Les tests ACT1-CUP1 déterminent les sensibilités spécifiques au substrat des mutants splicéosomaux chez la levure bourgeonnante

Le spliceosome est une grande machine biologique qui catalyse l’élimination des introns, régions non codantes dans l’ARN messager précurseur (pré-ARNm)^1,2. Caractériser l’effet d’un mutant ponctuel unique dans 1 des près de 100 protéines et 5 ARN non codants est souvent ambigu lors de l’étude de la protéine ou de l’ARN isolément. Le changement dans la fonction du composant muté peut être mieux évalué in vivo dans le contexte du spliceosome complet et fonctionnel.

Le test de croissance du cuivre décrit ici est une mesure rapide de l’efficacité de l’épissage chez Saccharomyces cerevisiae ou levure bourgeonnante. Développé par C.F. Lesser et C. Guthrie et publié en 1993, ce test combine la facilité de travail avec un organisme modèle simple et la lecture directe de la viabilité cellulaire³. La viabilité est en corrélation avec la façon dont les splicéosomes dans ces cellules peuvent reconnaître et épisser la transcription du rapporteur.

Ce test de croissance du cuivre est plus communément appelé le test ACT1-CUP1. Le nom ACT1-CUP1 provient des deux gènes fusionnés pour créer un rapporteur d’efficacité d’épissage. ACT1 est le gène de l’actine de la levure, qui est fortement exprimé et a un intron efficacement épissé ^4,5. Cup1p est un chélateur du cuivre qui séquestre le cuivre dans la cellule pour éviter les interférences avec les fonctions cellulaires régulières ^6,7,8. Le rapporteur ACT1-CUP1 contient ces gènes dans l’ordre de telle sorte que CUP1 est dans le cadre de lecture approprié seulement si l’épissage pré-ARNm de l’intron d’ACT1 se produit (Figure 1). La protéine de fusion résultante contient les 21 premiers acides aminés de l’actine et la protéine Cup1p pleine longueur, ce qui augmente la viabilité de la levure dans un environnement riche en cuivre³. Ainsi, une augmentation de la quantité d’épissage du rapporteur entraîne une concentration plus élevée de Cup1p et une résistance au cuivre plus élevée (Figure 1). En comparaison avec d’autres gènes rapporteurs, CUP1 a un impact sur la viabilité cellulaire même à de faibles niveaux, a une large plage de sensibilité et peut être utilisé pour sélectionner directement pour l’épissage des mutations ^3,6,7. De plus, CUP1 n’est pas essentiel pour la croissance standard des levures, et donc l’homéostasie cellulaire n’est pas affectée lors de la configuration de ce test. Complémentaire aux tests de délétion ou de croissance en température, ACT1-CUP1 fournit des informations sur les effets sur l’épissage dans des conditions de croissance de levure par ailleurs optimales.

Le splicéosome reconnaît son substrat à travers trois séquences introniques, à savoir le site d’épissure 5′ (5′ SS), le site ramifié (BS) et le site d’épissure 3′ (3′ SS). De nombreux rapporteurs ACT1-CUP1 ont été générés contenant des séquences non consensuelles sur ces sites. Une sélection des rapporteurs ACT1-CUP1 les plus courants est présentée à la figure 1 et au tableau 1. Comme le splicéosome interagit avec chaque site d’épissure de manière unique à différents moments du cycle d’épissage, la robustesse du splicéosome peut être testée à différentes étapes en fonction du rapporteur non consensuel utilisé. Les rapporteurs non consensuels sont nommés pour la position mutée dans l’intron et la base sur laquelle il a été muté. Par exemple, A3c est un rapporteur avec une mutation au niveau du 5′ SS, en particulier la position 3 de l’adénosine consensuelle à une cytosine. Ce rapporteur interagira fortement avec les mutations des splicéosomes qui ont un impact sur la sélection et l’utilisation du 5′ SS. Dans leur étude initiale, Lesser et Guthrie ont déterminé quelles mutations 5′ SS inhibaient l’épissage³. Plus tard la même année, des rapporteurs non consensuels sur les trois sites d’épissage ont été publiés par Burgess et Guthrie dans un écran suppresseur de mutations dans l’ATPase Prp16p⁹. En comparant les rapporteurs de consensus à ceux qui ne le font pas, le test ACT1-CUP1 a été une clé importante pour comprendre la robustesse et la sélectivité du splicéosome de levure et pour déduire la fonction des splicéosomes d’autres eucaryotes.

