JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

تحدد فحوصات ACT1-CUP1 الحساسيات الخاصة بالركيزة للمتحولات spliceosomal في الخميرة الناشئة

Published: June 30, 2022
doi:
10.3791/63232
1College of Arts and Sciences,Northwest University

Summary

يوفر اختبار ACT1-CUP1 ، وهو فحص نمو النحاس ، قراءة سريعة لربط الحمض النووي الريبي رسول السلائف (pre-mRNA) وتأثير عوامل الربط الطافرة على وظيفة spliceosomal. توفر هذه الدراسة بروتوكولا وتسلط الضوء على التخصيص الممكن لمعالجة مسألة الربط ذات الأهمية.

Abstract

ساهمت الطفرات التي أدخلت في spliceosome أو ركيزته بشكل كبير في فهمنا لتعقيدات وظيفة spliceosomal. سواء كانت مرتبطة بالمرض أو مختارة وظيفيا ، فقد تمت دراسة العديد من هذه الطفرات باستخدام مقايسات النمو في الكائن الحي النموذجي Saccharomyces cerevisiae (الخميرة). يوفر مقايسة نمو النحاس الخاصة بالربط ، أو مقايسة ACT1-CUP1 ، تحليلا شاملا للطفرة على مستوى النمط الظاهري. يستخدم اختبار ACT1-CUP1 المراسلين الذين يمنحون تحمل النحاس عند تقطيعه بشكل صحيح. وهكذا ، في وجود النحاس ، ترتبط التغيرات في صلاحية الخميرة بالتغيرات في إنتاج mRNA من خلال الربط. في تجربة نموذجية ، يتم تحدي spliceosome الخميرة مع مراسلي الربط غير التوافقيين المختلفين وطفرة عامل الربط ذات الأهمية للكشف عن أي تأثير تآزري أو مضاد على الربط. هنا يتم تقديم وصف كامل لإعداد الألواح النحاسية ، وطلاء خلايا الخميرة ، وتقييم البيانات. يتم وصف مجموعة مختارة من التجارب المجانية ، مع تسليط الضوء على تنوع مراسلي ACT1-CUP1. يعد اختبار ACT1-CUP1 أداة مفيدة في صندوق أدوات الربط بفضل القراءة المباشرة للتأثير (التأثيرات) الطفرية والإمكانيات النسبية من الاستخدام المستمر في هذا المجال.

Introduction

ال spliceosome هو آلة بيولوجية كبيرة تحفز إزالة الإنترونات ، المناطق غير المشفرة في الحمض النووي الريبي رسول السلائف (pre-mRNA)1,2. غالبا ما يكون توصيف تأثير طفرة نقطة واحدة في 1 من ما يقرب من 100 بروتين و 5 RNAs غير مشفرة غامضا عند دراسة البروتين أو الحمض النووي الريبي بمعزل عن غيره. يمكن تقييم التغيير في وظيفة المكون المتحور بشكل أفضل في الجسم الحي في سياق spliceosome الكامل والفعال.

مقايسة نمو النحاس الموصوفة هنا هي مقياس سريع لكفاءة الربط في Saccharomyces cerevisiae أو الخميرة الناشئة. تم تطوير هذا الفحص بواسطة C.F. Lesser و C. Guthrie ونشر في عام 1993 ، ويجمع بين سهولة العمل مع كائن نموذجي بسيط والقراءة المباشرة لصلاحية الخلية3. ترتبط الجدوى بمدى قدرة spliceosomes في هذه الخلايا على التعرف على نص المراسل ولصقه.

