JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Kağıt Tabanlı Toehold Anahtarı Tanılamanın Geliştirilmesi ve Hasta Doğrulaması için Tasarımdan Uygulamaya Çalışma

Published: June 17, 2022
doi:
10.3791/63223
, , , , , , , , , , ,
1Leslie Dan Faculty of Pharmacy,University of Toronto, 2Laboratory of Virology and Experimental Therapy (LAVITE), Department of Virology, Aggeu Magalhães Institute (IAM),Oswaldo Cruz Foundation (Fiocruz), 3Department of Biomedical Engineering,Boston University, 4Molecular Biology, Cell Biology & Biochemistry Program, Graduate School of Arts and Sciences,Boston University, 5Department of Mechanical and Industrial Engineering,University of Toronto

Summary

Merkezi olmayan testler için topluluğa dağıtılabilecek merkezi olmayan, düşük maliyetli ve yüksek kapasiteli tanılamaya erişim, küresel sağlık krizleriyle mücadelede kritik öneme sahiptir. Bu makale, taşınabilir bir optik okuyucu ile tespit edilebilen viral RNA dizileri için kağıt tabanlı teşhislerin nasıl oluşturulacağını açıklamaktadır.

Abstract

Test için topluma dağıtılabilecek düşük yüklü moleküler teşhislere erişim giderek daha önemli hale gelmekte ve toplumların refahı ve ekonomik istikrar için anlamlı daha geniş etkilere sahiptir. Son yıllarda, hızlı, düşük maliyetli moleküler teşhis ihtiyacını karşılamak için birkaç yeni izotermal tanı yönteminin ortaya çıktığı görülmüştür. Bu çabaya, altın standart ters transkripsiyon-kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) tabanlı testlerle karşılaştırılabilir performans sağlayan sivrisinek kaynaklı Zika ve chikungunya virüsleri için teşhis de dahil olmak üzere, ayak parmağı anahtarı tabanlı teşhislerin geliştirilmesi ve hasta doğrulaması yoluyla katkıda bulunduk. Bu tanılamaların geliştirilmesi ve üretilmesi ucuzdur ve düşük kaynaklı ortamlara tanılama kapasitesi sağlama potansiyeline sahiptir. Burada protokol, Zika virüsü tespiti için anahtar tabanlı bir tahlilin geliştirilmesi için gerekli tüm adımları sağlar. Makale, okuyucuları aşamalı tanısal geliştirme sürecinden geçirir. İlk olarak, Zika virüsünün genomik dizileri, açık kaynaklı yazılım kullanarak aday anahtarların hesaplamalı tasarımı için girdiler olarak hizmet eder. Daha sonra, sentetik RNA dizileri ile ampirik tarama için sensörlerin montajı ve teşhis duyarlılığının optimizasyonu gösterilmiştir. Doğrulama tamamlandıktan sonra, RT-qPCR’ye paralel olarak hasta numuneleri ve amaca yönelik bir optik okuyucu olan PLUM ile gerçekleştirilir. Bu çalışma, araştırmacılara insan sağlığı, tarım ve çevresel izleme uygulamaları için düşük maliyetli ayak parmağı anahtarı tabanlı sensörlerin geliştirilmesi için teknik bir yol haritası sunmaktadır.

Introduction

RT-qPCR, mükemmel duyarlılığı ve özgüllüğü nedeniyle klinik teşhis için altın standart teknoloji olmaya devam etmiştir. Son derece sağlam olmasına rağmen, yöntem sıcaklık kontrollü dağıtım ve depolama gerektiren pahalı, özel ekipman ve reaktiflere bağlıdır. Bu, özellikle hastalık salgınları zamanlarında ve iyi donanımlı laboratuvarlara erişiminsınırlı olduğu bölgelerde 1,2 küresel olarak kaliteli teşhisin erişilebilirliğinin önünde önemli engeller sunmaktadır. Bu, Brezilya’daki 2015/2016 Zika virüsü salgını sırasında gözlendi. RT-qPCR testi sağlamak için yalnızca beş merkezi laboratuvar bulunduğundan, tanılamaya erişimi sınırlayan önemli darboğazlar ortaya çıktı. Bu, özellikle salgından daha ciddi şekilde etkilenen kentsel ortamlardaki bireyler için zorlayıcıydı 3,4. Tanılamaya erişimi iyileştirmek amacıyla protokol, düşük kaynak ayarlarında merkezi olmayan, düşük maliyetli ve yüksek kapasiteli tanılama sağlama potansiyeli ile geliştirilmiş bir platform göstermektedir. Bunun bir parçası olarak, izotermal amplifikasyon ve sentetik RNA anahtar tabanlı sensörleri kağıt tabanlı hücresiz ekspresyon sistemleri ile birleştiren bir teşhis keşif boru hattı kuruldu 5,6.

Hücresiz protein sentezi (CFPS) sistemleri, özellikle E. coli bazlı hücresiz sistemler, çevresel izleme 7,8’den patojen teşhisine kadar çok çeşitli biyo-algılama uygulamaları için çekici bir platformdur 5,6,9,10,11,12 . Transkripsiyon ve translasyon için gerekli bileşenleri içeren CFPS sistemleri, tüm hücre biyosensörlerine göre önemli avantajlara sahiptir. Spesifik olarak, algılama bir hücre duvarı ile sınırlı değildir ve genel olarak, tasarımda modülerdir, biyogüvenli, ucuzdur ve taşınabilir kullanım için dondurularak kurutulabilir. Gen devresi tabanlı reaksiyonları kağıt veya tekstil gibi substratlara dondurma-kurutma yeteneği, taşıma, oda sıcaklığında uzun süreli depolama5 ve hatta giyilebilir teknolojiye dahil edilmesini sağlar13.

Önceki çalışmalar, E. coli hücresiz sistemlerin, cıva gibi toksik metaller, tetrasiklin 7,14 gibi antibiyotikler, endokrin bozucu kimyasallar 15,16, hippurik asit 17 gibi biyobelirteçler, patojenle ilişkili çekirdek algılama molekülleri 9,18 ve kokain17 gibi yasadışı maddeler ve gama hidroksibutirat (GHB)19 gibi yasadışı maddeler gibi çok sayıda analiti tespit etmek için kullanılabileceğini göstermiştir. . Nükleik asitlerin diziye özgü tespiti için, stratejiler çoğunlukla izotermal amplifikasyon tekniklerine bağlı anahtar tabanlı biyosensörlerin kullanımına dayanmaktadır. Toehold anahtarları, ribozomal bağlanma bölgesini (RBS) ve başlangıç kodonunu ayırarak aşağı akış çevirisini engelleyen bir saç tokası yapısı içeren sentetik riborgülatörlerdir (metnin geri kalanında basitçe ‘anahtarlar’ olarak da adlandırılır). Hedef tetikleyici RNA’ları ile etkileşime girdikten sonra, saç tokası yapısı rahatlar ve daha sonra bir muhabir açık okuma çerçevesinin çevirisi sağlanır20.

İzotermal amplifikasyon moleküler tanı21 olarak da kullanılabilir; Bununla birlikte, bu yöntemler spesifik olmayan amplifikasyona eğilimlidir, bu da özgüllüğü ve dolayısıyla testin doğruluğunu RT-qPCR 22’nin altına düşürebilir. Burada bildirilen çalışmada, anahtar tabanlı sensörlerin yukarı akış izotermal amplifikasyonu, nükleik asitlerin (femtomolar ila attomolar) klinik olarak ilgili tespitini sağlayan kombine sinyal amplifikasyonu sağlamak için kullanılmıştır. İki yöntemin bu eşleşmesi, kombinasyon halinde, yüksek düzeyde özgüllük sağlayan iki diziye özgü kontrol noktası da sağlar. Bu yaklaşımı kullanarak, önceki çalışmalar Zika6, Ebola5, Norovirüs 10 gibi virüslerin yanı sıra C. difficile23 ve antibiyotiğe dirençli Tifo12 gibi patojenik bakterilerin tespitini göstermiştir. Son zamanlarda, COVID-19 pandemisi için erişilebilir teşhis sağlama çabalarında SARS-CoV-2 tespiti için hücresiz ayak parmağı anahtarları gösterilmiştir11,12,13.

Aşağıdaki protokol, in silico biyosensör tasarımından montaj ve optimizasyon adımlarına, hasta örnekleriyle saha doğrulamasına kadar Zika virüsü tespiti için hücresiz, kağıt bazlı sentetik ayak parmağı anahtar testinin geliştirilmesini ve doğrulanmasını özetlemektedir. Protokol, RNA ayak parmağı anahtar tabanlı sensörlerin ve Zika viral RNA’ya özgü izotermal amplifikasyon primerlerinin in silico tasarımı ile başlar. Çok sayıda izotermal amplifikasyon yöntemi mevcut olmasına rağmen, burada reaksiyonda bulunan viral RNA hedefinin konsantrasyonunu arttırmak için nükleik asit dizisine dayalı amplifikasyonun (NASBA) kullanımı klinik olarak anlamlı duyarlılık sağlamıştır. Pratik olarak, izotermal amplifikasyon yöntemleri, sabit bir sıcaklıkta çalışma avantajına sahiptir ve genellikle merkezi konumlarla sınırlı olan termal döngüleyiciler gibi özel ekipmanlara olan ihtiyacı ortadan kaldırır.

Daha sonra, sentetik ayak parmağı anahtar sensörlerinin örtüşme uzatma PCR aracılığıyla muhabir kodlama dizileri ile birleştirilmesi ve sentetik RNA kullanan hücresiz sistemlerde optimum performans için sentetik ayak parmağı anahtar sensörlerinin taranması işlemi açıklanmaktadır. Bu Zika virüsü sensörleri seti için, kolorimetrik bir substrat olan klorofenol kırmızı-β-D-galaktopiranosid (CPRG) ile göz veya plaka okuyucu ile tespit edilebilen sarıdan mora renk değişimi üretmek için β-galaktosidaz enzimini kodlayan lakZ genini seçtik. En iyi performans gösteren sentetik anahtarlar belirlendikten sonra, en iyi hassasiyeti sağlayan setleri bulmak için sentetik RNA kullanarak karşılık gelen hedef dizinin nükleik asit dizisi tabanlı izotermal amplifikasyonu için primerlerin taranması işlemi açıklanmaktadır.