Comme les rapporteurs ACT1-CUP1 non consensuels sensibilisent le spliceosome à une perturbation supplémentaire, l’impact d’une mutation du facteur d’épissage unique peut être caractérisé par les rapporteurs qu’elle impacte positivement ou négativement. Cela a été appliqué à l’épissage des questions de recherche de diverses façons. Tout d’abord, le test ACT1-CUP1 peut et a été utilisé comme criblage génétique des mutations dans les facteurs d’épissage. Par exemple, Prp8p, la plus grande protéine d’épissage, sert de plate-forme sur laquelle le noyau d’ARN du spliceosome catalyse la réaction d’épissage. Cela a été déduit, en partie, de la façon dont les mutants Prp8p ont amélioré ou réduit l’épissage de différents rapporteurs ACT1-CUP1 10,11,12,13,14,15,16,17. D’autres composants protéiques du spliceosome ont également été étudiés à l’aide d’ACT1-CUP1, notamment Hsh155p, Cwc2p, Cef1p et Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. Les seuils énergétiques de Prp16p et de quatre autres ATPases impliquées dans la transition splicéosomale ont également été étudiés avec ce test 9,26,27,28,29,30. Les petits ARN nucléaires (ARNsn) ont également été largement étudiés en utilisant ACT1-CUP1 pour identifier les séquences pré-ARNm qu’ils coordonnent et les changements dans la structure secondaire que les ARNn subissent pendant l’épissage 3,31,32,33,34,35,36,37.

Le test ACT1-CUP1 nécessite une souche de levure où toutes les copies du gène CUP1 ont été éliminées. Comme CUP1 peut avoir un numéro d’exemplaire élevé ^6,38, la préparation d’une souche knock-out complète peut nécessiter plusieurs tours ou un dépistage approfondi. En conséquence, les souches de levure cup1Δ ont souvent été partagées entre les laboratoires, tout comme les journalistes.

Si une ou plusieurs mutations d’un facteur d’épissage sont évaluées à partir d’une copie plasmidique, le gène de type sauvage de ce facteur doit être éliminé. De plus, le fond de levure devrait permettre la sélection d’au moins deux plasmides, l’un contenant un rapporteur ACT1-CUP1, historiquement sur un plasmide de sélection de nutriments leucine, et l’autre contenant une mutation ou une perturbation dans la machinerie d’épissage qui sera étudiée (Figure 2). Habituellement, dans un seul essai, plusieurs souches de levure, chacune portant la perturbation d’épissage de requête (QSP) et un rapporteur différent, testeront l’impact de la requête sur l’épissage.

Les variables indépendantes du test ACT1-CUP1 permettent à un chercheur d’évaluer la gravité d’un QSP. Ces variables indépendantes sont la concentration de cuivre et la sélection de plusieurs rapporteurs d’épissage non consensuels. Tout d’abord, comme les souches de levure sont cultivées sur des plaques contenant une gamme de concentrations de cuivre (Figure 2), la mise en place du test comprend la sélection du gradient de concentrations utilisé. Les études peuvent utiliser un gradient de concentration de cuivre pour obtenir une lecture initiale de la viabilité, puis répéter l’essai avec un gradient plus fin pour identifier les différences subtiles de viabilité. La deuxième variable est la large gamme de rapporteurs ACT1-CUP1 qu’il est possible de tester (Figure 1 et Tableau 1). Si le QSP a un impact différent sur la viabilité de la levure en présence d’un rapporteur non consensuel par rapport à un type sauvage, on peut conclure que le QSP affecte une étape de l’épissage ou une région du spliceosome importante lors de la reconnaissance ou du traitement de cette région de l’intron.

La boîte à outils de levure est vaste et le test ACT1-CUP1 fait partie intégrante de la recherche sur l’épissage. Le test ACT1-CUP1 est souvent réalisé parallèlement à une analyse génétique, structurelle et/ou biochimique plus approfondie sur l’impact d’un QSP. Comme ces études plus détaillées ont généralement une procédure plus longue et / ou un prix plus élevé, une approche fréquente consiste à rechercher d’abord des mutants intéressants avec ACT1-CUP1.

Fourni ici est un protocole de dosage ACT1-CUP1, y compris la préparation sur plaque de cuivre. Ce test fournit aux chercheurs une réponse initiale à l’effet d’un QSP sur l’épissage et quelles régions introniques sont les plus touchées par la perturbation.