ומדגיש את ההתאמה האישית האפשרית כדי להתמודד עם שאלת השחבור המעניינת.

Abstract

מוטציות שהוכנסו בספליקוזום או במצע שלו תרמו באופן משמעותי להבנתנו את המורכבות של תפקוד השחבור. בין אם הן קשורות למחלה או נבחרו באופן פונקציונלי, רבות מהמוטציות הללו נחקרו באמצעות מבחני גדילה באורגניזם המודל Saccharomyces cerevisiae (שמרים). בדיקת צמיחת הנחושת הספציפית לשחבור, או בדיקת ACT1-CUP1, מספקת ניתוח מקיף של מוטציה ברמה הפנוטיפית. בדיקת ACT1-CUP1 משתמשת בעיתונאים המעניקים עמידות לנחושת כאשר הם מחוברים כהלכה. לפיכך, בנוכחות נחושת, שינויים בכדאיות השמרים מתואמים לשינויים בייצור mRNA באמצעות שחבור. בניסוי טיפוסי, שחבור השמרים מאותגר עם כתבי שחבור שונים שאינם בקונצנזוס ומוטציה של גורם שחבור מעניין כדי לזהות כל השפעה סינרגטית או אנטיתטית על השחבור. כאן ניתן תיאור מלא של הכנת לוחות נחושת, ציפוי של תאי שמרים והערכת נתונים. מתואר מבחר של ניסויים משלימים, המדגישים את הרבגוניות של כתבי ACT1-CUP1. בדיקת ACT1-CUP1 היא כלי שימושי בארגז הכלים של השחבור הודות לקריאה ישירה של אפקטים מוטציוניים והאפשרויות ההשוואתיות מהמשך השימוש בשטח.

Introduction

השחבור הוא מכונה ביולוגית גדולה המזרזת הסרה של אינטרונים, אזורים שאינם מקודדים ב-RNA שליח מבשר (pre-mRNA)1,2. אפיון ההשפעה של מוטציה נקודתית אחת ב-1 מתוך כמעט 100 חלבונים ו-5 רנ”א שאינם מקודדים הוא לעתים קרובות דו-משמעי כאשר חוקרים את החלבון או הרנ”א בבידוד. את השינוי בתפקוד הרכיב המוטנטי ניתן להעריך בצורה הטובה ביותר in vivo בהקשר של השחבור המלא והמתפקד.

בדיקת צמיחת הנחושת המתוארת כאן היא מדד מהיר של יעילות שחבור ב- Saccharomyces cerevisiae או שמרים ניצנים. בדיקה זו, שפותחה על ידי C.F. Lesser ו- C. Guthrie ופורסמה בשנת 1993, משלבת את קלות העבודה עם אורגניזם מודל פשוט ואת הקריאה הפשוטה של כדאיות התא3. הכדאיות מתואמת עם מידת היכולת של השחבורים בתאים אלה לזהות ולפצל את תעתיק הכתב.

בדיקת גידול נחושת זו נקראת בדרך כלל בדיקת ACT1-CUP1. השם ACT1-CUP1 מקורו בשני הגנים שהתמזגו ליצירת כתב של יעילות שחבור. ACT1 הוא גן האקטין של שמרים, אשר בא לידי ביטוי גבוה ויש לו אינטרוןשחבור יעיל 4,5. Cup1p הוא צ’לטור נחושת המסנן נחושת בתא כדי למנוע הפרעה לתפקודים תאיים סדירים 6,7,8. כתב ACT1-CUP1 מכיל את הגנים האלה ברצף כך ש-CUP1 נמצא במסגרת הקריאה הנכונה רק אם מתרחשת שחבור קדם-mRNA של האינטרון של ACT1 (איור 1). חלבון הפיוז’ן המתקבל מכיל את 21 חומצות האמינו הראשונות של אקטין ואת חלבון Cup1p באורך מלא, מה שמגדיל את כדאיות השמרים בסביבה עשירה בנחושת3. לפיכך, עלייה בכמות השחבור של הכתב גורמת לריכוז גבוה יותר של Cup1p ולהתנגדות נחושת גבוהה יותר (איור 1). בהשוואה לגנים מדווחים אחרים, CUP1 משפיע על כדאיות התאים גם ברמות נמוכות, יש לו טווח רגישות רחב, וניתן להשתמש בו כדי לבחור ישירות עבור שחבור מוטציות 3,6,7. בנוסף, CUP1 אינו חיוני לצמיחת שמרים סטנדרטית, ולכן הומאוסטזיס תאי אינו מושפע במהלך ההתקנה לבדיקה זו. ACT1-CUP1, המשלים את מבחני המחיקה או הצמיחה בטמפרטורה, מספק מידע על ההשפעות על שחבור בתנאי גידול שמרים אופטימליים אחרים.