يطلق على مقايسة نمو النحاس هذه بشكل أكثر شيوعا مقايسة ACT1-CUP1. ينشأ اسم ACT1-CUP1 من الجينين المندمجين لإنشاء مراسل لكفاءة الربط. ACT1 هو جين الأكتين في الخميرة ، والذي يتم التعبير عنه بشكل كبير ويحتوي على إنترونمقسم بكفاءة 4,5. Cup1p هو مخلب نحاسي يعزل النحاس في الخلية لمنع التداخل مع الوظائف الخلوية العادية6،7،8. يحتوي مراسل ACT1-CUP1 على هذه الجينات بالتسلسل بحيث يكون CUP1 في إطار القراءة المناسب فقط في حالة حدوث الربط قبل mRNA لإنترون ACT1 (الشكل 1). يحتوي بروتين الاندماج الناتج على أول 21 حمضا أمينيا من الأكتين وبروتين Cup1p كامل الطول ، مما يزيد من صلاحية الخميرة في بيئة غنية بالنحاس3. وبالتالي ، فإن الزيادة في كمية الربط للمراسل تؤدي إلى تركيز أعلى من Cup1p ومقاومة أعلى للنحاس (الشكل 1). بالمقارنة مع جينات المراسل الأخرى ، يؤثر CUP1 على بقاء الخلية حتى عند المستويات المنخفضة ، وله نطاق حساسية واسع ، ويمكن استخدامه للاختيار المباشر لطفرات الربط3،6،7. بالإضافة إلى ذلك ، CUP1 غير ضروري لنمو الخميرة القياسي ، وبالتالي لا يتأثر التوازن الخلوي أثناء الإعداد لهذا الفحص. مكملا لمقايسات الحذف أو نمو درجة الحرارة ، يوفر ACT1-CUP1 معلومات حول التأثيرات على الربط في ظل ظروف نمو الخميرة المثلى.

يتعرف spliceosome على ركيزته من خلال ثلاثة تسلسلات intronic ، وهي موقع لصق 5 ‘(5’ SS) ، وموقع الفرع (BS) ، وموقع لصق 3 ‘(3’ SS). تم إنشاء العديد من مراسلي ACT1-CUP1 الذين يحتويون على تسلسلات غير توافقية في هذه المواقع. يتم عرض مجموعة مختارة من مراسلي ACT1-CUP1 الأكثر شيوعا في الشكل 1 والجدول 1. نظرا لأن spliceosome يتفاعل مع كل موقع لصق بشكل فريد في نقاط مختلفة في دورة الربط ، يمكن اختبار متانة spliceosome في خطوات مختلفة بناء على استخدام المراسل غير الإجماعي. يتم تسمية المراسلين غير التوافقيين على الموقع المتحور داخل intron والقاعدة التي تم تحويرها إليها. على سبيل المثال ، A3c هو مراسل لديه طفرة في 5 ‘SS ، وتحديدا الموضع 3 من الأدينوزين بالإجماع إلى السيتوزين. سيتفاعل هذا المراسل بقوة مع طفرات spliceosome التي تؤثر على اختيار واستخدام SS 5 ‘. في دراستهم الأولية ، حدد Lesser و Guthrie أي طفرات SS 5 ‘تمنع الربط3. في وقت لاحق من نفس العام ، تم نشر مراسلين غير متفقين عليهم في جميع مواقع لصق الثلاثة بواسطة Burgess و Guthrie في شاشة مثبطة للطفرات في ATPase Prp16p9. بمقارنة الإجماع مع المراسلين غير التوافقيين ، كان اختبار ACT1-CUP1 مفتاحا مهما لفهم متانة وانتقائية spliceosome الخميرة واستنتاج وظيفة spliceosomes حقيقيات النوى الأخرى.