Son olarak, teşhis platformunun performansı Latin Amerika’da yerinde doğrulanmıştır (Şekil 1). Klinik tanısal doğruluğu belirlemek için, kağıt tabanlı hücresiz tahlil, hastalardan alınan Zika virüsü örnekleri kullanılarak gerçekleştirilir; paralel olarak karşılaştırma için altın standart RT-qPCR testi yapılır. Kolorimetrik hücresiz tahlilleri izlemek için, termal döngücülerin bulunmadığı bölgelerdeki sonuçların yerinde ölçülmesini sağlıyoruz. Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; bundan böyle portatif plaka okuyucu olarak anılacaktır) olarak adlandırılan elle monte edilmiş plaka okuyucu da burada tanıtılmaktadır24. Başlangıçta hücresiz sentetik ayak parmağı anahtarı tanılaması için tamamlayıcı bir cihaz olarak geliştirilen taşınabilir plaka okuyucu, sonuçları yüksek verimli bir şekilde inkübe etmek ve okumak için erişilebilir bir yol sunarak, kullanıcılar için entegre, bilgisayar görüşü tabanlı yazılım analizi sağlar.

Figure 1
Şekil 1: Kağıt tabanlı hücresiz ayak parmağı anahtarı reaksiyonlarını kullanarak hasta örneklerini test etmek için iş akışı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 

