תכנון ליישום מחקר לפיתוח ותיקוף מטופלים של אבחון מתגי Toehold מבוסס נייר

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים צריכים להתבצע בהתאם לסטנדרטים אתיים והנחיות רלוונטיות, כולל העקרונות האתיים למחקר רפואי המערבים נבדקים אנושיים שנקבעו על ידי הצהרת הלסינקי של ההסתדרות הרפואית העולמית. מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של המחקר האנושי תחת פרוטוקול רישיון מספר CAAE: 80247417.4.0000.5190. הסכמה מדעת של כל המטופלים שנכללו במחקר זה ויתרה על ידי מועצת הביקורת המוסדית של Fiocruz-PE (IRB) לדגימות אבחון. הערה: התקן PLUM ייקרא להלן ‘קורא צלחות נייד’. 1. תכנון חישובי של פריימרים להגברה מבוססי רצף חומצות גרעין סרוק את הגנום של זיקה כדי לזהות קבוצה של אזורים מועמדים להגברה באורך של כ-200 נוקלאוטידים (nt) עד 300 nt על ידי הכנסת הרצף הגנומי ל-NCBI/Nucleotide BLAST25,26. השווה את הגנום לרצפי RNA ייחוס (refseq_rna) וחפש אתרים שנותרו שמורים מאוד ואין להם הומולוגיה עם הגנום האנושי (פרמטרים אחרים של BLAST נותרו ללא שינוי). בחר לפחות שני אתרים לעיצוב מתג ה-toehold הסינתטי. השתמש בקריטריוני הבחירה של Deiman et al.27 כדי ליצור זוגות של פריימרים מבוססי רצף חומצות גרעין קדימה ואחורה עבור כל אזור הגברה מועמד. בקצרה, עקוב אחר הקריטריונים הבאים לעיצוב פריימרים: (1) תוכן GC בין 40%-60%; (2) אורך של 20 עד 24 nt עם טמפרטורת המסת DNA מעל 41 מעלות צלזיוס; (3) אין ריצות של ארבעה נוקלאוטידים זהים או יותר; (4) הנוקלאוטיד הסופי של 3′ הוא בסיס A; (5) מבנה משני פריימר נמוך והסתברות היווצרות דימר. מסך 8-10 זוגות פריימרים לכל אזור יעד (מומלץ). צרף את רצף הקידומת המכיל את רצף מקדם T7 AATTCTAATACGACTCACTATAGGG AGAAGG(רצף מקדם T7 מסומן בקו תחתון) לקצה 5′ של הפריימרים הקדמיים כדי לאפשר שעתוק של האמפליקונים באמצעות T7 RNA פולימראז (RNAP). הזמינו את הפריימרים כאוליגוס דנ”א מחברת סינתזת דנ”א. 2. תכנון חישובי של מתגי toehold התקן את NUPACK28 גרסה 3.2 (חבילת עיצוב חומצות גרעין) בהתבסס על ההוראות באתר29. השתמש במערכת הפעלה UNIX וב-MATLAB (פלטפורמת מחשוב נומרי) כשפת התכנות (מומלץ). זהה את רצפי המטרה (למשל, גנום נגיפי) הספציפיים לפתוגן המעניין את עיצובי מתגי הטוהולד כמו בשלב 1.1. בחר את רצפי היעד של זיקה מתוך האמפליקונים המבוססים על רצף חומצות גרעין שנוצרו בשלב 1.2.