نظرا لأن مراسلي ACT1-CUP1 غير المتفق عليهم يقومون بتوعية الجسيم لمزيد من الاضطراب ، يمكن وصف تأثير طفرة عامل الربط الفردي من خلال المراسلين الذين يؤثر عليهم بشكل إيجابي أو سلبي. تم تطبيق هذا على ربط أسئلة البحث بعدة طرق. أولا ، يمكن استخدام اختبار ACT1-CUP1 كفحص جيني للطفرات في عوامل الربط. على سبيل المثال ، يعمل Prp8p ، أكبر بروتين ربط ، كمنصة يحفز عليها قلب الحمض النووي الريبي ل spliceosome تفاعل الربط. تم استنتاج ذلك ، جزئيا ، من خلال كيفية تحسين أو تقليل طفرات Prp8p من الربط بين مراسلي ACT1-CUP1 المختلفين10،11،12،13،14،15،16،17. كما تم فحص مكونات البروتين الأخرى من spliceosome باستخدام ACT1-CUP1 ، بما في ذلك Hsh155p و Cwc2p و Cef1p و Ecm2p18،19،20،21،22،23،24،25. كما تمت دراسة العتبات النشطة ل Prp16p وأربعة ATPases أخرى تشارك في الانتقال spliceosomal مع هذا الفحص9،26،27،28،29،30. كما تمت دراسة الحمض النووي الريبي الصغير (snRNAs) على نطاق واسع باستخدام ACT1-CUP1 لتحديد تسلسلات ما قبل mRNA التي تنسقها والتغيرات في البنية الثانوية التي تمر بها snRNAs أثناء الربط3،31،32،33،34،35،36،37.

يتطلب اختبار ACT1-CUP1 سلالة خميرة حيث تم التخلص من جميع نسخ جين CUP1. نظرا لأن CUP1 يمكن أن يكون له رقم نسخة مرتفع 6,38 ، فإن التحضير لسلالة خروج المغلوب الكاملة يمكن أن يتطلب جولات متعددة أو فحصا مكثفا. نتيجة لذلك ، غالبا ما يتم مشاركة سلالات خميرة cup1Δ بين المختبرات ، كما فعل الصحفيون.

إذا تم تقييم الطفرة (الطفرات) في عامل الربط من نسخة بلازميد ، فيجب التخلص من الجين من النوع البري لهذا العامل. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تسمح خلفية الخميرة باختيار اثنين على الأقل من البلازميدات ، أحدهما يحتوي على مراسل ACT1-CUP1 ، تاريخيا على بلازميد اختيار المغذيات الليوسين ، والآخر يحتوي على طفرة أو اضطراب في آلية الربط التي ستتم دراستها (الشكل 2). عادة ، في فحص واحد ، ستختبر سلالات الخميرة المتعددة ، كل منها يحمل اضطراب ربط الاستعلام (QSP) ومراسل مختلف ، تأثير الاستعلام على الربط.

تسمح المتغيرات المستقلة في اختبار ACT1-CUP1 للباحث بتقييم شدة QSP. هذه المتغيرات المستقلة هي تركيز النحاس واختيار العديد من مراسلي الربط غير المتفق عليهم. أولا ، نظرا لأن سلالات الخميرة تزرع على ألواح تحتوي على مجموعة من تركيزات النحاس (الشكل 2) ، فإن إعداد الفحص يتضمن اختيار تدرج التركيزات المستخدمة. يمكن للدراسات استخدام تدرج تركيز النحاس للدورة للحصول على قراءة أولية للجدوى ثم تكرار الفحص بتدرج أدق لتحديد الاختلافات الدقيقة في الجدوى. المتغير الثاني هو النطاق الواسع لمراسلي ACT1-CUP1 الذين يمكن اختبارهم (الشكل 1 والجدول 1). إذا كان QSP يؤثر على صلاحية الخميرة بشكل مختلف في وجود مراسل غير توافقي مقابل النوع البري ، فيمكن التوصل إلى استنتاج مفاده أن QSP يؤثر على خطوة في الربط أو منطقة من spliceosome مهمة أثناء التعرف على أو معالجة تلك المنطقة من الإنترون.

صندوق أدوات الخميرة واسع النطاق ، واختبار ACT1-CUP1 هو جزء لا يتجزأ من أبحاث الربط. غالبا ما يتم إجراء اختبار ACT1-CUP1 جنبا إلى جنب مع تحليل جيني وهيكلي و / أو كيميائي حيوي أكثر تعمقا حول تأثير QSP. نظرا لأن هذه الدراسات الأكثر تفصيلا لها عموما إجراء أطول و / أو سعر أعلى ، فإن النهج المتكرر هو فحص المسوخ المثيرة للاهتمام باستخدام ACT1-CUP1 أولا.