Protocol

İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, Dünya Tabipler Birliği Helsinki Deklarasyonu tarafından belirlenen insan denekleri içeren tıbbi araştırmalar için etik ilkeler de dahil olmak üzere etik standartlara ve ilgili yönergelere uygun olarak yürütülmelidir. Bu çalışma, insan araştırmaları etik komitesi tarafından CAAE: 80247417.4.0000.5190 lisans protokol numarası altında onaylanmıştır. Bu çalışmaya dahil edilen tüm hastaların bilgilendirilmiş onamları, Fiocruz-PE Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından tanısal örnekler için feragat edilmiştir. NOT: PLUM cihazı bundan böyle ‘taşınabilir plaka okuyucu’ olarak anılacaktır. 1. Nükleik asit dizisi tabanlı amplifikasyon primerlerinin hesaplamalı tasarımı Genomik diziyi NCBI / Nükleotid BLAST 25,26’ya koyarak yaklaşık 200 nükleotid (nt) ila 300 nt uzunluğunda amplifikasyon için bir dizi aday bölgeyi tanımlamak için Zika genomunu tarayın. Genomu referans RNA dizileriyle karşılaştırın (refseq_rna) ve yüksek oranda korunmuş kalan ve insan genomu ile homolojisi olmayan bölgeleri arayın (diğer BLAST parametreleri değişmeden kalır). Sentetik ayak parmağı tutma anahtarını tasarlamak için en az iki site seçin. Her aday amplifikasyon bölgesi için ileri ve geri nükleik asit dizisi tabanlı amplifikasyon primer çiftleri üretmek için Deiman ve ark.27’nin seçim kriterlerini kullanın. Kısacası, astarları tasarlamak için şu kriterleri izleyin: (1) GC içeriği% 40 -% 60 arasında; (2) DNA erime sıcaklığı 41 °C’nin üzerinde olan 20 ila 24 nt uzunluğunda; (3) dört veya daha fazla özdeş nükleotidin çalışmaması; (4) son 3′ nükleotid bir A bazıdır; (5) Düşük primer sekonder yapı ve dimer oluşum olasılığı. Her hedef bölge için 8-10 primer çifti tarayın (önerilir). T7 promotör dizisi AATTCTAATACGACTCACTATAGGG AGAAGG(T7 promoter dizisinin altı çizili) içeren önek dizisini, T7 RNA polimeraz (RNAP) kullanılarak amplikonların transkripsiyonuna izin vermek için ileri primerlerin 5′ ucuna ekleyin. Primerleri bir DNA sentez şirketinden DNA oligoları olarak sipariş edin. 2. Ayak parmağı anahtarlarının hesaplamalı tasarımı 29 web sitesindeki talimatlara dayanarak NUPACK28 sürüm3.2’yi (nükleik asit tasarım paketi) yükleyin. Programlama dili olarak bir UNIX işletim sistemi ve MATLAB (sayısal bilgi işlem platformu) kullanın (önerilen). Adım 1.1’de olduğu gibi ayak parmağı anahtarı tasarımları için ilgilenilen patojene özgü hedef dizileri (örneğin, viral genom) tanımlayın. Adım 1.2’de oluşturulan nükleik asit dizisi tabanlı amplikonlardan Zika hedef dizilerini seçin.NOT: Uygulamada, kullanıcıların ihtiyaçlarına bağlı olarak, önce nükleik asit dizisi tabanlı amplifikasyon primerleri veya sentetik ayak parmağı anahtarları tasarlanabilir ve test edilebilir. Belirli hedef bölgeler zaten belirlenmişse (örneğin, mevcut yayınlardan veya teşhis protokollerinden), önce ayak parmağı anahtarı tasarımı ve taraması yapılabilir, ardından nükleik asit dizisi tabanlı amplifikasyon primerleri için tasarım ve tarama yapılabilir. Belirlenmiş bir hedef bölge yoksa, primer amplifikasyon verimliliğini seçerken tercih edilen hedefleri daraltmak için ilk önce nükleik asit dizisi tabanlı amplifikasyon primerlerini tam genoma karşı tarayın. Patojen için çoklu diziler mevcutsa, yüksek oranda korunmuş bölgelere odaklanan nükleik asit dizisi tabanlı amplifikasyon primerleri tasarlamak en iyisidir (tüm genomu taramak yerine). Gerekli MATLAB yazılımını bilgisayara indirin ve yükleyin. Nükleik asit tasarım paketi işlevlerinin yazılımda çağrılmasına izin vermek için ortam değişkenlerini ayarlayın. Bunu yapmak için, yazılımı açın ve ardından varsayılan çalışma klasöründe bir startup.m dosyası açın (veya oluşturun). Ardından, aşağıdaki kod satırlarını startup.m dosyasına kopyalayın ve son olarak, nükleik asit tasarım paketi ikili dosyalarını içeren klasörü PATH’e ekleyin:NUPACKINSTALL = ‘/Users/[user_name]/…/nupack3.2.2’;setenv(‘NUPACKINSTALL’,NUPACKINSTALL);setenv(‘PATH’,[getenv(‘PATH’),sprintf(‘:%s/build/bin’,NUPACKINSTALL)]); Sayısal bilgi işlem platformu yazılımını açın ve tasarım yazılımı klasörüne gidin. https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN’dan erişilebilen tasarım algoritmalarını çalıştırın. Hedef dizileri, giriş alt klasöründe bulunan design_input_file.csv girin. Girişler, Tablo 1’de tanımlandığı gibi Ad, Dış sıra, İç sıra, Sıcaklık, Çıkış adı ve Çıkış sırasını içerir. Hedef için henüz bir astarlama bölgesi belirlenmemişse, iç ve dış dizileri aynı tutun. Tasarım sürecinde muhabirin sadece ilk 29 nt’si dikkate alınacaktır. İşiniz bittiğinde, güncellenmiş e-tabloyu kaydedin ve kapatın.NOT: Çıkış dizisi, tahlil için kullanılması planlanan muhabir proteininin dizisidir (örneğin, lacZ). İç ve dış dizilerin belirtilmesi, algoritmanın astarlardan herhangi biriyle çakışan sentetik ayak parmağı anahtarları üretmemesini sağlar. Ayrıca, tahlilin özgüllüğünü geliştirmek için Zika genomundaki üç benzersiz bölgeyi tanımasını sağlar. Tasarım işlevi için kullanılacak parametreleri seçin: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file, options). Parametre değerlerini şu şekilde doldurun:num_designs – yazılım tarafından her hedef çıktı için en iyi tasarımların sayısı. Varsayılan değer 6’dır ve gerektiğinde değiştirilebilir (her hedef için en az altı tasarım önerilir). input_file – bu parametre, giriş sırası bilgilerini sağlayan dosyanın adını belirtir. Varsayılan değer ‘design_input_file.csv’dir ve gerektiğinde değiştirilebilir. Aşağıdaki seçeneklerden birini belirleyin – (1) SeriA ve SeriB: kodun oluşturacağı toehold anahtarının sürümleri. Zika virüsü tanılama6’da kullanılan format olan B serisi ayak parmağı anahtarını oluşturmak için Seri B’yi 1’e ve Seri A’yı 0’a ayarlayın; (2) Paralel: tasarımları hesaplamak için birden fazla çekirdeği kullanmak için 1’e ayarlayın; aksi takdirde, 0 olarak ayarlayın; (3) Antisense: Hedef girişin antisens dizisini (yani ters tamamlayıcıyı) melezleştiren ayak parmağı anahtarları oluşturmak için 1’e ayarlayın; aksi takdirde, 0 olarak ayarlayın. Seçilen parametreleri kullanarak tasarım işlevini çalıştırın: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file,options). Algoritma daha sonra ilgilenilen hedefler için ayak parmağı anahtarı tasarımlarını oluşturmaya başlayacaktır. Tasarım tamamlandıktan sonra, üst ayak parmağı anahtarı tasarım dizilerini ve final_designs klasöründeki ilgili hedef dizileri .csv biçimli elektronik tablolar biçiminde bulun. Algoritma tarafından oluşturulan ayak parmağı anahtarı DNA dizileri, 5′ ucunda T7 promotör dizisini ve 3’ ucunda korunmuş 21 nt bağlayıcı dizisi AACCTGGCGGCAGCCAAAAG’ı içerecektir. Elde edilen üst ayak parmağı anahtarı tasarım dizilerini NCBI-BLAST’a koyarak ve dizi homolojisini kontrol ederek diğer yaygın virüslere karşı tarayın. veya daha az homolojiye sahip dizileri kabul edin. Ayak parmağı anahtarı saç tokası dizilerini DNA oligoları olarak sıralayın ve daha sonra bunları muhabir geni ile tamamen işlevsel anahtarlar halinde birleştirin. Tercih edilen raportör proteinine bağlı olarak sonraki sensör montajı için gerekli PCR primerlerini sipariş edin. Parametre Tanım Ad Çıkış ayak parmağının istenen isimleri sıraları değiştirir. Dış sıra Amplifikasyondan üretilen tam NASBA transkripti. İç sıra Astar bağlanma bölgeleri hariç dış dizilim. Dış dizilimle eşleşir, ancak transkriptlerin ileri ve geri astarlara bağlanan kısımlarını hariç tutar. Sıcaklık RNA yapılarını hesaplamak için algoritmalar tarafından kullanılan sıcaklık. Çıktı adı Çıkış geninin adı (örneğin lacZ, gfp). Çıkış sırası Çıktı geninin dizisi. Tablo 1: Toehold switchdesign yazılımında kullanılan her parametrenin tanımı. 3. PCR ile ayak parmağı anahtarlarının yapımı NOT: Bu adımlarda, üst üste binen uzatma PCR ile LacZ ayak parmağı anahtarlarının yapısı açıklanmaktadır. Burada, DNA oligo ileri astar olarak kullanılır ve T7 sonlandırıcı ters astar olarak kullanılır. pCOLADuet-LacZ plazmidini lacZ geni için bir şablon olarak kullanıyoruz (addgene: 75006). Karşılık gelen diziyi içeren diğer DNA şablonları, T7 sonlandırıcısının son yapıya dahil edilmesi koşuluyla şablon olarak kullanılabilir. Ticari sağlayıcıdan sentetik DNA oligoları alındıktan sonra, nükleaz içermeyen suda 10 μM’lik bir konsantrasyonda sentetik DNA ve ters amplifikasyon astarı çözeltileri hazırlayın. Reaksiyonları Tablo 2’ye göre buz üzerindeki PCR tüplerinde birleştirin.NOT: PCR birimleri gerektiği gibi ölçeklendirilebilir. Ek bir plazmid çıkarma adımına veya arka plan LacZ sinyaline ihtiyaç duymamak için minimum miktarda (0.1-1 ng) pCOLADuet-LacZ DNA şablonu kullanın. Daha yüksek DNA şablonu miktarları için, artık plazmid şablonunu çıkarmak için PCR’yi bir DpnI kısıtlama enzim sindirimi ile takip edin. Reaksiyonları, Tablo 3’te listelenen döngü koşullarını izleyerek bir termal döngüleyiciye yerleştirin. PCR ürünlerini bir agaroz jeli üzerinde analiz edin (Şekil 2; bakınız Ek Protokol ve30). PCR ürünlerini, spin kolon bazlı bir PCR saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın ve üreticinin talimatlarına göre DNA’yı 15-30 μL nükleaz içermeyen suda etkisiz hale getirin. DNA’yı bir spektrofotometre kullanarak sayısallaştırın. Parça Hacim Konsantrasyon 5X Q5 Reaksiyon Tamponu 10 μL 1 adet 10 mM dNTP’ler 1 μL 200 μM 10 mM İleri Astar (Sentetik Anahtar DNA FW) 2,5 μL 0,5 μM 10 mM Ters Astar (T7 sonlandırıcı RV) 2,5 μL 0,5 μM Şablon DNA (pCOLADuet-LacZ) değişken <1 ng Q5 Yüksek Doğrulukta DNA Polimeraz 0,5 μL 0,02 U/μL Nükleaz içermeyen su 50 μL’ye kadar – Tablo 2: Toehold anahtarları oluşturmak için kullanılan PCR bileşenleri. Adım Sıcaklık Saat İlk Denatürasyon 98 °C 30 Saniye 35 Döngü Denatürasyon 98 °C 10 Saniye Tavlama 60 °C 20 Saniye Uzantı 72 °C 1.45 dk Son uzatma 72 °C 5 dk Tutmak 4 °C – Tablo 3: PCR ile ayak parmağı anahtarlarının yapımı sırasında kullanılan bisiklet koşulları. 