הערה: בפועל, ניתן לתכנן ולבדוק תחילה את פריימרים ההגברה המבוססים על רצף חומצות גרעין או את מתגי ה-toehold הסינתטיים, בהתאם לצרכי המשתמשים. אם כבר נקבעו אזורי יעד מסוימים בעלי עניין (למשל, מפרסומים קיימים או מפרוטוקולי אבחון), תכנון וסינון מתגי טוהולד עשויים להתרחש תחילה, ולאחר מכן תכנון וסינון עבור פריימרים להגברה מבוססי רצף חומצות גרעין. אם אין אזורי מטרה מבוססים, יש לסנן תחילה פריימרים מבוססי רצף חומצות גרעין כנגד הגנום המלא כדי לצמצם את המטרות הנבחרות תוך בחירה ביעילות הגברה של פריימר. אם קיימים רצפים מרובים עבור הפתוגן, עדיף לתכנן פריימרים המבוססים על רצפי חומצות גרעין המתמקדים באזורים שמורים מאוד (במקום לסרוק את הגנום כולו). הורד והתקן את תוכנת MATLAB הנדרשת במחשב. הגדר את משתני הסביבה כדי לאפשר לפונקציות של חבילת העיצוב של חומצות גרעין להיקרא בתוכנה. לשם כך, פתח את התוכנה ולאחר מכן פתח (או צור) קובץ startup.m בתיקיית העבודה המוגדרת כברירת מחדל. לאחר מכן, העתק את שורות הקוד הבאות לקובץ startup.m ולבסוף, הוסף את התיקיה המכילה את הקבצים הבינאריים של חבילת עיצוב חומצות גרעין ל- PATH:NUPACKINSTALL = ‘/משתמשים/[user_name]/…/nupack3.2.2’;setenv(‘NUPACKINSTALL’, NUPACKINSTALL);setenv(‘PATH’,[getenv(‘PATH’), sprintf(‘:%s/build/bin’,NUPACKINSTALL)]); פתח את תוכנת פלטפורמת המחשוב המספרי ונווט אל תיקיית תוכנת העיצוב. הפעל את אלגוריתמי העיצוב הנגישים ב- https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN. הזן את רצפי היעד לתוך design_input_file.csv הממוקם בתיקיית המשנה של הקלט. הקלטים כוללים שם, רצף חיצוני, רצף פנימי, טמפרטורה, שם פלט ורצף פלט כמוגדר בטבלה 1. אם עדיין לא נקבעו אתרי פרימינג עבור המטרה, שמרו על רצפים פנימיים וחיצוניים זהים. רק 29 nt הראשונים של הכתב ייחשבו במהלך תהליך העיצוב. בסיום, שמור וסגור את הגיליון האלקטרוני המעודכן.הערה: רצף הפלט הוא הרצף של חלבון הכתב המתוכנן לשמש לבדיקה (לדוגמה, lacZ). ציון הרצפים הפנימיים והחיצוניים מבטיח שהאלגוריתם לא ייצור מתגי toehold סינתטיים החופפים לאף אחד מהפריימרים. זה גם מבטיח כי הבדיקה מזהה שלושה אתרים ייחודיים בגנום זיקה כדי לשפר את הספציפיות שלה. בחר את הפרמטרים שישמשו לפונקציית העיצוב: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file, אפשרויות). מלא את ערכי הפרמטרים כ:num_designs – מספר העיצובים המובילים עבור כל פלט יעד על ידי התוכנה. ברירת המחדל היא 6 וניתן לשנות אותה לפי הצורך (מומלץ לפחות שישה עיצובים לכל יעד). input_file – פרמטר זה מציין את שם הקובץ המספק את נתוני רצף הקלט. ערך ברירת המחדל הוא ‘design_input_file.csv’ וניתן לשנותו לפי הצורך. בחר מבין האפשרויות הבאות – (1) SeriesA ו- SeriesB: הגרסאות של מתג toehold שהקוד ייצור. הגדר את SeriesB ל- 1 ואת SeriesA ל- 0 כדי ליצור מתג toehold מסדרה B, שהוא הפורמט המשמש באבחון וירוס זיקה6; (2) מקביל: מוגדר ל-1 כדי לרתום ליבות מרובות לחישוב העיצובים; אחרת, הגדר ל- 0; (3) Antisense: מוגדר ל-1 כדי ליצור מתגי toehold שמכליאים את רצף האנטיסנס (כלומר, המשלים ההפוך) של קלט המטרה; אחרת, הגדר ל- 0. הפעל את