يتم توفيره هنا بروتوكول فحص ACT1-CUP1 ، بما في ذلك تحضير الألواح النحاسية. يوفر هذا الفحص للباحثين إجابة أولية لتأثير QSP على الربط والمناطق الداخلية الأكثر تأثرا بالاضطراب.

Protocol

1. بناء سلالة الخميرة توليد أو الحصول على سلالة S. cerevisiae التي تشمل خلفيتها leu2 و cup1Δ. لتوليد هذه الخلفية ، استخدم طريقة الخميرة الراسخة التي تستخدم أسيتات الليثيوم والحمض النووي39 الذي تقطعت به السبل.ملاحظة: قد تحتوي سلالات الخميرة أحادية الصيغة ال…

Representative Results

تتطلب فحوصات النمو ، مثل ACT1-CUP1 ، تقييما بصريا ومقارنا لمستعمرات متعددة. هنا ، نمت كل سلالة إلى التشبع بين عشية وضحاها ، وتم تخفيفها إلى OD600 من 0.5 ، ومطلية على 20 لوحة تحتوي على مجموعة من تركيزات النحاس من 0 mM إلى 1.1 mM CuSO4 (الشكل 3). هذا النطاق أصغر من النطاق المدرج في ال?…

Discussion

ACT1-CUP1 هو اختبار نمو ، ويجب توخي الحذر للتأكد من أن اختلافات النمو الملحوظة لا يمكن أن تعزى إلا إلى عيوب الربط. يجب التعامل مع جميع السلالات بطريقة مماثلة قبل الطلاء ، بما في ذلك وجود نفس الطول والنوع من ظروف النمو والتخزين. في حالة استخدام سلالات حساسة لدرجة الحرارة ، يجب إجراء فحوصات ACT1-CUP1 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

شكرا لآرون هوسكينز وأعضاء مختبر هوسكينز في جامعة ويسكونسن ماديسون لاستخدام سلالات الخميرة والمعدات في توليد الأشكال 3-5. شكرا لهاربريت كور وشينغيانغ فو على تعليقاتهما الثاقبة على المخطوطة. شكرا للطلاب والموظفين وأعضاء هيئة التدريس الداعمين في جامعة نورث ويست أثناء كتابة هذه الورقة وتحريرها وتصويرها. شكرا لإيزابيل ماراسيغان للمساعدة في تصوير هذه الطريقة.