4. Sentetik RNA hedefinin hazırlanması (Tetik) Bir moleküler biyoloji tasarım yazılımı kullanarak, sentetik tetikleyici RNA şablonlarını (adım 1.1’de seçilen) bir yukarı akış T7 promotör dizisi içerecek şekilde değiştirin ve tam şablonun kısa kalmasını sağlayın (<200 bp). Tetik dizisi astarını yükseltmek için ileri ve geri astarlar tasarlayın (oligo dizileri için lütfen Ek Protokol’e bakın). Dizileri DNA oligoları olarak sıralayın. Alındıktan sonra, sentetik tetikleyici DNA’yı ve amplifikasyon primerlerini nükleaz içermeyen suda 10 μM’ye yeniden oluşturun. Karşılık gelen PCR’leri Tablo 2’ye göre buz üzerindeki ince duvarlı tüplerde birleştirin ve şablon DNA olarak tetikleyici DNA ultramerinin 0.5 μL’sini (0.1 μM’lik son konsantrasyon) kullanın. Reaksiyonları bir termal bisikletçiye yerleştirin ve Tablo 3’te listelenen bisiklet koşullarını kullanın. 15 sn’lik bir uzatma süresi kullanın. Kaliteyi değerlendirin ve tetikleyici PCR ürünlerini adım 3.3 ve Ek Protokol’de açıklandığı gibi saflaştırın.NOT: İşlemi hızlandırmak için, kolon saflaştırılmış tetik PCR ürünleri doğrudan ilk ayak parmağı tutma anahtarı taraması için de kullanılabilir. 5. Seçilen tetik dizilerinin in vitro transkripsiyonu Reaksiyon bileşenlerini buz üzerinde Tablo 4’e göre monte edin. 4 saat boyunca 37 ° C’de in vitro transkripsiyon (IVT) reaksiyonlarını inubate edin, ardından şablon DNA’yı çıkarmak için DNaz I tedavisi uygulanır. DNaz I adımı için, 70 μL nükleaz içermeyen su, 10 μL 10x DNaz I Tamponu ve 2 μL DNaz I (RNaz içermeyen) ekleyin ve 15 dakika boyunca 37 ° C’de inkübe edin. Hemen adım 5.4’e geçmezseniz, DNase I’i 50 mM EDTA ilavesiyle devre dışı bırakın ve 10 dakika boyunca 65 ° C’de ısı inaktivasyonu yapın. İsteğe Bağlı Adım: Ek Protokolde açıklandığı gibi RNA kalitesini değerlendirmek için IVT ürünlerinde denatüre poliakrilamid jel elektroforezi (örneğin, üre-PAGE) analizi gerçekleştirin. Tetikleyici IVT ürünlerini, üreticinin talimatlarına göre kolon tabanlı bir RNA temizleme kiti kullanarak saflaştırın ve ardından spektrofotometri kullanarak RNA konsantrasyonunu ve saflığını ölçün. RNA’nın molaritesinin ve kopya numarasının/μL’sinin nasıl belirleneceğine ilişkin talimatlar için Ek Protokol’e bakınız. Parça Hacim Konsantrasyon 10X Reaksiyon Tamponu 1,5 μL 0,75x 25 mM NTP karışımı 6 μL 7,5 mM Şablon tetikleyici DNA X μL 1 μg T7 RNA Polimeraz Karışımı 1,5 μL – Nükleaz içermeyen su X μL 20 μL’ye kadar Tablo 4: Seçilen tetik dizilerinin in vitro transkripsiyonu (IVT). 6. Anahtarların ilk taraması NOT: Bu bölümde, hücre serbest, kağıt tabanlı ayak parmağı tutma anahtarı tepkilerinin ayarlanmasıyla ilgili adımlar ve yüksek performanslı ayak parmağı tutma anahtarlarının nasıl taranacağı açıklanmaktadır. Adım 6.10’da kullanılan BSA bloke filtre kağıdı, Ek Protokol’de açıklandığı gibi önceden hazırlanmalıdır. 25 mg tozu 1 mL nükleaz içermeyen suda çözerek bir CPRG stok çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi her zaman buz üzerinde tutun ve uzun süreli kullanım için -20 ° C’de saklayın. Ayarlanacak reaksiyon sayısını belirleyin. Değerlendirilen her ayak parmağı anahtarı için, ana karışımdan kaynaklanabilecek herhangi bir arka plan sinyalini hesaba katmak için şablon kontrolü (anahtar yok ve hedef RNA yok – aksi takdirde hücresiz tek başına kontrol olarak bilinir) ekleyin. Hedef RNA’nın yokluğunda arka plan anahtarı sızıntısını veya KAPALI hızını değerlendirmek için yalnızca bir anahtar kontrolü ekleyin. Tablo 5’te listelenen standart protokole göre buz üzerinde çözelti A, çözelti B, RNaz inhibitörü ve CPRG’nin hücresiz reaksiyon ana karışımını bir araya getirin.NOT: Burada açıklanan adımlar, pipetleme hatasını hesaba katmak için hacim eklenmiş üçlü 1,8 μL reaksiyon seti için yeterli olacak bir ana karışım içindir. Ana karışım hacmi, taranan ayak parmağı düğmelerinin sayısına bağlı olarak gerektiği gibi ayarlanmalıdır. Her üçlü hücresiz reaksiyon için, ana karışımı bir PCR tüpüne dağıtın ve tüm tüpleri buz üzerinde tutun. Tek başına hücresiz kontrol olarak ayrılan tüp için, 5.84 μL’lik son hacme nükleaz içermeyen su ekleyin, yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve kısa bir süre santrifüj yapın. Tüplerin geri kalanı için, PCR saflaştırılmış ayak parmağı anahtarı DNA’sını 33 nM’lik bir son konsantrasyona ekleyin. Tek başına anahtar kontrolleri olarak ayrılan tüpler için, 5.84 μL’lik son hacme nükleaz içermeyen su ekleyin. Ayak parmağı anahtarını ve hedef RNA kombinasyonunu test etmek için ayrılan tüpler için, in vitro transkribe edilmiş hedef RNA’yı 1 μM’lik bir son konsantrasyona ekleyin. Ardından, 5.84 μL’lik son bir hacme nükleaz içermeyen su ekleyin. yukarı ve aşağı pipetleyerek, tüm reaksiyonları iyice karıştırın ve kısa bir süre santrifüj yapın. 384 kuyucuklu siyah, berrak dipli bir plaka üzerindeki reaksiyon kuyularını çevreleyen kuyucuklara 30 μL nükleaz içermeyen su ekleyin. Bu, deney boyunca buharlaşmayı en aza indirir ve tekrarlanabilirliği artırır.NOT: Portatif plaka okuyucu cihazını kullanıyorsanız, plakanın üzerine bir PCR folyosu yerleştirin ve reaksiyonunuz için tasarlanan kuyucukları ve dört köşe kuyusunun her birini kesmek için hassas bir bıçak kullanın. PCR folyosu, taşınabilir plaka okuyucu kameranın boş kuyulardan aşırı pozlamasını önler. 2 mm’lik bir biyopsi zımba ve cımbız kullanarak, BSA bloke filtre kağıdı disklerini kesin ve zımbayı çıkararak veya cımbız kullanarak reaksiyon kuyularına yerleştirin (BSA bloke filtre kağıdı hazırlamak için Ek Protokol’e bakınız). Her reaksiyon tüpünden üçlü 1,8 μL hacimleri 384 delikli plakadaki filtre kağıdı disklerine dağıtın ve tüm numuneleri ve 384 delikli plakayı her zaman buz üzerinde tutun.NOT: Portatif plaka okuyucu cihazı kullanıyorsanız, 384 delikli plakanın dört köşesinin her birine 1,8 μL CPRG (0,6 mg/mL) ekleyin. CPRG’nin sarı rengi, görüntü analizinde dijital çok kuyulu plaka şablonunun hizalanması için taşınabilir plaka okuyucusuna desen tanıma sağlar. Buharlaşmayı önlemek için plakanın kuyucuklarını PCR filmi ile örtün. Plakayı bir plaka okuyucuya yerleştirin, OD570’i 130 dakika boyunca her dakika 37 ° C’de okuyun. Parça Hacim Reaksiyon Başına Son Konsantrasyon Çözüm A 2,38 μL 40% Çözüm B 1,78 μL 30% RNaz İnhibitörü 0,03 μL %0,5 d/v CPRG (25 mg/mL) 0,14 μL 0.6 mg/mL Toehold Anahtarı X μL 33 nM Hedef RNA X μL 1 μM Nükleaz içermeyen su 5,94 μL’ye kadar – Toplam hacim: 5,94 μL Tablo 5: PURExpress hücresiz transkripsiyon-çeviri reaksiyonu bileşenleri. 7. Yüksek performanslı ayak parmağı düğmelerini tanımlama NOT: Bu bölümde, ilerlemek üzere en iyi performans gösteren ayak parmağı düğmelerini seçmek için adım 6’daki verilerin nasıl çözümleneceği açıklanmaktadır. Önce OD570 absorbansını arka plana normalleştirerek veri analizine başlayın. Bunu yapmak için, herhangi bir anahtar veya hedef RNA’ya (yani, hücresiz tek başına kuyular) sahip olmayan reaksiyonların OD570 ölçümlerini diğer OD570 ölçümlerinden çıkarın. Üç noktalı hareketli ortalama kullanarak normalleştirilmiş verileri düzgünleştirin ve her bir kuyucuğun minimum değerini sıfıra ayarlayın. Ayak parmağı anahtarları 27B, 33B ve 47B için toplanan normalleştirilmiş zaman kursu verilerinin bir örneği için Şekil 3’e bakın. Bu işlenmiş verileri kullanarak, ayak parmağı anahtarı ile hedef ve anahtar kuyuları arasındaki renk değişim hızındaki farkı (yani, zaman içinde OD570’teki değişim) belirleyerek katlama değişimini (veya AÇIK/KAPALI oranını) hesaplayın (oranı hesaplamak için Ek Protokol’e bakınız; Şekil 4). Daha fazla karakterizasyon için en yüksek AÇIK/KAPALI katlama değişimine sahip anahtarları seçin. En düşük kıvrım değişimini gösteren düşük performanslı ayak parmağı düğmelerini atlayın. 8. Nükleik asit dizisi bazlı amplifikasyon primer taraması ve duyarlılığı NOT: Aşağıdaki adımlarda, önce fonksiyonel izotermal amplifikasyon primerleri için bir tarama yapılır ve daha sonra, belirli bir ayak parmağı anahtarının izotermal amplifikasyon ile birleştirildiğinde güvenilir bir şekilde tespit edebileceği sentetik RNA’nın μL’si başına hedef RNA kopyalarının sayısı belirlenerek duyarlılıkları değerlendirilir. İzotermal amplifikasyonu takiben, başarılı nükleik asit dizisi tabanlı amplifikasyon primer setlerini tanımlamak için hücresiz reaksiyonlar gerçekleştirin. Bununla birlikte, ilk önce aday primer setlerinin havuzunu daraltmak için nükleik asit dizisi bazlı amplifikasyon reaksiyonları üzerinde poliakrilamid veya agaroz jelleri çalıştırmak daha uygun maliyetli olabilir. Bu durumda, uygun amplikon boyutunda jel üzerinde bir bant oluşturan nükleik asit dizisi bazlı amplifikasyon primer setleri, sonraki hücresiz tarama için kısa listeye alınabilir. Nükleaz içermeyen suda tüm ileri ve geri astar setlerinin 25 μM’lik bir stok çözeltisini yapın (Ek Protokol’e bakınız). Nükleik asit dizisi tabanlı amplifikasyon reaksiyonlarının sayısını ve ardından kurulması gereken hücresiz reaksiyonları belirleyin. Bu, ayak parmağı düğmelerinin sayısına ve ilgili astar setlerine bağlı olacaktır.NOT: Astarları tararken, astarla ilişkili spesifik olmayan amplifikasyon nedeniyle ortaya çıkabilecek arka plan yapıtlarını hesaba katmak için her astar seti için her zaman şablonsuz bir kontrol eklemek önemlidir. Aşağıdaki gibi bir adet 5 μL reaksiyonu ayarlayın (bunu gerektiği gibi ölçeklendirin). Tüm reaktifleri buz üzerinde çözün. Reaksiyon tamponunun, nükleotid karışımının ve RNaz inhibitörünün bir reaksiyon ana karışımını Tablo 6’ya göre birleştirin. Beyaz çökelti çözünene kadar yukarı ve aşağı pipetleyerek, iyice karıştırın ve ardından alikotları PCR tüplerine dağıtın.Ana karışım nükleik asit dizisi tabanlı amplifikasyon primerlerini taramak içinse, primerleri ilk başta ana karışımdan çıkarın (2.55 μL ana karışım dağıtın). Aksi takdirde, astar duyarlılık analizi yapılırsa, primerler ana karışıma dahil edilebilir (bu durumda 2.75 μL alikotlar dağıtın). Enzim karışımını denatürasyon ve dengeleme aşamalarından sonra ekleyin. Nükleik asit dizisi tabanlı amplifikasyon primerlerini tararsanız, ileri ve geri primerleri uygun tüplere ekleyin. Bir termal döngüleyicide, inkübasyon protokolünü Tablo 7’de açıklandığı gibi ayarlayın. 1 μL nükleaz içermeyen su veya 1 μL hedef tetikleyici RNA’yı 2 pM’de veya yaklaşık 106 kopya / μL’de ekleyin, tüpleri buna göre etiketlediğinizden emin olun. Nazik pipetleme ile karıştırın ve tüpleri kısaca aşağı doğru döndürün.NOT: Astar seti taraması için, izotermal amplifikasyon yönteminin tespitinin alt sınırına çarpmamak için yeterince yüksek, ancak amplifikasyon meydana gelmezse ayak parmağı anahtarının aktivasyonunu sağlayacak kadar yüksek olmayan bir hedef tetikleyici RNA konsantrasyonu kullanın. Tüpleri termal döngüye taşıyın ve inkübasyona başlayın. 