פונקציית העיצוב באמצעות הפרמטרים שנבחרו: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file,אפשרויות). לאחר מכן האלגוריתם יתחיל ליצור את עיצובי מתגי ה-toehold עבור המטרות המעניינות. עם השלמת העיצוב, אתר את רצפי העיצוב של מתג ה- toehold העליון ואת רצפי היעד המתאימים בתיקייה final_designs בצורה של גיליונות אלקטרוניים בפורמט .csv. רצפי הדנ”א של מתג הטוהולד שנוצרו על ידי האלגוריתם יכילו את רצף מקדם T7 בקצה 5′ ואת רצף המקשר המשומר 21 nt AACCTGGCGGCGCGCAAAAG בקצה 3′. סנן את רצפי העיצוב של מתגי ה-toehold העליונים המתקבלים כנגד וירוסים נפוצים אחרים על-ידי הצבתם ב-NCBI-BLAST ובדיקת הומולוגיה של רצפים. קבל רצפים עם 40% הומולוגיה או פחות. הזמינו את רצפי סיכות השיער של הטוהולד כ-DNA oligos, ומאוחר יותר הרכיבו אותם עם הגן המדווח למתגים מתפקדים במלואם. הזמינו את פריימרי ה-PCR הדרושים להרכבת החיישן הבא בהתאם לחלבון הכתב המועדף. פרמטר הגדרה שם השמות הרצויים של רצפי מתגי הפלט. רצף חיצוני תמליל נאס”א מלא שהופק מהגברה. רצף פנימי הרצף החיצוני למעט אתרי קשירת הפריימר. הוא תואם את הרצף החיצוני אך אינו כולל את חלקי התמלילים הנקשרים לפריימרים הקדמיים והאחוריים. טמפרטורה הטמפרטורה המשמשת את האלגוריתמים לחישוב מבני הרנ”א. שם פלט שם גן הפלט (למשל lacZ, gfp). רצף פלט רצף גן הפלט. טבלה 1: ההגדרה של כל פרמטר המשמש בתוכנת toehold switchdesign. 3. בניית מתגי טוהולד על ידי PCR הערה: שלבים אלה מתארים את הבנייה של מתגי LacZ toehold על-ידי PCR הרחבה חופפת. כאן, אוליגו הדנ”א משמש כפריימר קדמי וה-T7 שליחות קטלנית משמש כפריימר הפוך. אנו משתמשים בפלסמיד pCOLADuet-LacZ כתבנית לגן lacZ (addgene: 75006). כל תבנית דנ”א אחרת המכילה את הרצף המתאים יכולה לשמש כתבניות, בתנאי ששליחות קטלנית T7 נכללת במבנה הסופי. לאחר שהתקבלו אוליגואים סינתטיים של דנ”א מהספק המסחרי, הכינו תמיסות של הדנ”א הסינתטי ופריימר הגברה הפוכה בריכוז של 10 מיקרומטר במים נטולי נוקלאז. הרכיבו תגובות בצינורות PCR על קרח לפי טבלה 2.הערה: ניתן לשנות את קנה המידה של אמצעי אחסון PCR לפי הצורך. השתמש בכמות מינימלית (0.1-1 ננוגרם) של תבנית דנ”א pCOLADuet-LacZ כדי למנוע את הצורך בשלב נוסף להסרת פלסמיד או אות LacZ ברקע. לקבלת כמויות גבוהות יותר של תבניות DNA, עקוב אחר ה-PCR עם תקציר אנזים הגבלת DpnI כדי להסיר את תבנית הפלסמיד השיורית. מקם את התגובות במחזור תרמי, בהתאם לתנאי המחזור המפורטים בטבלה 3. נתחו את תוצרי ה-PCR על ג’ל אגרוז (איור 2; ראו פרוטוקול משלים ו-30). טהרו את מוצרי ה-PCR באמצעות ערכת טיהור PCR מבוססת עמודת ספין ושתו את הדנ”א ב-15-30 מיקרון של מים נטולי נוקלאז, בהתאם להוראות היצרן. לכמת את הדנ”א באמצעות ספקטרופוטומטר. רכיב נפח ריכוז מאגר תגובה 5X Q5 