Materials

1.5 mL sterile microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129 Or comparable item from a different manufacturer.
2 mL sterile microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-138 Or comparable item from a different manufacturer.
50 mL sterile centrifuge tubes Fisher Scientific 07-201-332 Or comparable item from a different manufacturer.
96-well round bottom microplate Fisher Scientific 07-200-760 Or comparable item from a different manufacturer.
190 proof ethanol Fisher Scientific 22-032-600 Or comparable item from a different manufacturer.
500 mL Filter System (0.22 µm) CellTreat Scientific Products 229707 Or comparable item from a different manufacturer.
Agar Fisher Scientific BP1423-500 Any molecular grade agar will work.
Autoclave Tuttnauer 3870EA Or comparable item from a different manufacturer.
Bunsen burner Humboldt PN6200.1 Or comparable item from a different manufacturer.
Cell Density Meter VWR 490005-906 Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm.
Copper sulfate Pentahydrate Fisher Scientific LC134051 Or comparable item from a different manufacturer.
Digital imaging system Cytiva 29399481 ImageQuant 4000 (used for Figure 3),  Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer.
Dropout mix (-Leu) USBiological Life Sciences D9525 Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu
D-Glucose Fisher Scientific AAA1682836 Or comparable item from a different manufacturer.
Gel band quantifying software Cytiva 29-0006-05 ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer.
Hand held camera Nikon D3500 Or comparable item from a different manufacturer.
Near infra-red gel imaging device Cytiva 29238583 Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade clamp Fisher Scientific 05-769-7Q Or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade stand and clamp Fisher Scientific 12-000-101 Or comparable item from a different manufacturer.
Magnetic stir bars Fisher Scientific 14-513-51 Or comparable item from a different manufacturer.
Pin replicator VP Scientific VP 407AH
Semi-micro disposable cuvettes VWR 97000-590 Or comparable item from a different manufacturer.
Shaker JEIO Tech IST-3075 Or comparable item from a different manufacturer.
Spectrophotometer Biowave 80-3000-45 Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm.
Square plates VWR 102091-156 Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator.
Stir plate Fisher Scientific 11-520-16S Or comparable item from a different manufacturer.
Yeast nitrogen base USBiological Life Sciences Y2025 Or comparable item from a different manufacturer.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wahl, M. C., Will, C. L., Luhrmann, R. The spliceosome: Design principles of a dynamic RNP machine. Cell. 136 (4), 701-718 (2009).
  2. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  3. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutational analysis of pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae using a sensitive new reporter gene, CUP1. Genetics. 133 (4), 851-863 (1993).
  4. Ng, R., Abelson, J. Isolation and sequence of the gene for actin in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (7), 3912-3916 (1980).
  5. Gallwitz, D., Sures, I. Structure of a split yeast gene: Complete nucleotide sequence of the actin gene in I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (5), 2546-2550 (1980).
  6. Fogel, S., Welch, J. W., Cathala, G., Karin, M. Gene amplification in yeast: CUP1 copy number regulates copper resistance. Current Genetics. 7 (5), 347-355 (1983).
  7. Hamer, D. H., Thiele, D. J., Lemontt, J. E. Function and autoregulation of yeast copperthionein. Science. 228 (4700), 685-690 (1985).
  8. Winge, D. R., Nielson, K. B., Gray, W. R., Hamer, D. H. Yeast metallothionein. Sequence and metal-binding properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14464-14470 (1985).
  9. Burgess, S. M., Guthrie, C. A mechanism to enhance mRNA splicing fidelity: The RNA-dependent ATPase Prp16 governs usage of a discard pathway for aberrant lariat intermediates. Cell. 73 (7), 1377-1391 (1993).
  10. Collins, C. A., Guthrie, C. Allele-specific genetic interactions between Prp8 and RNA active site residues suggest a function for Prp8 at the catalytic core of the spliceosome. Genes & Development. 13 (15), 1970-1982 (1999).