12 dakika sonra, tüpleri çıkarın ve her tüpe 1.25 μL enzim karışımı ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetle karıştırın ve tüpleri kısaca santrifüj edin.NOT: Bu noktada, tüpler oda sıcaklığında tutulabilir; Bununla birlikte, enzim karışımı tüplere eklenene kadar buz üzerinde tutulmalıdır. 1 saatlik reaksiyon inkübasyonunu başlatmak için 41 °C tutma adımını atlayarak tüpleri termal döngüleyiciye geri döndürün.NOT: İnkübasyonun ardından, reaksiyonlar aynı gün işleme için buz üzerine yerleştirilebilir veya daha sonraki işlemler için -20 ° C’de dondurulabilir. Astar performansını değerlendirmek üzere kağıt tabanlı hücresiz ayak parmağı tutma anahtarı reaksiyonlarını birleştirmek için 6.2-6.7 ve Tablo 8 adımlarını izleyin. Verileri adım 7.1-7.2 ve Şekil 3’te açıklandığı gibi analiz edin.NOT: Daha önce bahsedilen kontrollere ek olarak, reaksiyondan kaynaklanabilecek herhangi bir arka plan sinyalini hesaba katmak için negatif kontrolün de dahil edilmesi önemlidir. Ek olarak, NASBA’sız bir amplifikasyon kontrolü olarak, anahtar ve hedef RNA’nın 2 pM (son konsantrasyonu) ile bir kontrol de dahil etmek önemlidir. Duyarlılık analizi ile ilerlemek için aday primer çiftlerini tanımlayın. Astar çiftleri, inkübe edilmiş reaksiyonun eklenmesini takiben ayak parmağı anahtarı aktivasyonunun gerçekleşip gerçekleşmediğine göre seçilir. Gerekirse, astar ekranını daha fazla astar kombinasyonu ile tekrarlayın. RNA örneklerini her zaman buz üzerinde tutarak, nükleaz içermeyen suda hedef RNA’ların aşağıdaki seri seyreltme setini yapın: 104, 103, 10 2,10 1 ve10 0 RNA kopyaları / μL. Seçilen primer setleriyle nükleik asit dizisi tabanlı amplifikasyonu ve hücresiz reaksiyonları tekrarlayın (adım 8.2-8.7), en iyi hassasiyeti sağlayan primer setlerini tanımlamak için seri seyreltme serisini test edin. Astar kümesi duyarlılığını belirlemeye yönelik sonuçların bir örneği için Şekil 5’e bakınız.NOT: İdeal olarak, seçilen ayak parmağı tutma anahtarı ve primer çifti, RNA’nın μL’si başına en az 1-100 hedef RNA kopyası algılamalıdır (stok çözeltisi konsantrasyonu). Nükleik asit dizisine dayalı amplifikasyon duyarlılığı deneyini biyolojik üçlü katta tekrarlayın. Bu adım, hasta örnekleriyle deneylere geçmeden önce sonuçların tekrarlanabilirliğini doğrulamaya yarar. Opsiyonel: Uzun süreli kullanım ve taşıma için anahtar DNA’sının güvenilir bir kaynağına sahip olmak için, seçilen anahtar dizilerini herhangi bir geleneksel klonlama yöntemini kullanarak bir plazmid içine klonlayın. Benzer şekilde, hedef tetikleyici RNA dizisi de depolama için tercih edilen bir plazmid içine klonlanabilir. Parça Reaksiyon başına hacim Son Konsantrasyon NASBA Reaksiyon Arabelleği 1,67 μL 1 adet NASBA Nükleotid Karışımı 0,833 μL 1 adet 25 μM İleri Astar 0,1 μL 0,5 μM 25 μM Ters Astar 0,1 μL 0,5 μM RNaz İnhibitörü (40 U/μL) 0,05 μL 0,4 U/μL Hedef RNA 1 μL NASBA Enzim Karışımı 1,25 μL 1 adet Toplam hacim 5 μL Tablo 6: NASBA reaksiyon bileşenleri. Adım Sıcaklık Saat Denatürasyon 65 °C 2 dk Denge 41 °C 10 dk Tutmak 41 °C ∞ Kuluçka 41 °C 1 saat Tutmak 4 °C – Tablo 7: NASBA için reaksiyon koşulları. Parça Hacim Reaksiyon Başına Son Konsantrasyon Çözüm A 2,38 μL 40% Çözüm B 1,78 μL 30% RNaz İnhibitörü 0,03 μL %0,5 d/v CPRG (25 mg/mL) 0,14 μL 0.6 mg/mL Toehold Anahtarı X μL 33 nM Hedef RNA (varsa) X μL 1 μM NASBA (varsa) 0,85 μL 1:7 Nükleaz içermeyen su 5,94 μL’ye kadar – Toplam hacim: 5,94 μL Tablo 8: Kağıt bazlı hücresiz reaksiyon bileşenleri. 9. Hasta örnekleri toplama ve viral RNA ekstraksiyonu NOT: Bu bölümde, hasta örneklerini toplamak ve bir RNA saflaştırma kiti kullanarak RNA’yı çıkarmak için kullanılan protokol açıklanmaktadır. Aşağıdaki protokol periferik kandan serum elde etmek için kullanılır. Bu çalışmada kullanılan örnekler, Brezilya’nın Pernambuco eyaletinde ateş, ekzantem, artralji veya arbovirüs enfeksiyonunun diğer ilgili semptomlarını gösteren hastalardan toplanmıştır. Şüpheli arbovirüs bulaşmış hastalardan periferik kan örnekleri toplayın. Standart bir aseptik teknik kullanarak venipunktur (tam kan tüpü) uygulayın. Örnek tüplerini anonim bir kod ve örnek toplama tarihi ile etiketleyin. Serumu 10 dakika boyunca 2.300 x g’de ayırmak için kanı santrifüj yapın. Bir pipet kullanarak, 1.5 mL tüplerde RNA ekstraksiyonu için kullanılacak serum alikotları (200 μL) hazırlayın.NOT: RNA ekstraksiyonunun numune toplanmasından kısa bir süre sonra gerçekleştirilmesi mümkün değilse, serum numuneleri aşağı akış uygulamalarından önce -80 ° C’de saklanmalıdır. Taşıyıcı RNA’yı 1,5 mL’lik bir tüp içine içeren hazırlanmış Tampon AVL’nin (viral lizis tamponu) 560 μL’lik pipeti. Tüpteki Buffer AVL/carrier RNA karışımına 140 μL serum ekleyin. 15 s boyunca nabız-vorteks ile karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin ve ardından tüpün altındaki içeriği toplamak için numuneyi kısaca santrifüj edin. Numuneye 560 μL etanol (% 96-% 100) ekleyin ve 15 s boyunca nabız-vorteks ile karıştırın. Karıştırdıktan sonra, tüpün altındaki içeriği toplamak için numuneyi santrifüj edin. Jantı ıslatmadan 9.4 adımından itibaren çözeltinin 630 μL’sini spin kolonuna dikkatlice ekleyin. Bu adımı takiben, kapağı kapatın ve 1 dakika boyunca 6.000 x g’de santrifüj yapın. Spinasyonlu kolonu, temiz bir 2 mL toplama tüpüne yerleştirin ve filtrat içeren kullanılmış toplama tüpünü atın. Döndürme sütununu dikkatlice açın ve adım 9.5’i tekrarlayın. Sıkma kolonunu dikkatlice açın ve 500 μL Tampon AW1 ekleyin (yıkama tamponu 1). Kapağı kapatın ve 1 dakika boyunca 6.000 x g’de santrifüj yapın. Spinasyonlu kolonu, temiz bir 2 mL toplama tüpüne yerleştirin ve filtrat içeren kullanılmış toplama tüpünü atın. Sıkma kolonunu dikkatlice açın ve 500 μL Tampon AW2 ekleyin (yıkama tamponu 2). Kapağı kapatın ve 3 dakika boyunca 20.000 x g’de santrifüj yapın. Sıkma kolonunu temiz bir 2 mL toplama tüpüne yerleştirin ve filtrat içeren kullanılmış toplama tüpünü atın. Çıkış yönündeki enzimatik reaksiyonlarda sorunlara neden olabilecek artık tampon AW2 ile kontaminasyonu önlemek için, spin kolonunu temiz bir 2 mL toplama tüpüne yerleştirin ve kullanılmış toplama tüpünü filtrat ile atın. 1 dakika boyunca 20.000 x g’de santrifüj. Spinasyonlu kolonunu temiz bir 1,5 mL tüpe yerleştirin ve kullanılan toplama tüpünü filtrat ile atın. Spin-kolonunu dikkatlice açın ve oda sıcaklığına eşit 60 μL Buffer AVE (elüsyon tamponu) ekleyin. Bu adımı takiben, kapağı kapatın ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca inkübe edin. 1 dakika boyunca 6.000 x g’de santrifüj. Salınan RNA daha sonra NASBA ve RT-qPCR’ler için paralel olarak bir girdi olarak kullanılabilir. Ekstrakte edilen hasta RNA’sının 1 μL’sini kullanarak nükleik asit dizisi tabanlı amplifikasyonu ve kağıt bazlı hücresiz reaksiyonları gerçekleştirmek için 8.3 ila 8.11 arasındaki adımları izleyin ve negatif ve pozitif kontrol reaksiyonlarını içerdiğinden emin olun. Reaksiyonları takiben, 384 delikli reaksiyon plakasını hazırlayın ve tahlili portatif plaka okuyucu cihazında 37 ° C’de çalıştırın ( Ek Protokoldeki ayrıntılara bakın).NOT: Kültürlenmiş Zika virüsünden ekstrakte edilen 104 ve 102 PFU / mL’lik iki RNA konsantrasyonu, klinik doğrulama sırasında tüm deneyler için pozitif kontrol olarak kullanılır. Daha önce bahsedilen kontrollere ek olarak, tetiği (10 ng / μL) pozitif bir kontrol olarak dahil etmek önemlidir. Her deneyin sonunda, pratik plaka okuyucudan ham veriler (.csv dosyası) çevrimiçi olarak güvenli bir veritabanına yüklenebilir. Ek olarak, taşınabilir plaka okuyucu, numunelerin Zika virüsü için pozitif veya negatif olup olmadığını gösteren bir rapor oluşturur (Şekil 6); inkübasyon sırasında elde edilen tüm grafiklerin örnekleri için temsili sonuçlar bölümüne bakınız (Şekil 7).NOT: Kullanıcılar ayrıca USB üzerinden taşınabilir plaka okuyucusundan kendi bilgisayarlarına dosya aktarabilirler. 10. Portatif plaka okuyucu cihazı Portatif plaka okuyucu cihazı (Şekil 8), geleneksel plaka okuyucu24’e alternatif olarak kullanılabilir. Protokol ve temsili sonuçlar için bkz: Ek Protokol. 11. Zika virüsü tespiti için RT-qPCR NOT: Bu bölümde, hasta örneklerinden Zika virüsü tespiti için RT-qPCR gerçekleştirme adımları özetlenmektedir (bkz. Kirlenmeyi önlemek için, RT-qPCR bileşenlerini amplifikasyon işleminden izole bir alana (örneğin, temiz davlumbaz) monte edin. RT-qPCR tamponunu, enzimleri ve astar/probları buz veya soğuk blok üzerine yerleştirin. Bunu takiben, reaksiyonları Tablo 9’a göre buz üzerindeki 384 kuyucuklu bir plakaya ekleyin.NOT: Tüm deneyler için negatif (ekstraksiyon kontrolü ve şablon dışı kontrol [NTC]) ve pozitif kontrol (104 PFU/mL) önerilir. Reaktifleri 1,5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpüne ekledikten sonra, reaksiyonu yukarı ve aşağı pipetleyerek, karıştırın (vorteks yapmayın) ve her bir oyuğa 6,5 μL dağıtın. Her RNA şablonundan 3,5 μL’yi üçlü olarak ekleyin. Plakanın üstüne bir PCR filmi yerleştirin. 384 delikli plakayı 2 dakika boyunca 600 x g’de santrifüj yapın. Plakayı, Tablo 10’da belirtilen aşağıdaki döngü koşullarını kullanarak bir RT-qPCR makinesine yerleştirin. Sonuçları analiz etmek için RT-qPCR makine tasarım ve analiz yazılımını kullanın ve otomatik eşik ve taban çizgisini göz önünde bulundurun (Ek Protokol’deki ayrıntılara bakın). Parça Hacim Konsantrasyon 2X QuantiNova Probu RT-PCR Master Mix 5 μL 1 X 100 μM İleri Astar 0,08 μL 0,8 μM 100 μM Ters Astar 0,08 μL 0,8 μM 25 μM Prob 0,04 μL 0,1 μM QuantiNova ROX Referans Boya 0,05 μL 1 X QuantiNova Probu RT Karışımı 0,1 μL 1 X Şablon RNA 3,5 μL – Nükleaz içermeyen su 10 μL’ye kadar – Tablo 9: Hasta örneklerinden Zika virüsünü tespit etmek için Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri-CDC ABD protokolüne dayanan Zika virüsü RNA’sını yükseltmek için RT-qPCR bileşenleri 31. Adım Sıcaklık Saat Ters transkripsiyon 45 °C 15 dk PCR ilk aktivasyon adımı 95 °C 5 dk 45 Döngü Denatürasyon 95 °C 5 sn. Kombine tavlama/uzatma 60 °C 45 Saniye Tablo 10: RT-qPCR için bisiklet koşulları.