השחבור מזהה את המצע שלו באמצעות שלושה רצפים אינטרוניים, כלומר אתר שחבור 5′ (5′ SS), אתר הסתעפות (BS) ואתר שחבור 3′ (3′ SS). באתרים אלה נוצרו מספר רב של כתבי ACT1-CUP1 המכילים רצפים שאינם בקונצנזוס. מבחר מהכתבים הנפוצים ביותר של ACT1-CUP1 מוצג באיור 1 ובטבלה 1. מכיוון שהשחבור מקיים אינטראקציה עם כל אתר שחבור באופן ייחודי בנקודות שונות במחזור השחבור, ניתן לבחון את חוסנו של השחבור בשלבים שונים על סמך איזה כתב שאינו קונצנזוס משמש. כתבים שאינם בקונצנזוס נקראים על שם העמדה שעברה מוטציה בתוך האינטרון והבסיס שאליו הוא עבר מוטציה. לדוגמה, A3c הוא כתב עם מוטציה ב-5′ SS, במיוחד מיקום 3 מהקונצנזוס אדנוזין לציטוזין. כתב זה יקיים אינטראקציה חזקה עם מוטציות spliceosome המשפיעות על בחירת 5′ SS ושימוש. במחקר הראשוני שלהם, לסר וגות’רי קבעו אילו מוטציות SS 5′ מעכבות שחבור3. מאוחר יותר באותה שנה, כתבים שאינם בקונצנזוס בכל שלושת אתרי השחבור פורסמו על ידי ברג’ס וגות’רי במסך מדכא של מוטציות ב-ATPase Prp16p9. בהשוואה בין קונצנזוס לכתבים שאינם בקונצנזוס, מבחן ACT1-CUP1 היה מפתח חשוב להבנת החוסן והסלקטיביות של שחבור השמרים ולהסקת התפקוד של שחבורים אחרים של אאוקריוטים.

מכיוון שכתבי ACT1-CUP1 שאינם בקונצנזוס חושים את השחבור להפרעה נוספת, ניתן לאפיין את ההשפעה של מוטציה של גורם שחבור יחיד באמצעות הכתבים שהיא משפיעה עליהם באופן חיובי או שלילי. זה יושם על שחבור שאלות מחקר במגוון דרכים. ראשית, בדיקת ACT1-CUP1 יכולה לשמש כבדיקה גנטית למוטציות בגורמי שחבור. לדוגמה, Prp8p, חלבון השחבור הגדול ביותר, משמש כפלטפורמה שעליה ליבת הרנ”א של השחבור מזרזת את תגובת השחבור. זה הסיק, בין השאר, באמצעות האופן שבו מוטנטים של Prp8p שיפרו או הפחיתו את השחבור של כתבי ACT1-CUP1 שונים 10,11,12,13,14,15,16,17. רכיבי חלבון אחרים של השחבור נחקרו גם הם באמצעות ACT1-CUP1, כולל Hsh155p, Cwc2p, Cef1p ו-Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. הסף האנרגטי של Prp16p וארבעה ATPases אחרים המעורבים במעבר spliceosomal נחקרו גם הם באמצעות בדיקה זו 9,26,27,28,29,30. הרנ”א הגרעיניים הקטנים (snRNAs) נחקרו בהרחבה תוך שימוש ב-ACT1-CUP1 כדי לזהות את רצפי הקדם-mRNA שהם מתאמים ואת השינויים במבנה המשני שה-snRNAs עוברים במהלך שחבור 3,31,32,33,34,35,36,37.

בדיקת ACT1-CUP1 דורשת זן שמרים שבו כל העותקים של הגן CUP1 הודבקו. מכיוון של-CUP1 יכול להיות מספר עותק גבוה 6,38, הכנה של מאמץ נוק-אאוט מלא יכולה לדרוש סיבובים מרובים או סינון נרחב. כתוצאה מכך, זני שמרים cup1Δ חולקו לעתים קרובות בין המעבדות, וכך גם הכתבים.