  11. Siatecka, M., Reyes, J. L., Konarska, M. M. Functional interactions of Prp8 with both splice sites at the spliceosomal catalytic center. Genes & Development. 13 (15), 1983-1993 (1999).
  12. Umen, J. G., Guthrie, C. Mutagenesis of the yeast gene PRP8 reveals domains governing the specificity and fidelity of 3′ splice site selection. Genetics. 143 (2), 723-739 (1996).
  13. Grainger, R. J., Beggs, J. D. Prp8 protein: At the heart of the spliceosome. RNA. 11 (5), 533-557 (2005).
  14. Query, C. C., Konarska, M. M. Suppression of multiple substrate mutations by spliceosomal prp8 alleles suggests functional correlations with ribosomal ambiguity mutants. Molecular Cell. 14 (3), 343-354 (2004).
  15. Konarska, M. M., Vilardell, J., Query, C. C. Repositioning of the reaction intermediate within the catalytic center of the spliceosome. Molecular Cell. 21 (4), 543-553 (2006).
  16. Liu, L., Query, C. C., Konarska, M. M. Opposing classes of prp8 alleles modulate the transition between the catalytic steps of pre-mRNA splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (6), 519-526 (2007).
  17. MacRae, A. J., et al. Prp8 positioning of U5 snRNA is linked to 5′ splice site recognition. RNA. 24 (6), 769-777 (2018).
  18. Query, C. C., Konarska, M. M. CEF1/CDC5 alleles modulate transitions between catalytic conformations of the spliceosome. RNA. 18 (5), 1001-1013 (2012).
  19. Tang, Q., et al. SF3B1/Hsh155 HEAT motif mutations affect interaction with the spliceosomal ATPase Prp5, resulting in altered branch site selectivity in pre-mRNA splicing. Genes & Development. 30 (24), 2710-2723 (2016).
  20. Carrocci, T. J., Zoerner, D. M., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. SF3b1 mutations associated with myelodysplastic syndromes alter the fidelity of branchsite selection in yeast. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4837-4852 (2017).
  21. Kaur, H., Groubert, B., Paulson, J. C., McMillan, S., Hoskins, A. A. Impact of cancer-associated mutations in Hsh155/SF3b1 HEAT repeats 9-12 on pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 15 (4), 0229315 (2020).
  22. vander Feltz, C., et al. Saccharomyces cerevisiae Ecm2 modulates the catalytic steps of pre-mRNA splicing. RNA. 27 (5), 591-603 (2021).
  23. Carrocci, T. J., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. Functional analysis of Hsh155/SF3b1 interactions with the U2 snRNA/branch site duplex. RNA. 24 (8), 1028-1040 (2018).
  24. Hogg, R., de Almeida, R. A., Ruckshanthi, J. P., O’Keefe, R. T. Remodeling of U2-U6 snRNA helix I during pre-mRNA splicing by Prp16 and the NineTeen Complex protein Cwc2. Nucleic Acids Research. 42 (12), 8008-8023 (2014).
  25. Hansen, S. R., Nikolai, B. J., Spreacker, P. J., Carrocci, T. J., Hoskins, A. A. Chemical inhibition of pre-mRNA splicing in living Saccharomyces cerevisiae. Cell Chemical Biology. 26 (3), 443-448 (2019).
  26. Xu, Y. Z., Query, C. C. Competition between the ATPase Prp5 and branch region-U2 snRNA pairing modulates the fidelity of spliceosome assembly. Molecular Cell. 28 (5), 838-849 (2007).
  27. Staley, J. P., Guthrie, C. An RNA switch at the 5′ splice site requires ATP and the DEAD box protein Prp28p. Molecular Cell. 3 (1), 55-64 (1999).
  28. Bousquet-Antonelli, C., Presutti, C., Tollervey, D. Identification of a regulated pathway for nuclear pre-mRNA turnover. Cell. 102 (6), 765-775 (2000).
  29. Villa, T., Guthrie, C. The Isy1p component of the NineTeen complex interacts with the ATPase Prp16p to regulate the fidelity of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 19 (16), 1894-1904 (2005).
  30. Mayas, R. M., Maita, H., Staley, J. P. Exon ligation is proofread by the DExD/H-box ATPase Prp22p. Nature Structure and Molecular Biology. 13 (6), 482-490 (2006).
  31. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutations in U6 snRNA that alter splice site specificity: Implications for the active site. Science. 262 (5142), 1982-1988 (1993).
  32. McPheeters, D. S. Interactions of the yeast U6 RNA with the pre-mRNA branch site. RNA. 2 (11), 1110-1123 (1996).
  33. Perriman, R. J., Ares, M. Rearrangement of competing U2 RNA helices within the spliceosome promotes multiple steps in splicing. Genes & Development. 21 (7), 811-820 (2007).