Representative Results

Hesaplamalı tasarım boru hattını takiben, üç ayak parmağı anahtarının yapımı PCR tarafından gerçekleştirildi. PCR ürünleri agaroz jel elektroforezi kullanılarak analiz edildi (Şekil 2). 3.000 bp civarında berrak bir bandın varlığı, kabaca bir ayak parmağı anahtarına bağlı lakZ geninin boyutu, tipik olarak başarılı bir reaksiyonu gösterir. Alternatif olarak, bandı olmayan bir şerit, birden fazla bant veya yanlış boyutta bir bant, başarısız bir PCR’yi gösterir. Başarısız bir PCR durumunda, reaksiyon koşulları ve / veya primer dizileri optimize edilmelidir. Birleştirilen ayak parmağı anahtarları, her bir sensörü ilgili in vitro transkribe edilmiş tetik RNA’sına karşı değerlendirmek için tarandı (Şekil 3). Her üç sensör de artan OD570 absorbansı gösterirken, anahtar 27B (Şekil 3A) en hızlı açılış oranına sahipti. 33B anahtarları ve daha az ölçüde 47B, hedef tetikleyici RNA’nın yokluğunda OD570 absorbansının arttığını gösterdi, bu da bu anahtarların bazı arka plan aktivitesine veya sızıntıya sahip olduğunu gösteriyor (Şekil 3B, C) – özgüllüğü azaltabileceği için aday sensörde istenmeyen bir özellik. En yüksek AÇIK/KAPALI sinyal oranına sahip sensörü daha net bir şekilde tanımlamak için, OD570 absorbansının katlama değişimi hesaplanmış (ek bilgiler bölüm 5’e bakınız) ve çizilmiştir (Şekil 4). Bu analizden, anahtar 27B’nin yaklaşık 60 ON / OFF oranıyla en iyi performansa sahip sensör olduğu açıktır. En iyi performans gösteren ayak parmağı tutma anahtarının (27B) duyarlılığı daha sonra NASBA reaksiyonu ile birleştirildiğinde ayak parmağı tutma anahtarını aktive etmek için gereken en düşük RNA konsantrasyonu belirlenerek değerlendirildi. Grafik, en iyi performans gösteren Zika sensörlerinin RNA’yı μL başına 1.24 molekül kadar düşük konsantrasyonlarda tespit edebildiğini göstermektedir (~ 2’ye eşdeğer; Şekil 5). Anahtar 27B tanımlandıktan ve doğrulandıktan sonra, sensör malzemeleri Brezilya’nın Pernambuco eyaletindeki Recife’deki ekip üyelerine dağıtıldı. Brezilya’da, Zika virüsü tanı platformunun klinik tanısal doğruluğu, karşılaştırma için RT-qPCR’ye paralel olarak Zika virüsü hasta örnekleri kullanılarak değerlendirildi. Kağıt tabanlı Zika teşhis platformunu doğrulamak için, kağıt tabanlı sensörlerin kolorimetrik çıktısını inkübe edebilen ve okuyabilen taşınabilir plaka okuyucu kullanılmıştır. Sarıdan mora renk değişimi, pozitif bir numuneyi tanımlamak için kullanılırken, negatif bir numune sarı kalır (Şekil 6). Portatif plaka okuyucu tarafından oluşturulan sonuçları görselleştirmek için ek bir seçenek (Şekil 8), zaman içinde her kağıt tabanlı reaksiyon için kolorimetrik yanıtı çizmektir. Örnekler üçlü olarak test edildi ve eşiği aşanlar (kırmızı çizgi 1 olarak ayarlandı) pozitif kabul edilirken, eşiğin altındaki örnekler negatif olarak kabul edildi (Şekil 6 ve Şekil 7). Son olarak, Zika ayak parmağı anahtar sensörünün klinik performansını Zika virüsü enfeksiyonunu teşhis etmek için mevcut altın standart yöntemle değerlendirmek ve karşılaştırmak için, tüm hasta örnekleri RT-qPCR ile paralel olarak test edilmiştir. İki temsili hasta örneğinin amplifikasyon grafiği, RT-qPCR ile Zika virüsünün tespiti için üçlü olarak test edildi (Şekil 9). Döngü eşiği (Ct) değeri ≤38 olduğunda numuneler pozitif olarak kabul edilir; kırmızı çizgi pozitif bir örneği gösterir ve mavi çizgi Zika virüsü için negatif bir örneği gösterir. Resim 2: PCR ürünlerinin kalitesini değerlendirmek için agaroz jel elektroforezi. PCR ürünleri, 1X TAE’de% 1’lik bir agaroz jeli üzerinde analiz edilir, 90 dakika boyunca 80 V’ta çalıştırılır. Tek bir şeffaf bant tipik olarak başarılı bir reaksiyonu gösterir. Şerit 1: 1 kb DNA merdiveni; Şerit 2-4: 27B anahtar DNA, 33B tetikleyici DNA ve 47B tetikleyici DNA, sırasıyla. Sol taraftaki sayılar bp cinsinden bant boyutunu temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Kağıt tabanlı Zika sensörleri için üç ayak parmağı anahtarının prototiplenmesi. Üç kağıt tabanlı RNA ayak parmağı anahtar sensörünün performansı, 130 dakikadan fazla bir süre boyunca 37 ° C’de ölçüldü. Her grafik iki izleme içerir, biri yalnızca anahtar denetimini temsil ederken, diğeri anahtarı ve tetikleyiciyi temsil eder. Üç grafik, ayak parmağı anahtar sensörleri 27B (A), 33B (B) ve 47B (C) kullanılarak elde edilen verileri temsil eder. Hata çubukları, üç çoğaltmadan ortalamanın (SEM) standart hatasını temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: En iyi performans gösteren sensörler, 570 nm’de absorbanstaki kıvrım değişiminin hesaplanmasıyla tanımlanır. Katlama değişimi (veya maksimum AÇIK/KAPALI oranı), yalnızca anahtar kontrolü ile anahtar artı tetik CFPS testi arasındaki 130 dakikada absorbans oranının (OD570) ölçülmesiyle hesaplanır. Hata çubukları, üç çoğaltmadan SEM’i temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: En iyi performans gösteren anahtarın duyarlılık değerlendirmesi. In vitro transkribe edilmiş Zika RNA, NASBA reaksiyonlarına titre edilir. 1 saatlik bir inkübasyondan sonra, reaksiyonlar kağıt diskler üzerindeki hücresiz PURExpress reaksiyonlarına 1: 7 oranında eklendi. 37 °C’de 130 dakika sonra kıvrım değişimi çizilir. Bu rakam24’ten çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: Yakalanan görüntü verileriyle yüklenen taşınabilir plaka okuyucu yakalama sayfası. Bu şekilde, veri toplama çalışması sırasında taşınabilir plaka okuyucu tarafından yakalanan son görüntünün örnek bir resmi gösterilmektedir. Orijinal tarih/saat damgası resmin üst kısmında görünür. Sarı renk kontrolü veya negatif reaksiyonları, mor renk ise pozitif reaksiyonu gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: Veri analizi modu. Sol tarafta, kullanıcılar çizmek istedikleri veri kümelerini seçerler; grafikler daha sonra her örnek veya kontrol kümesi için benzersiz renklerle sağda görüntülenir. Kesikli kırmızı çizgi, pozitif ve negatif örnekleri belirlemek için bir eşik görevi görür. Eşiği aşan üçlü olarak test edilen numuneler pozitif olarak kabul edilirken, eşiğin altındaki numuneler negatif olarak kabul edilir. Hata çubukları, üç çoğaltmadan standart sapmayı (SD) temsil eder. Ctrl 1 – Ctrl 5 arasındaki kontrolleri gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 8. PLUM, taşınabilir bir plaka okuyucu. Bu taşınabilir plaka okuyucu, bir kutuda laboratuvar görevi görür ve kolorimetrik reaksiyonları inkübe etmek ve izlemek için sıcaklık kontrollü bir plaka okuyucu görevi görür. Bu taşınabilir cihaz, sahada kağıt tabanlı Zika sensörlerinin nicel ve yüksek verimli ölçümlerini sağlayabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 9: Zika virüsünün tespiti için üçlü olarak test edilen iki hasta örneğinin amplifikasyonunun RT-qPCR grafiği. Döngü eşiği (Ct) değeri ≤38 olduğunda numuneler pozitif olarak kabul edilir. Noktalı kırmızı çizgi, pozitif ve negatif numuneleri belirlemek için bir eşik görevi görür. Kırmızı iz pozitif bir örneği, mavi iz ise negatif bir örneği gösterir. ΔRn (delta Rn) değeri, test edilen tüm numuneler için RT-qPCR cihazı tarafından algılanan floresan sinyalinin normalleştirilmiş büyüklüğünü temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Ek Protokol Dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Ek Rakamlar. Bu rakamları indirmek için lütfen tıklayınız. 

Discussion

Burada açıklanan kombine kağıt tabanlı sistem, işlevsel olarak RT-qPCR ile karşılaştırılabilir performansla klinik olarak ilgili moleküler tanılamayı ihtiyaç noktasınagetirebilir 6. Daha da önemlisi, uzak ayarlar için, yerinde tanılamanın kullanılabilirliği, sonuç alma süresini günlerden saatlere düşürebilir. Bu yaklaşımın programlanabilirliğini vurgulayarak, tarif edilen boru hattı hemen hemen her patojen hedefini tespit etmek için kullanılabilir. Moleküler aletleri, kompakt ve pille çalışma (8-9 saat) ile uyumlu olan ve dağıtılmış uygulamaları etkinleştirmek için yerleşik veri analizi sağlayan amaca yönelik bir taşınabilir plaka okuyucu ile eşleştirdik. Diğer çalışmalarda, RT-qPCR’ye paralel olarak 268 hasta örneği ile birleştirilmiş donanım ve Zika virüsü tanı platformunu doğruladık ve% 98.5’lik bir tanı doğruluğu bulduk24. Birlikte ele alındığında, amacımız bu platformun araştırmacılara teknoloji transferini sağlamaktır, böylece karşılanmamış teşhis ihtiyaçlarını karşılamak için topluluk tarafından yeniden kullanılabilir ve geliştirilebilir.