אם מוטציות בפקטור שחבור נבדקות מעותק פלסמיד, יש לדפוק את הגן מסוג בר עבור גורם זה. בנוסף, רקע השמרים אמור לאפשר בחירה של לפחות שני פלסמידים, אחד המכיל כתב ACT1-CUP1, באופן היסטורי על פלסמיד לבחירת חומרים מזינים של לאוצין, ואחד המכיל מוטציה או הפרעה במנגנון השחבור שייחקרו (איור 2). בדרך כלל, בבדיקה אחת, זני שמרים מרובים, שכל אחד מהם נושא את השאילתה splicing perturbation (QSP) וכתב אחר, יבדקו את השפעת השאילתה על השחבור.

המשתנים הבלתי תלויים במבחן ACT1-CUP1 מאפשרים לחוקר להעריך את חומרת ה-QSP. משתנים בלתי תלויים אלה הם ריכוז הנחושת ובחירתם של כתבים רבים שאינם בקונצנזוס. ראשית, כאשר זני השמרים גדלים על לוחות המכילים מגוון ריכוזי נחושת (איור 2), הגדרת הבדיקה כוללת בחירת השיפוע של הריכוזים שבהם נעשה שימוש. מחקרים יכולים להשתמש בשיפוע ריכוז נחושת קורס כדי לקבל קריאה ראשונית של הכדאיות ולאחר מכן לחזור על הבדיקה עם שיפוע עדין יותר כדי לזהות הבדלים עדינים בכדאיות. המשתנה השני הוא המגוון הרחב של כתבי ACT1-CUP1 שניתן לבדוק (איור 1 וטבלה 1). אם ה-QSP משפיע באופן שונה על כדאיות השמרים בנוכחות כתב שאינו קונצנזוס לעומת סוג פראי, ניתן להסיק מסקנה שה-QSP משפיע על שלב בשחבור או על אזור של השחבור החשוב במהלך הזיהוי או העיבוד של אותו אזור של האינטרון.

ארגז הכלים של השמרים הוא נרחב, ובדיקת ACT1-CUP1 היא חלק בלתי נפרד ממחקר השחבור. בדיקת ACT1-CUP1 מבוצעת לעתים קרובות לצד ניתוח גנטי, מבני ו/או ביוכימי מעמיק יותר על ההשפעה של QSP. מכיוון שלמחקרים מפורטים יותר אלה יש בדרך כלל הליך ארוך יותר ו/או תג מחיר גבוה יותר, גישה שכיחה היא סינון מוטנטים מעניינים עם ACT1-CUP1 תחילה.

מסופק כאן פרוטוקול בדיקה ACT1-CUP1, כולל הכנת לוחות נחושת. בדיקה זו מספקת לחוקרים תשובה ראשונית להשפעת QSP על שחבור ואילו אזורים פנימיים מושפעים ביותר מההפרעה.

Protocol

1. בניית זן שמרים צור או קבל זן S. cerevisiae שהרקע שלו כולל leu2 ו – cup1Δ. כדי ליצור את הרקע הזה, השתמש בשיטת השמרים המבוססת היטב המשתמשת בליתיום אצטט ובדנ”אחד-גדילי 39.הערה: זני שמרים הפלואידים עשויים להכיל עותק אחד, שניים או יותר של CUP1</s…

Representative Results

מבחני צמיחה, כמו ACT1-CUP1, דורשים הערכה חזותית והשוואתית של מושבות מרובות. כאן, כל זן גדל לרוויה בן לילה, מדוללל-OD 600 של 0.5, ומצופה על 20 לוחות המכילים טווח של ריכוזי נחושת מ-0 mM עד 1.1 mM CuSO4 (איור 3). טווח זה קטן יותר מזה המופיע בפרוטוקול מכיוון שהוא מאפשר הערכה מלאה של ההשפע…

Discussion

ACT1-CUP1 הוא מבחן גדילה, ויש לנקוט בזהירות כדי להבטיח שניתן לייחס הבדלי גדילה שנצפו רק לפגמים בשחבור. יש לטפל בכל הזנים באופן דומה לפני הציפוי, כולל אורך וסוג דומים של תנאי גידול ואחסון. אם משתמשים בזנים רגישים לטמפרטורה, יש לבצע בדיקות ACT1-CUP1 רק בתנאים שבהם זנים אלה גדלים באופן דומה לסוג בר. באו…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

תודה לאהרון הוסקינס ולחברי מעבדת הוסקינס באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון על השימוש בזני שמרים ובציוד בדור של איורים 3-5. תודה להרפרט קאור ושינגיאנג פו על הערותיהם התובנות על כתב היד. תודה לסטודנטים, לסגל ולסגל התומכים באוניברסיטת נורת’ווסט במהלך הכתיבה, העריכה והצילומים של מאמר זה. תודה לאיזבל מרסיגן על העזרה בצילום שיטה זו.