10 מיקרוגרם פי 1 10 mM dNTPs 1 מיקרון 200 מיקרומטר פריימר קדמי 10 mM (מתג סינתטי DNA FW) 2.5 מיקרון ליטר 0.5 מיקרומטר פריימר הפוך 10 mM (T7 שליחות קטלנית RV) 2.5 מיקרון ליטר 0.5 מיקרומטר תבנית דנ”א (pCOLADuet-LacZ) משתנה <1 ננוגת Q5 פולימראז DNA באיכות גבוהה 0.5 מיקרון 0.02 U/μL מים נטולי נוקלאז עד 50 מיקרון – טבלה 2: רכיבי ה-PCR המשמשים לבניית מתגי toehold. צעד טמפרטורה זמן דנטורציה ראשונית 98 °C 30 שניות 35 מחזורים דנטורציה 98 °C 10 שניות חישול 60 מעלות צלזיוס 20 שניות סיומת 72 °C 1.45 דקות הארכה סופית 72 °C 5 דק’ אחז 4 °C – טבלה 3: תנאי המחזור המשמשים במהלך בניית מתגי toehold על ידי PCR. 4. הכנת יעד RNA סינתטי (טריגר) באמצעות תוכנה לתכנון ביולוגיה מולקולרית, שנה את תבניות ה-RNA הסינתטיות (שנבחרו בשלב 1.1) כך שיכללו רצף מקדם T7 במעלה הזרם, כדי להבטיח שהתבנית המלאה תישאר קצרה (<200 bp). תכנון פריימרים קדימה ואחורה כדי להגביר את פריימר רצף ההדק (לרצפי אוליגו ראו פרוטוקול משלים). סדרו את הרצפים כאוליגוס דנ”א. לאחר קבלתו, שחזרו את דנ”א ההדק הסינתטי ואת פריימרים להגברה ל-10 מיקרומטר במים נטולי נוקלאזה. הרכיבו את ה-PCR המתאימים בצינורות בעלי דופן דקה על קרח בהתאם לטבלה 2 והשתמשו ב-0.5 μL של אולטרמר הדנ”א של ההדק (ריכוז סופי של 0.1 מיקרומטר) כדנ”א של התבנית. מקם את התגובות במחזור תרמי והשתמש בתנאי הרכיבה המפורטים בטבלה 3. השתמש בזמן הארכה של 15 שניות. הערך את האיכות וטיהור מוצרי PCR כמתואר בשלב 3.3 ובפרוטוקול המשלים.הערה: כדי לזרז את התהליך, ניתן להשתמש ישירות במוצרי PCR של טריגרים מטוהרים באמצעות עמודות גם לסינון ראשוני של מתגי toehold. 5. תעתיק במבחנה של רצפי טריגרים נבחרים הרכיבו רכיבי תגובה על קרח לפי טבלה 4. תגובות שעתוקאינדוגרט i n vitro (IVT) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות, ולאחר מכן טיפול DNase I להסרת הדנ”א של התבנית. עבור שלב DNase I, יש להוסיף 70 μL של מים נטולי נוקלאז, 10 μL של 10x DNase I Buffer, ו-2 μL של DNase I (ללא RNase), ולדגור בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. אם לא ממשיכים לשלב 5.4 באופן מיידי, השביתו את DNase I עם תוספת של 50 mM EDTA והפסקת חום ב-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. שלב אופציונלי: בצע ניתוח אלקטרופורזה של ג’ל פוליאקרילאמיד דנטורינג (לדוגמה, אוריאה-פייג’) במוצרי IVT כדי להעריך את איכות הרנ”א כמתואר בפרוטוקול המשלים. טהרו את מוצרי ה-IVT באמצעות ערכת ניקוי RNA מבוססת עמודות על פי הוראות היצרן, ולאחר מכן כמתו את ריכוז ה-RNA והטוהר באמצעות ספקטרופוטומטריה. ראה פרוטוקול משלים לקבלת הוראות כיצד לקבוע את הטוחנות ואת מספר ההעתקה/μL של הרנ”א. רכיב נפח ריכוז מאגר תגובה 10X 1.5 מיקרון 0.75x תערובת NTP של 25 מ”מ 6 מיקרון 7.5 מ”מ תבנית טריגר דנ”א X μL 1 מיקרוגרם תערובת T7 RNA פולימראז 1.5 מיקרון – מים נטולי נוקלאז X μL עד 20 מיקרון טבלה 4: תעתיק חוץ גופי (IVT) של רצפי טריגרים נבחרים. 