In silico toehold anahtar tasarım süreci, üç aşamaya ayrılabilen bir boru hattına entegre edilmiş ve otomatikleştirilmiştir. İlk aşama, bir nükleotid artışıyla hedef diziye melezleşen bir ayak parmağı anahtarı tasarımları havuzu oluşturur. İkinci aşama, ikincil yapıyı ve ayak parmağı tutma anahtarının kullanılabilirliğini inceler ve çerçeve içi erken durdurma kodonları ile sensörleri ortadan kaldırır. Birden fazla faktörü (örneğin, ayak parmağı anahtarının kusur seviyesi, ayak parmağı tutma anahtarı kullanılabilirliği ve hedef site erişilebilirliği) dikkate alan bir puanlama işlevi daha sonra genel puanlara göre üst ayak parmağı anahtarı tasarımlarını seçmek için uygulanır. Son aşamada, üst ayak parmağı anahtar tasarımları ve bunlara karşılık gelen hedef tetikleyiciler için bir dizi listesi oluşturulur. Üst sensör dizileri, NCBI / Primer-BLAST25 kullanılarak insan transkriptomuna ve yakından ilişkili viral genomlara karşı özgüllük açısından taranmalıdır. Ayrıca, sensörlerin geniş ve sağlam algılama sağlayacağından emin olmak için Zika viral genomunda sekans koruması için sensör hedef bölgelerini taramak en iyi uygulamadır. Toehold anahtar tasarım yazılımının çeşitli versiyonları geliştirilmiştir ve tasarım algoritması, kullanıcıların A 6 serisi veya B serisi toeholdanahtarları 6 olmak üzere iki versiyon oluşturmalarını sağlar. Bu yazıda, B serisi ayak parmağı anahtarı tasarımına odaklanılmıştır.

Ticari DNA sentezini takiben, ayak parmağı anahtarları hızlı bir şekilde monte edilebilir ve daha sonra hedef genomun kısa bölgelerine (200-300 nt) karşılık gelen sentetik bir hedef tetikleme dizisine karşı bir başlangıç taraması yapılarak test edilebilir. Ayak parmağı anahtarı tabanlı sensörlerin performansını taramak için, hedef diziyi RNA şeklinde eklemek idealdir. Bu makalede, in vitro transkribe edilmiş tetikleyici RNA’yı eklemek için gereken adımlar özetlenmiştir. Bununla birlikte, eğer varsa, niceliklendirilmiş viral RNA ekstraktları veya ticari sentetik RNA genomları veya standartları gibi tam uzunlukta genom şablonları kullanılabilir. İlk ayak parmağı anahtarı taraması için tam uzunlukta RNA genomlarının kullanılması, RNA ikincil yapısı gibi ek faktörlerin sensör performansını etkileyip etkilemeyeceğini bildirebileceği için faydalıdır. Aday anahtarların ON/OFF oranını optimize etmek için, ayak parmağı anahtarı DNA’sı hücresiz reaksiyona titre edilebilir. Bu adım aynı zamanda yüksek performanslı ayak parmağı tutma anahtarlarını (katlanır amplifikasyon veya yüksek AÇIK/KAPALI oranı) tanımlamaya ve sızıntılı ayak parmağı anahtarlarını (hedef RNA’nın yokluğunda yüksek sinyal) aşağı akış karakterizasyon adımlarından çıkarmaya da hizmet edebilir.

En iyi performans gösteren ayak parmağı anahtarı adaylarının tespit sınırını iyileştirmek için NASBA, klinik olarak ilgili hedef Zika viral RNA konsantrasyonlarını, ayak parmağı anahtarları6 tarafından tespit edilebilecek bir seviyeye çıkarmak için kullanılır. Klinik olarak ilgili konsantrasyonlarda tespiti mümkün kılmak için en iyi NASBA primer ve ayak parmağı anahtarı kombinasyonlarını belirlemek için ileri ve geri astar setlerinin farklı kombinasyonları taranır. İdeal bir astar seti ve ayak parmağı anahtarı kombinasyonu belirlendikten sonra, tahlil klinik doğrulamaya götürülür. Ayak parmağı anahtarının ve NASBA tarama aşamalarının emek ve kaynak yoğun olabileceğini ve bu nedenle test geliştirmenin iyi kaynaklara sahip araştırma alanlarına en uygun olduğunu belirtmek önemlidir. Süreç otomasyonu uygulamamış olsak da, bunun yinelemeli tasarım, yapı ve test döngüsü32’yi hızlandırması muhtemeldir. Neyse ki, sensör tasarımı ve testinden devreye alınmasına kadar geçen geri dönüş süresi oldukça kısa olabilir (bir haftadan az), bu da bu stratejiyi salgın salgınlar gibi zaman açısından kritik durumlar için ideal hale getirir6.

Klinik olarak ilgili duyarlılığa sahip bir biyosensör geliştirildikten sonra bile, ele alınması gereken teknik zorluklar vardır. Bu protokol manuel çalışmayı içerdiğinden ve çok adımlı bir prosedür olduğundan, numuneler arasında çapraz kontaminasyon riski vardır. Dikkatli laboratuvar uygulamaları ile bu riski azaltmak için elimizden gelenin en iyisini yapıyoruz. 268 hasta örneğinden oluşan yakın tarihli bir klinik çalışmada, herhangi bir kontaminasyon sorunuyla karşılaşmadık; ancak, bu önemli bir husustur24. Bunu akılda tutarak, protokol bir laboratuvar tahlili olmaya devam eder ve uygun moleküler biyoloji tekniklerine hakim yetenekli bir kullanıcı gerektirir. Dağıtım için ek bir husus, hasta örneklerinden RNA izolasyonudur. Burada RNA izolasyonunu kolon bazlı nükleik asit ekstraksiyon kitleri kullanarak tanımlıyoruz. Bununla birlikte, diğer çalışmalarda, düşük yüklü hasta numune işleme6 için etkili ve basit bir kaynar lizis yöntemi (2 dakika boyunca 95 ° C) gösterdik. Bu strateji, RNA ekstraksiyonu ile ilişkili maliyeti neredeyse ortadan kaldırır ve COVID-19 pandemisi33 gibi krizler sırasında düşük kaynak ortamlarında veya tedarik zinciri sorunlarında lojistik bir zorluk oluşturabilecek sütun tabanlı nükleik asit ekstraksiyon kitlerinin kullanılmasını önler.

COVID-19 pandemisi sırasında gördüğümüz gibi, RT-qPCR’yi gerçekleştirmek için kullanılan aletlerin kendileri bir darboğaz görevi görebilir ve hastanın testlere erişimini sınırlayabilir. Aynı zamanda büyük ölçüde finansal olan bu faktör, tanılama erişimini sınırlayabilen merkezi bir test moduna yol açar. Örneğin, 2015/2016 Zika salgını sırasında, Brezilya’da sadece beş ulusal referans laboratuvarı mevcuttu ve bu da hasta testlerinde gecikmelere neden oldu. Ölçek ekonomilerinin potansiyel faydasını göz önünde bulundurmadan, taşınabilir plaka okuyucu için malların mevcut maliyeti ~ 500 ABD Dolarıdır; bu, işgücü ve ticari marjı hesaba katmak için beş kat artırılmış olsa bile, yine de uygun fiyatlı bir araç sağlar. Bu, maliyeti 15.000-90.000 ABD Doları34 ABD Doları arasında değişen RT-qPCR cihazlarıyla iyi bir şekilde karşılaştırılır. Ayrıca, Latin Amerika’daki hücresiz tahlil için test başına tahmini maliyet yaklaşık 5.48 ABD Doları, Brezilya’daki RT-qPCR testi başına maliyet ise Zika salgını36 sırasında ~ 10-11 ABD Doları idi. Ekipman maliyetinin ötesinde, taşınabilir plaka okuyucu küçük bir ayak izine (20 cm3), otomatik analize, internet üzerinden buluta veri yüklemeye sahiptir ve pil gücüyle çalıştırılabilir. Bu özellikler, testin uygulanabileceği potansiyel ortamları önemli ölçüde genişletir ve aynı zamanda hizmet verilebilecek hasta popülasyonunu genişletir.

Bugüne kadar en yaygın ticari E. coli CFPS platformları S30 ve PURE sistemleri37; Bununla birlikte, düşük ve orta gelirli ülkelerde teşhise erişimin iyileştirilmesinde önemli bir husus, bu reaktiflerin sınırlı yerel mevcudiyetidir. Bu zorluğun çözümüne yönelik önemli bir adım, yerel CFPS üretiminin geliştirilmesidir. Federici laboratuvarı son zamanlarda lizat bazlı hücresiz sistemlerde ayak parmağı anahtarı tabanlı sensörleri uygulamak için ticari olmayan bir platform geliştirmeye yönelik önemli ilerleme kaydetti ve Zika virüsü RNA14 ile 2.7 fM LOD’ye ulaştı. Bu başarı sadece reaktiflerin kullanım ülkesinde yapılmasına izin vermekle kalmaz, ithalat tarifelerinden ve gecikmelerden kaçınır, aynı zamanda işçilik maliyetleri de yerel oranlara ölçeklenir ve böylece genel maliyet önemli ölçüde azaltılabilir. Federici grubu tarafından özetlenen çalışmada, Şili’de CFPS ekspresyon reaksiyonunu (5 μL) üretmenin maliyeti 6,9 sent (USD) 35,38 idi ve lizat bazlı sistemlerin uygulanması için ikili bir teşvik (geliştirilmiş lojistik ve maliyet) sağladı35,38.