Materials

1.5 mL sterile microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129 Or comparable item from a different manufacturer.
2 mL sterile microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-138 Or comparable item from a different manufacturer.
50 mL sterile centrifuge tubes Fisher Scientific 07-201-332 Or comparable item from a different manufacturer.
96-well round bottom microplate Fisher Scientific 07-200-760 Or comparable item from a different manufacturer.
190 proof ethanol Fisher Scientific 22-032-600 Or comparable item from a different manufacturer.
500 mL Filter System (0.22 µm) CellTreat Scientific Products 229707 Or comparable item from a different manufacturer.
Agar Fisher Scientific BP1423-500 Any molecular grade agar will work.
Autoclave Tuttnauer 3870EA Or comparable item from a different manufacturer.
Bunsen burner Humboldt PN6200.1 Or comparable item from a different manufacturer.
Cell Density Meter VWR 490005-906 Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm.
Copper sulfate Pentahydrate Fisher Scientific LC134051 Or comparable item from a different manufacturer.
Digital imaging system Cytiva 29399481 ImageQuant 4000 (used for Figure 3),  Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer.
Dropout mix (-Leu) USBiological Life Sciences D9525 Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu
D-Glucose Fisher Scientific AAA1682836 Or comparable item from a different manufacturer.
Gel band quantifying software Cytiva 29-0006-05 ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer.
Hand held camera Nikon D3500 Or comparable item from a different manufacturer.
Near infra-red gel imaging device Cytiva 29238583 Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade clamp Fisher Scientific 05-769-7Q Or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade stand and clamp Fisher Scientific 12-000-101 Or comparable item from a different manufacturer.
Magnetic stir bars Fisher Scientific 14-513-51 Or comparable item from a different manufacturer.
Pin replicator VP Scientific VP 407AH
Semi-micro disposable cuvettes VWR 97000-590 Or comparable item from a different manufacturer.
Shaker JEIO Tech IST-3075 Or comparable item from a different manufacturer.
Spectrophotometer Biowave 80-3000-45 Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm.
Square plates VWR 102091-156 Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator.
Stir plate Fisher Scientific 11-520-16S Or comparable item from a different manufacturer.
Yeast nitrogen base USBiological Life Sciences Y2025 Or comparable item from a different manufacturer.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wahl, M. C., Will, C. L., Luhrmann, R. The spliceosome: Design principles of a dynamic RNP machine. Cell. 136 (4), 701-718 (2009).
  2. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  3. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutational analysis of pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae using a sensitive new reporter gene, CUP1. Genetics. 133 (4), 851-863 (1993).
  4. Ng, R., Abelson, J. Isolation and sequence of the gene for actin in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (7), 3912-3916 (1980).
  5. Gallwitz, D., Sures, I. Structure of a split yeast gene: Complete nucleotide sequence of the actin gene in I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (5), 2546-2550 (1980).
  6. Fogel, S., Welch, J. W., Cathala, G., Karin, M. Gene amplification in yeast: CUP1 copy number regulates copper resistance. Current Genetics. 7 (5), 347-355 (1983).
  7. Hamer, D. H., Thiele, D. J., Lemontt, J. E. Function and autoregulation of yeast copperthionein. Science. 228 (4700), 685-690 (1985).
  8. Winge, D. R., Nielson, K. B., Gray, W. R., Hamer, D. H. Yeast metallothionein. Sequence and metal-binding properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14464-14470 (1985).
  9. Burgess, S. M., Guthrie, C. A mechanism to enhance mRNA splicing fidelity: The RNA-dependent ATPase Prp16 governs usage of a discard pathway for aberrant lariat intermediates. Cell. 73 (7), 1377-1391 (1993).
  10. Collins, C. A., Guthrie, C. Allele-specific genetic interactions between Prp8 and RNA active site residues suggest a function for Prp8 at the catalytic core of the spliceosome. Genes & Development. 13 (15), 1970-1982 (1999).