6. סינון ראשוני של המתגים הערה: סעיף זה מתאר את השלבים המשויכים להגדרת תגובות מתג toehold ללא תאים, המבוססות על נייר, וכיצד לסנן מתגי toehold בעלי ביצועים גבוהים. יש להכין מראש את נייר הסינון החסום BSA המשמש בשלב 6.10 כמתואר בפרוטוקול המשלים. הכינו תמיסת מלאי החייאה על ידי המסת 25 מ”ג מהאבקה ב-1 מ”ל של מים נטולי נוקלאזות. שמור את התמיסה על קרח בכל עת ואחסן בטמפרטורה של -20°C לשימוש ארוך טווח. קבע את מספר התגובות להגדרה. עבור כל מתג toehold שהוערך, כלול בקרה ללא תבנית (ללא מתג וללא RNA מטרה המכונה גם בקרה ללא תאים בלבד) כדי לקחת בחשבון כל אות רקע שעשוי לנבוע מתערובת המאסטר. כלול בקרת מתג בלבד כדי להעריך את דליפת מתג הרקע או קצב הכיבוי בהיעדר RNA מטרה. הרכיבו תערובת אב של תגובה ללא תאים של תמיסה A, תמיסה B, מעכב RNase ו-CPRG על קרח בהתאם לפרוטוקול הסטנדרטי המפורט בטבלה 5.הערה: השלבים המתוארים כאן מיועדים לתערובת אב שתספיק לקבוצה משולשת של תגובות 1.8 μL עם תוספת נפח של 10% כדי להסביר את שגיאת הפינטר. יש להתאים את עוצמת הקול של תערובת המאסטר לפי הצורך בהתאם למספר מתגי ה-toehold המוקרנים. עבור כל תגובה משולשת ללא תאים, יש לפזר את התערובת הראשית לתוך צינור PCR, תוך שמירה על כל הצינורות על הקרח. עבור הצינור שהונח בצד כבקרה נטולת תאים בלבד, הוסיפו מים נטולי נוקלאז לנפח סופי של 5.84 μL, ערבבו על ידי צנרת למעלה ולמטה, וצנטריפוגות לזמן קצר. עבור שאר הצינורות, יש להוסיף את ה-DNA של ה-toehold המטוהר ב-PCR לריכוז סופי של 33 ננומטר. עבור צינורות המונחים בצד כבקרות מתג בלבד, יש להוסיף מים נטולי נוקלאז לנפח סופי של 5.84 μL. עבור צינורות המיועדים לבדיקת מתג ה-toehold ושילוב ה-RNA של המטרה, הוסיפו RNA מטרה מתועתק במבחנה לריכוז סופי של 1 μM. לאחר מכן, הוסיפו מים נטולי נוקלאז לנפח סופי של 5.84 μL. ערבבו היטב את כל התגובות על ידי צנרת למעלה ולמטה, וצנטריפוגות לזמן קצר. הוסיפו 30 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז לבארות המקיפות את בארות התגובה על צלחת שחורה בעלת תחתית צלולה בגודל 384 בארות. זה ממזער את האידוי במהלך הניסוי ומשפר את יכולת השחזור.הערה: אם אתה משתמש במכשיר קורא הצלחות הנייד, הנח רדיד PCR על הצלחת והשתמש בסכין מדויקת כדי לחתוך את הבארות המיועדות לתגובתך, כמו גם כל אחת מארבע הבארות הפינתיות. רדיד ה-PCR מונע ממצלמת קורא הצלחות הנייד חשיפת יתר מבארות ריקות. באמצעות ניקוב ביופסיה ופינצטה של 2 מ”מ, חותכים דיסקי נייר סינון חסומים על ידי BSA ומניחים אותם בבארות התגובה על ידי הוצאת האגרוף או באמצעות פינצטה (ראו פרוטוקול משלים להכנת נייר סינון חסום BSA). יש לחלק נפחים משולשים של 1.8 μL מכל צינור תגובה על דיסקיות נייר הסינון בלוח 384 הבאר, תוך שמירה על כל הדגימות, כמו גם על צלחת 384 בארות, על קרח בכל עת.