RT-qPCR ile karşılaştırılabilir testlerin dağıtılmış tanılama ağlarına yerleştirilmesi, numunelerin merkezi RT-qPCR tesislerine taşınmasına bağlı olan mevcut uygulamalara göre önemli avantajlar sağlayabilir. Zika vakalarının yoğunlaştığı peri-kentsel ortamlarda, bir hasta ile tanı tesisi arasındaki fiziksel mesafe tanıyı yavaşlatır ve sonuçların klinik olarak ilgili bir zamanda hastaya ulaşmama riskini artırır. Burada sunulan çalışmanın, araştırma topluluğunun, bilgi aktarımı yoluyla, insan sağlığı, tarım ve çevresel izleme için merkezi olmayan biyoteknolojiler ve taşınabilir donanımlar oluşturmasını sağlamaya katkıda bulunabileceğini umuyoruz.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, Green, Pardee ve Pena laboratuvarlarının tüm üyelerine ve bu makalede açıklanan çalışmalarla ilgili önceki makalelerin tüm ortak yazarlarına teşekkür eder. S.J.R.D.S., Brezilya’daki Pernambuco Bilim ve Teknoloji Vakfı (FACEPE) tarafından desteklenen bir doktora bursu, referans numarası IBPG-1321-2.12/18 tarafından desteklenmektedir ve şu anda Toronto Üniversitesi, Kanada tarafından desteklenen bir Doktora Sonrası Bursu tarafından desteklenmektedir. P.B., Toronto Üniversitesi Eczacılık Fakültesi’nden William Knapp Buckley Ödülü ile desteklenmektedir. M.K., Toronto Üniversitesi PRMF2019-002 dahili burs numarasındaki Hassas Tıp Girişimi (PRiME) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma, Kanada Araştırma Başkanları Programı’ndan (Dosyalar 950-231075 ve 950-233107), Toronto Üniversitesi Büyük Araştırma Projesi Yönetim Fonu’ndan, CIHR Vakfı Hibe Programı’ndan (201610FDN-375469) ve L.P, A.A.G. ve K.P.’ye CIHR / IDRC Ekip Hibesi: Kanada-Latin / Amerika-Karayipler Zika Virüsü Programı (FRN: 149783) ve Kanada Uluslararası Kalkınma Araştırma Merkezi’nden (hibe 109434-001) K.P.’ye Kanada 2019 Yeni Koronavirüs (COVID-19) Hızlı Araştırma Fonu Fırsatı aracılığıyla fon sağladı. Bu çalışma aynı zamanda A.A.G.’ye Arizona Biyomedikal Araştırma Komisyonu Yeni Araştırmacı Ödülü (ADHS16-162400), Gates Vakfı (OPP1160667), bir NIH Director’s New Innovator Award (1DP2GM126892), bir NIH R21 ödülü (1R21AI136571-01A1) ve bir Alfred P. Sloan Bursu (FG-2017-9108) tarafından A.A.G.’ye sağlanan fonlarla da desteklenmiştir. Şekil 1 , K.P.’ye akademik lisans altında Biorender.com ile oluşturulmuştur.

Materials

384 well plate covers – aluminum Sarstedt 95.1995 Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader
384 well plate covers – transparent Sarstedt 95.1994 Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader
384 well plates VWR CA11006-180 2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification
Agarose BioShop Canada AGA001.500 Gel electrophoresis
BSA BioShop Canada ALB001.500 Blocking agent for the Whatman filter paper
Cell free reactions New England Biolabs E6800L PURExpress
CPRG Roche 10884308001 Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside
Disposable Sterile Biopsy Punches Integra Miltex 23233-31 Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate
DNAse I Thermo Scientific K2981 Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction
DNAse I Kit Thermo Scientific 74104 DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA
dNTPs New England Biolabs N0446S Used for PCRs
electrophoresis system Bio-Rad 1704487 Used to run the agarose gels
Gel imaging station Bio-Rad 1708265 ChemiDoc XRS+ Imaging System
IVT kit New England Biolabs E2040S Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening
Nanodrop One Thermo Scientific ND-ONE-W Used for determining nucleic acid concentrations
NASBA kit Life Sciences Advanced Technologies NWK-1 Isothermal amplification reaction components
Nuclease free H20 invitrogen 10977015 Added to reaction mixes
PAGE electrophoresis system Biorad 1658001FC Used to cast and run polyacrylamide gels
pCOLADuet-LacZ DNA Addgene 75006 https://www.addgene.org/75006/
Phusion polymerase/reactioin buffer New England Biolabs M0530L Used for PCRs
Plate reader BioTek BioTek NEO2 Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2
Primers Integrated DNA Technologies Custom oligo synthesis
Q5 polymerase/reaction buffer New England Biolabs M0491L Used for PCRs
Qiagen PCR Puriifcation Kit QIAGEN 27106 QIAprep Spin Miniprep Kit
RNA loading dye New England Biolabs B0363S 2X RNA loading dye
RNA Purification Kit QIAGEN EN0521 QIAamp Viral RNA extraction kit
RNase inhibitor New England Biolabs M0314S Used to prevent contamination of RNases A, B, and C
RT-qPCR kit QIAGEN 208352 QuantiNova Probe RT-PCR Kit
SYBR Gold Invitrogen S11494 S11494 PAGE gel stain for nucleic acids
TAE Buffer BioShop Canada TAE222.4 Gel electrophoresis buffer
Thermal Cycler Applied Biosystems 4484073 Used for temperature cycling and incubating reactions
Whatman 42 filter paper GE Healthcare 1442-042 Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, 73-79 (2006).
  2. Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, 107-144 (2008).
  3. Faria, N. R., et al. Mobile real-time surveillance of Zika virus in Brazil. Genome Medicine. 8 (1), 97 (2016).
  4. Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
  5. Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  6. Pardee, K., et al. Rapid, low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  7. Duyen, T. T. M., et al. Paper-based colorimetric biosensor for antibiotics inhibiting bacterial protein synthesis. Journal of Bioscience and Bioengineering. 123 (1), 96-100 (2017).
  8. Jung, J. K., et al. Cell-free biosensors for rapid detection of water contaminants. Nature Biotechnology. 38 (12), 1451-1459 (2020).
  9. Yang, Y. H., et al. Cell-free Escherichia coli-based system to screen for quorum-sensing molecules interacting with quorum receptor proteins of streptomyces coelicolor. Applied and Environmental Microbiology. 75 (19), 6367 (2009).
  10. Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment. Synthetic Biology. 3 (1), (2018).
  11. Park, S., Lee, J. W. Detection of coronaviruses using RNA toehold switch sensors. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1-13 (2021).
  12. Amalfitano, E., et al. A glucose meter interface for point-of-care gene circuit-based diagnostics. Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).
  13. Nguyen, P. Q., et al. Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection. Nature Biotechnology. 39 (11), 1366-1374 (2021).
  14. Pellinen, T., Huovinen, T., Karp, M. A cell-free biosensor for the detection of transcriptional inducers using firefly luciferase as a reporter. Analytical Biochemistry. 330 (1), 52-57 (2004).
  15. Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTRβ-specific endocrine disruptors. Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).
  16. Salehi, A. S. M., et al. Biosensing estrogenic endocrine disruptors in human blood and urine: A RAPID cell-free protein synthesis approach. Toxicology and Applied Pharmacology. 345, 19-25 (2018).
  17. Voyvodic, P. L., et al. Plug-and-play metabolic transducers expand the chemical detection space of cell-free biosensors. Nature Communications. 10 (1), 1-8 (2019).
  18. Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).
  19. Gräwe, A., et al. A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs. PLOS One. 14 (3), 0210940 (2019).
  20. Green, A. A., Silver, P. A., Collins, J. J., Yin, P. Toehold Switches: De-Novo-Designed Regulators of Gene Expression. Cell. 159 (4), 925-939 (2014).
  21. Craw, P., Balachandran, W. Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review. Lab on a Chip. 12 (14), 2469-2486 (2012).
  22. Zyrina, N. V., Antipova, V. N. Nonspecific Synthesis in the Reactions of Isothermal Nucleic Acid Amplification. Biochemistry (Moscow). 86 (7), 887-897 (2021).
  23. Takahashi, M. K., et al. A low-cost paper-based synthetic biology platform for analyzing gut microbiota and host biomarkers. Nature Communications. 9 (1), 1-12 (2018).
  24. Karlikow, M., et al. Field validation of the performance of paper-based tests for the detection of the Zika and chikungunya viruses in serum samples. Nature Biomedical Engineering. 6 (3), 246-256 (2022).
  25. Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 44 (1), 7-19 (2016).
  26. . BLAST: Basic Local Alignment Search Tool Available from: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2022)
  27. Deiman, B., Van Aarle, P., Sillekens, P. Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA). Molecular Biotechnology. 20 (2), 163-179 (2002).
  28. Zadeh, J. N., Wolfe, B. R., Pierce, N. A. Nucleic acid sequence design via efficient ensemble defect optimization. Journal of Computational Chemistry. 32 (3), 439-452 (2011).
  29. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2021).
  30. Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerging Infectious Diseases. 14 (8), 1232 (2008).
  31. Walsh, D. I., et al. Standardizing automated DNA assembly: Best practices, metrics, and protocols using robots. SLAS Technology. 24 (3), 282 (2019).
  32. Silva, S. J. R., de Magalhães, J. J. F., de Pena, L. Simultaneous circulation of DENV, CHIKV, ZIKV and SARS-CoV-2 in Brazil: An inconvenient truth. One Health. 12, 100205 (2021).
  33. Kimura, S., Fujinaga, K., Sekiya, T. PCR machine. Tanpakushitsu kakusan koso. Protein, Nucleic Acid, Enzyme. 41 (5), 514-517 (1996).
  34. Arce, A., et al. Decentralizing cell-free RNA sensing with the use of low-cost cell extracts. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 727584 (2021).
  35. Silva, S. J. R., Pardee, K., Balasuriya, U. B. R., Pena, L. Development and validation of a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of ZIKV in patient samples from Brazil. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
  36. Shimizu, Y. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  37. Lavickova, B., Maerkl, S. J. A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system. ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).

Tags

Paper-based DiagnosticsToehold SwitchGene CircuitNucleic Acid DetectionCell-free DiagnosticsZika VirusMATLAB Design SoftwareNCBI BLASTPCRAgarose Gel Electrophoresis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Jaenes, K., Ribeiro da Silva, S. J., Vigar, J. R. J., Wu, K., Norouzi, M., Bayat, P., Karlikow, M., Cicek, S., Guo, Y., Green, A. A., Pena, L., Pardee, K. Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics. J. Vis. Exp. (184), e63223, doi:10.3791/63223 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image