ACT1-CUP1-Assays bestimmen die substratspezifischen Sensitivitäten von spleißeosomalen Mutanten in knospender Hefe

Das Spleißosom ist eine große, biologische Maschine, die die Entfernung von Introns, nicht-kodierenden Regionen in der Vorläufer-Boten-RNA (pre-mRNA)^1,2, katalysiert. Die Charakterisierung der Wirkung einer Einzelpunktmutante in 1 der fast 100 Proteine und 5 nicht-kodierenden RNAs ist oft mehrdeutig, wenn das Protein oder die RNA isoliert untersucht wird. Die Veränderung der Funktion der mutierten Komponente kann am besten in vivo im Kontext des vollen, funktionierenden Spleißosoms beurteilt werden.

Der hier beschriebene Kupferwachstumstest ist ein schnelles Maß für die Spleißeffizienz in Saccharomyces cerevisiae oder Knospungshefe. Dieser von C.F. Lesser und C. Guthrie entwickelte und 1993 veröffentlichte Assay kombiniert die einfache Arbeit mit einem einfachen Modellorganismus und dem einfachen Auslesen der Zelllebensfähigkeit³. Die Lebensfähigkeit korreliert damit, wie gut die Spleißosomen in diesen Zellen das Reportertranskript erkennen und spleißen können.

Dieser Kupferwachstumstest wird häufiger als ACT1-CUP1-Assay bezeichnet. Der Name ACT1-CUP1 stammt von den beiden Genen, die fusioniert wurden, um einen Reporter der Spleißeffizienz zu schaffen. ACT1 ist das Aktin-Gen der Hefe, das stark exprimiert wird und ein effizient gespleißtes Intron ^4,5 aufweist. Cup1p ist ein Kupferchelator, der Kupfer in der Zelle sequestriert, um Störungen mit regulären Zellfunktionen^{zu verhindern 6,7,8}. Der ACT1-CUP1-Reporter enthält diese Gene sequenziell, so dass CUP1 nur dann im richtigen Leserahmen ist, wenn das Intron von ACT1 vor der mRNA gespleißt wird (Abbildung 1). Das resultierende Fusionsprotein enthält die ersten 21 Aminosäuren des Aktins und das Cup1p-Protein in voller Länge, was die Lebensfähigkeit der Hefe in einer kupferreichen Umgebung erhöht³. So führt eine Erhöhung der Spleißmenge des Reporters zu einer höheren Konzentration von Cup1p und einer höheren Kupferbeständigkeit (Abbildung 1). Im Vergleich zu anderen Reportergenen beeinflusst CUP1 die Zelllebensfähigkeit bereits bei niedrigen Konzentrationen, hat einen großen Sensitivitätsbereich und kann verwendet werden, um Mutationen ^3,6,7 direkt für das Spleißen^auszuwählen. Darüber hinaus ist CUP1 für das Standard-Hefewachstum nicht essentiell, so dass die zelluläre Homöostase während des Aufbaus für diesen Assay nicht beeinflusst wird. Ergänzend zu Deletions- oder Temperaturwachstumsassays liefert ACT1-CUP1 Informationen über die Auswirkungen auf das Spleißen unter ansonsten optimalen Hefewachstumsbedingungen.

Das Spleißosom erkennt sein Substrat durch drei intronische Sequenzen, nämlich die 5′-Spleißstelle (5′ SS), die Zweigstelle (BS) und die 3′-Spleißstelle (3′ SS). Zahlreiche ACT1-CUP1-Reporter wurden an diesen Standorten generiert, die Nicht-Konsens-Sequenzen enthalten. Eine Auswahl der häufigsten ACT1-CUP1-Reporter ist in Abbildung 1 und Tabelle 1 dargestellt. Da das Spleißosom mit jeder Spleißstelle an verschiedenen Punkten des Spleißzyklus einzigartig interagiert, kann die Robustheit des Spleißosoms in verschiedenen Schritten getestet werden, je nachdem, welcher Nicht-Konsens-Reporter verwendet wird. Nicht-Konsens-Reporter werden nach der mutierten Position innerhalb des Introns und der Basis, zu der es mutiert wurde, benannt. Zum Beispiel ist A3c ein Reporter mit einer Mutation am 5′ SS, insbesondere Position 3 vom Konsensadenosin zu einem Cytosin. Dieser Reporter wird stark mit Spleißosomenmutationen interagieren, die die 5′-SS-Selektion und -Verwendung beeinflussen. In ihrer ersten Studie bestimmten Lesser und Guthrie, welche 5′-SS-Mutationen das Spleißen hemmten³. Später im selben Jahr wurden Nicht-Konsens-Reporter an allen drei Spleißstellen von Burgess und Guthrie in einem Suppressor-Screening von Mutationen in der ATPase Prp16p⁹ veröffentlicht. Der ACT1-CUP1-Assay war ein wichtiger Schlüssel zum Verständnis der Robustheit und Selektivität des Hefespleißosoms und zur Ableitung der Funktion der Spleißosomen anderer Eukaryoten.