  34. Mefford, M. A., Staley, J. P. Evidence that U2/U6 helix I promotes both catalytic steps of pre-mRNA splicing and rearranges in between these steps. RNA. 15 (7), 1386-1397 (2009).
  35. Hilliker, A. K., Mefford, M. A., Staley, J. P. U2 toggles iteratively between the stem IIa and stem IIc conformations to promote pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (7), 821-834 (2007).
  36. Wu, G., et al. Pseudouridines in U2 snRNA stimulate the ATPase activity of Prp5 during spliceosome assembly. EMBO Journal. 35 (6), 654-667 (2016).
  37. Crotti, L. B., Bacikova, D., Horowitz, D. S. The Prp18 protein stabilizes the interaction of both exons with the U5 snRNA during the second step of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (10), 1204-1216 (2007).
  38. Fogel, S., Welch, J. W. Tandem gene amplification mediates copper resistance in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5342-5346 (1982).
  39. Gardner, J. M., Jaspersen, S. L. Manipulating the yeast genome: Deletion, mutation, and tagging by PCR. Methods Molecular Biology. 1205, 45-78 (2014).
  40. JoVE. Yeast Transformation and Cloning. In Biology I: yeast, Drosophila and C. Elegant. JoVE Science Education Database. , (2021).
  41. Gietz, R. D., Woods, R. A. Yeast transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods Molecular Biology. 313, 107-120 (2006).
  42. Gietz, R. D., Woods, R. A. Genetic transformation of yeast. Biotechniques. 30 (4), 816 (2001).
  43. Mayerle, M., et al. Structural toggle in the RNaseH domain of Prp8 helps balance splicing fidelity and catalytic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4739-4744 (2017).
  44. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  45. Beier, D. H., et al. Dynamics of the DEAD-box ATPase Prp5 RecA-like domains provide a conformational switch during spliceosome assembly. Nucleic Acids Research. 47 (20), 10842-10851 (2019).
  46. vander Feltz, C., DeHaven, A. C., Hoskins, A. A. Stress-induced pseudouridylation alters the structural equilibrium of yeast U2 snRNA Stem II. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 524-536 (2018).
  47. Rodgers, M. L., Didychuk, A. L., Butcher, S. E., Brow, D. A., Hoskins, A. A. A multi-step model for facilitated unwinding of the yeast U4/U6 RNA duplex. Nucleic Acids Research. 44 (22), 10912-10928 (2016).
  48. Stutz, F., Rosbash, M. A functional interaction between Rev and yeast pre-mRNA is related to splicing complex formation. EMBO Journal. 13 (17), 4096-4104 (1994).
  49. Libri, D., Lescure, A., Rosbash, M. Splicing enhancement in the yeast rp51b intron. RNA. 6 (3), 352-368 (2000).
  50. Libri, D., Stutz, F., McCarthy, T., Rosbash, M. RNA structural patterns and splicing: Molecular basis for an RNA-based enhancer. RNA. 1 (4), 425-436 (1995).
  51. Howe, K. J., Kane, C. M., Ares, M. Perturbation of transcription elongation influences the fidelity of internal exon inclusion in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 9 (8), 993-1006 (2003).
  52. Cuenca-Bono, B., et al. SUS1 introns are required for efficient mRNA nuclear export in yeast. Nucleic Acids Research. 39 (19), 8599-8611 (2011).
  53. Scherrer, F. W., Spingola, M. A subset of Mer1p-dependent introns requires Bud13p for splicing activation and nuclear retention. RNA. 12 (7), 1361-1372 (2006).
  54. Hálová, M., et al. Nineteen complex-related factor Prp45 is required for the early stages of cotranscriptional spliceosome assembly. RNA. 23 (10), 1512-1524 (2017).
  55. Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3′ splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
  56. Crotti, L. B., Horowitz, D. S. Exon sequences at the splice junctions affect splicing fidelity and alternative splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 18954-18959 (2009).
  57. Perriman, R., Ares, M. Invariant U2 snRNA nucleotides form a stem loop to recognize the intron early in splicing. Molecular Cell. 38 (3), 416-427 (2010).

Tags

ACT1-CUP1 AssayPre-messenger RNA SplicingSplicing Factor MutationGrowth PhenotypeLeucine Dropout Growth MediaCopper SulfateOptical DensitySpectrophotometerDilutionBunsen BurnerReplicator

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
van der Feltz, C. ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (184), e63232, doi:10.3791/63232 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image