  11. Siatecka, M., Reyes, J. L., Konarska, M. M. Functional interactions of Prp8 with both splice sites at the spliceosomal catalytic center. Genes & Development. 13 (15), 1983-1993 (1999).
  12. Umen, J. G., Guthrie, C. Mutagenesis of the yeast gene PRP8 reveals domains governing the specificity and fidelity of 3′ splice site selection. Genetics. 143 (2), 723-739 (1996).
  13. Grainger, R. J., Beggs, J. D. Prp8 protein: At the heart of the spliceosome. RNA. 11 (5), 533-557 (2005).
  14. Query, C. C., Konarska, M. M. Suppression of multiple substrate mutations by spliceosomal prp8 alleles suggests functional correlations with ribosomal ambiguity mutants. Molecular Cell. 14 (3), 343-354 (2004).
  15. Konarska, M. M., Vilardell, J., Query, C. C. Repositioning of the reaction intermediate within the catalytic center of the spliceosome. Molecular Cell. 21 (4), 543-553 (2006).
  16. Liu, L., Query, C. C., Konarska, M. M. Opposing classes of prp8 alleles modulate the transition between the catalytic steps of pre-mRNA splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (6), 519-526 (2007).
  17. MacRae, A. J., et al. Prp8 positioning of U5 snRNA is linked to 5′ splice site recognition. RNA. 24 (6), 769-777 (2018).
  18. Query, C. C., Konarska, M. M. CEF1/CDC5 alleles modulate transitions between catalytic conformations of the spliceosome. RNA. 18 (5), 1001-1013 (2012).
  19. Tang, Q., et al. SF3B1/Hsh155 HEAT motif mutations affect interaction with the spliceosomal ATPase Prp5, resulting in altered branch site selectivity in pre-mRNA splicing. Genes & Development. 30 (24), 2710-2723 (2016).
  20. Carrocci, T. J., Zoerner, D. M., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. SF3b1 mutations associated with myelodysplastic syndromes alter the fidelity of branchsite selection in yeast. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4837-4852 (2017).
  21. Kaur, H., Groubert, B., Paulson, J. C., McMillan, S., Hoskins, A. A. Impact of cancer-associated mutations in Hsh155/SF3b1 HEAT repeats 9-12 on pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 15 (4), 0229315 (2020).
  22. vander Feltz, C., et al. Saccharomyces cerevisiae Ecm2 modulates the catalytic steps of pre-mRNA splicing. RNA. 27 (5), 591-603 (2021).
  23. Carrocci, T. J., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. Functional analysis of Hsh155/SF3b1 interactions with the U2 snRNA/branch site duplex. RNA. 24 (8), 1028-1040 (2018).
  24. Hogg, R., de Almeida, R. A., Ruckshanthi, J. P., O’Keefe, R. T. Remodeling of U2-U6 snRNA helix I during pre-mRNA splicing by Prp16 and the NineTeen Complex protein Cwc2. Nucleic Acids Research. 42 (12), 8008-8023 (2014).
  25. Hansen, S. R., Nikolai, B. J., Spreacker, P. J., Carrocci, T. J., Hoskins, A. A. Chemical inhibition of pre-mRNA splicing in living Saccharomyces cerevisiae. Cell Chemical Biology. 26 (3), 443-448 (2019).
  26. Xu, Y. Z., Query, C. C. Competition between the ATPase Prp5 and branch region-U2 snRNA pairing modulates the fidelity of spliceosome assembly. Molecular Cell. 28 (5), 838-849 (2007).
  27. Staley, J. P., Guthrie, C. An RNA switch at the 5′ splice site requires ATP and the DEAD box protein Prp28p. Molecular Cell. 3 (1), 55-64 (1999).
  28. Bousquet-Antonelli, C., Presutti, C., Tollervey, D. Identification of a regulated pathway for nuclear pre-mRNA turnover. Cell. 102 (6), 765-775 (2000).
  29. Villa, T., Guthrie, C. The Isy1p component of the NineTeen complex interacts with the ATPase Prp16p to regulate the fidelity of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 19 (16), 1894-1904 (2005).
  30. Mayas, R. M., Maita, H., Staley, J. P. Exon ligation is proofread by the DExD/H-box ATPase Prp22p. Nature Structure and Molecular Biology. 13 (6), 482-490 (2006).
  31. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutations in U6 snRNA that alter splice site specificity: Implications for the active site. Science. 262 (5142), 1982-1988 (1993).
  32. McPheeters, D. S. Interactions of the yeast U6 RNA with the pre-mRNA branch site. RNA. 2 (11), 1110-1123 (1996).
  33. Perriman, R. J., Ares, M. Rearrangement of competing U2 RNA helices within the spliceosome promotes multiple steps in splicing. Genes & Development. 21 (7), 811-820 (2007).