Da ACT1-CUP1-Reporter ohne Konsens das Spleißosom für weitere Störungen sensibilisieren, kann der Einfluss einer einzelnen Spleißfaktormutation durch die Reporter charakterisiert werden, die sie positiv oder negativ beeinflusst. Dies wurde auf vielfältige Weise auf das Spleißen von Forschungsfragen angewendet. Erstens kann und wurde der ACT1-CUP1-Assay als genetischer Screen für Mutationen in Spleißfaktoren verwendet. So dient beispielsweise Prp8p, das größte Spleißprotein, als Plattform, auf der der RNA-Kern des Spleißosoms die Spleißreaktion katalysiert. Dies wurde zum Teil dadurch abgeleitet, wie Prp8p-Mutanten das Spleißen verschiedener ACT1-CUP1-Reporter verbesserten oder reduzierten 10,11,12,13,14,15,16,17. Andere Proteinkomponenten des Spleißosoms wurden ebenfalls mit ACT1-CUP1 untersucht, darunter Hsh155p, Cwc2p, Cef1p und Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. Die energetischen Schwellenwerte für Prp16p und vier weitere ATPasen, die am spleißeosomalen Übergang beteiligt sind, wurden ebenfalls mit diesem Assay 9,26,27,28,29,30 untersucht. Die kleinen nukleären RNAs (snRNAs) wurden ebenfalls umfassend unter Verwendung von ACT1-CUP1 untersucht, um die von ihnen koordinierten prä-mRNA-Sequenzen und die Veränderungen in der Sekundärstruktur der snRNAs während des Spleißens zu identifizieren 3,31,32,33,34,35,36,37.

Der ACT1-CUP1-Assay erfordert einen Hefestamm, bei dem alle Kopien des CUP1-Gens ausgeschaltet wurden. Da CUP1 eine hohe Exemplarzahl ^6,38 haben kann, kann die Vorbereitung eines vollständigen Knock-out-Stammes mehrere Runden oder ein umfangreiches Screening erfordern. Infolgedessen wurden Cup1Δ-Hefestämme oft zwischen Laboren geteilt, ebenso wie die Reporter.

Wenn Mutation(en) in einem Spleißfaktor anhand einer Plasmidkopie beurteilt werden, sollte das Wildtyp-Gen für diesen Faktor ausgeschaltet werden. Darüber hinaus sollte der Hefehintergrund die Auswahl von mindestens zwei Plasmiden ermöglichen, von denen eines einen ACT1-CUP1-Reporter enthält, das historisch auf einem Leucin-Nährstoffselektionsplasmid basiert, und eines, das eine Mutation oder Störung in der zu untersuchenden Spleißmaschinerie enthält (Abbildung 2). In der Regel testen in einem einzigen Assay mehrere Hefestämme, von denen jeder die QSP (Query Splicing Perturbation) trägt, und ein anderer Reporter die Auswirkungen der Abfrage auf das Spleißen.

Die unabhängigen Variablen im ACT1-CUP1-Assay ermöglichen es einem Forscher, den Schweregrad eines QSP zu beurteilen. Diese unabhängigen Variablen sind die Konzentration von Kupfer und die Auswahl mehrerer Nicht-Konsens-Spleißreporter. Erstens, da die Hefestämme auf Platten gezüchtet werden, die eine Reihe von Kupferkonzentrationen enthalten (Abbildung 2), beinhaltet die Erstellung des Assays die Auswahl des verwendeten Konzentrationsgradienten. Studien können einen Kupferkonzentrationsgradienten verwenden, um eine erste Anzeige der Lebensfähigkeit zu erhalten, und dann den Assay mit einem feineren Gradienten wiederholen, um subtile Rentabilitätsunterschiede zu identifizieren. Die zweite Variable ist die große Auswahl an ACT1-CUP1-Reportern, die getestet werden können (Abbildung 1 und Tabelle 1). Wenn der QSP die Lebensfähigkeit der Hefe in Gegenwart eines Nicht-Konsens-Reporters anders beeinflusst als der Wildtyp, kann der Schluss gezogen werden, dass der QSP einen Schritt beim Spleißen oder einen Bereich des Spleißosoms beeinflusst, der während der Erkennung oder Verarbeitung dieser Region des Introns wichtig ist.

Die Hefe-Toolbox ist umfangreich und der ACT1-CUP1-Assay ist ein integraler Bestandteil der Spleißforschung. Der ACT1-CUP1-Assay wird häufig zusammen mit einer eingehenderen genetischen, strukturellen und/oder biochemischen Analyse auf die Auswirkungen eines QSP durchgeführt. Da diese detaillierteren Studien in der Regel ein längeres Verfahren und/oder einen höheren Preis haben, ist ein häufiger Ansatz, zuerst mit ACT1-CUP1 nach interessanten Mutanten zu suchen.

Hier wird ein ACT1-CUP1-Assay-Protokoll einschließlich Kupferplattenvorbereitung bereitgestellt. Dieser Assay liefert den Forschern eine erste Antwort auf die Wirkung eines QSP auf das Spleißen und welche intronischen Regionen am stärksten von der Störung betroffen sind.