  34. Mefford, M. A., Staley, J. P. Evidence that U2/U6 helix I promotes both catalytic steps of pre-mRNA splicing and rearranges in between these steps. RNA. 15 (7), 1386-1397 (2009).
  35. Hilliker, A. K., Mefford, M. A., Staley, J. P. U2 toggles iteratively between the stem IIa and stem IIc conformations to promote pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (7), 821-834 (2007).
  36. Wu, G., et al. Pseudouridines in U2 snRNA stimulate the ATPase activity of Prp5 during spliceosome assembly. EMBO Journal. 35 (6), 654-667 (2016).
  37. Crotti, L. B., Bacikova, D., Horowitz, D. S. The Prp18 protein stabilizes the interaction of both exons with the U5 snRNA during the second step of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (10), 1204-1216 (2007).
  38. Fogel, S., Welch, J. W. Tandem gene amplification mediates copper resistance in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5342-5346 (1982).
  39. Gardner, J. M., Jaspersen, S. L. Manipulating the yeast genome: Deletion, mutation, and tagging by PCR. Methods Molecular Biology. 1205, 45-78 (2014).
  40. JoVE. Yeast Transformation and Cloning. In Biology I: yeast, Drosophila and C. Elegant. JoVE Science Education Database. , (2021).
  41. Gietz, R. D., Woods, R. A. Yeast transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods Molecular Biology. 313, 107-120 (2006).
  42. Gietz, R. D., Woods, R. A. Genetic transformation of yeast. Biotechniques. 30 (4), 816 (2001).
  43. Mayerle, M., et al. Structural toggle in the RNaseH domain of Prp8 helps balance splicing fidelity and catalytic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4739-4744 (2017).
  44. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  45. Beier, D. H., et al. Dynamics of the DEAD-box ATPase Prp5 RecA-like domains provide a conformational switch during spliceosome assembly. Nucleic Acids Research. 47 (20), 10842-10851 (2019).
  46. vander Feltz, C., DeHaven, A. C., Hoskins, A. A. Stress-induced pseudouridylation alters the structural equilibrium of yeast U2 snRNA Stem II. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 524-536 (2018).
  47. Rodgers, M. L., Didychuk, A. L., Butcher, S. E., Brow, D. A., Hoskins, A. A. A multi-step model for facilitated unwinding of the yeast U4/U6 RNA duplex. Nucleic Acids Research. 44 (22), 10912-10928 (2016).
  48. Stutz, F., Rosbash, M. A functional interaction between Rev and yeast pre-mRNA is related to splicing complex formation. EMBO Journal. 13 (17), 4096-4104 (1994).
  49. Libri, D., Lescure, A., Rosbash, M. Splicing enhancement in the yeast rp51b intron. RNA. 6 (3), 352-368 (2000).
  50. Libri, D., Stutz, F., McCarthy, T., Rosbash, M. RNA structural patterns and splicing: Molecular basis for an RNA-based enhancer. RNA. 1 (4), 425-436 (1995).
  51. Howe, K. J., Kane, C. M., Ares, M. Perturbation of transcription elongation influences the fidelity of internal exon inclusion in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 9 (8), 993-1006 (2003).
  52. Cuenca-Bono, B., et al. SUS1 introns are required for efficient mRNA nuclear export in yeast. Nucleic Acids Research. 39 (19), 8599-8611 (2011).
  53. Scherrer, F. W., Spingola, M. A subset of Mer1p-dependent introns requires Bud13p for splicing activation and nuclear retention. RNA. 12 (7), 1361-1372 (2006).
  54. Hálová, M., et al. Nineteen complex-related factor Prp45 is required for the early stages of cotranscriptional spliceosome assembly. RNA. 23 (10), 1512-1524 (2017).
  55. Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3′ splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
  56. Crotti, L. B., Horowitz, D. S. Exon sequences at the splice junctions affect splicing fidelity and alternative splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 18954-18959 (2009).
  57. Perriman, R., Ares, M. Invariant U2 snRNA nucleotides form a stem loop to recognize the intron early in splicing. Molecular Cell. 38 (3), 416-427 (2010).

Tags

ACT1-CUP1 AssayPre-messenger RNA SplicingSplicing Factor MutationGrowth PhenotypeLeucine Dropout Growth MediaCopper SulfateOptical DensitySpectrophotometerDilutionBunsen BurnerReplicator

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
van der Feltz, C. ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (184), e63232, doi:10.3791/63232 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image