הערה: אם אתה משתמש בהתקן קורא הצלחות הנייד, הוסף 1.8 μL של CPRG (0.6 מ”ג/מ”ל) לכל אחת מארבע הפינות של לוח 384 הבאר. הצבע הצהוב של ה- CPRG מספק זיהוי תבנית לקורא הלוחות הנייד ליישור תבנית הלוחות הדיגיטליים מרובי הצלעות בניתוח תמונה. מכסים את בארות הצלחת בסרט PCR כדי למנוע אידוי. מניחים את הצלחת בקורא צלחות, קוראים את OD570 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כל דקה למשך 130 דקות. רכיב נפח ריכוז סופי לכל תגובה פתרון א’ 2.38 מיקרון ליטר 40% פתרון ב’ 1.78 מיקרון 30% מעכב RNase 0.03 מיקרון 0.5% v/v החייאה (25 מ”ג/מ”ל) 0.14 מיקרון 0.6 מ”ג/מ”ל מתג טוהולד X μL 33 נאנומטר רנ”א מטרה X μL 1 מיקרומטר מים נטולי נוקלאז עד 5.94 מיקרון – נפח כולל: 5.94 מיקרון טבלה 5: רכיבי תגובת תמלול-תרגום ללא תאים של PURExpress. 7. זיהוי מתגי toehold בעלי ביצועים גבוהים הערה: סעיף זה מתאר כיצד לנתח נתונים משלב 6 כדי לבחור את מתגי ה-toehold בעלי הביצועים הטובים ביותר להתקדם איתם. התחל בניתוח נתונים על-ידי נרמול תחילה לספיגת OD570 ברקע. לשם כך, הפחת את מדידות OD 570 של תגובות שאין להן מתג או רנ”א מטרה (כלומר, בארות בודדות נטולות תאים) ממדידות OD570 האחרות. החלק את הנתונים המנורמלים באמצעות ממוצע נע של שלוש נקודות והתאם את הערך המינימלי של כל באר לאפס. ראו איור 3 לדוגמה של נתוני מסלול זמן מנורמלים שנאספו עבור מתגי ה-toehold 27B, 33B ו-47B. באמצעות נתונים מעובדים אלה, חשב את שינוי הקיפול (או יחס הפעלה/כיבוי) על-ידי קביעת ההפרש בקצב שינוי הצבע (כלומר, שינוי ב- OD570 לאורך זמן) בין מתג ה- toehold לבין בארות היעד והמתג בלבד (ראה פרוטוקול משלים לחישוב היחס; איור 4). בחר מתגים עם שינוי קיפול ההפעלה/כיבוי הגבוה ביותר לאפיון נוסף. השמט את מתגי ה-toehold בעלי הביצועים הגרועים המציגים את שינוי הקיפול הנמוך ביותר. 8. בדיקת פריימר הגברה מבוססת רצף חומצות גרעין ורגישות הערה: בשלבים הבאים, תחילה נעשה מסך עבור פריימרים של הגברה איזותרמית פונקציונלית, ולאחר מכן הרגישות שלהם מוערכת על ידי קביעת מספר עותקי RNA היעד לכל μL של RNA סינתטי שמתג toehold נתון יכול לזהות באופן מהימן כאשר הוא משולב עם הגברה איזותרמית. לאחר הגברה איזותרמית, בצע תגובות ללא תאים כדי לזהות קבוצות ראשוניות מוצלחות מבוססות רצף חומצות גרעין. עם זאת, ייתכן שיהיה חסכוני יותר להפעיל ג’לים פוליאקרילאמיד או אגרוז על תגובות הגברה מבוססות רצף חומצות גרעין כדי לצמצם תחילה את מאגר ערכות הפריימרים המועמדים. במקרה כזה, קבוצות פריימר הגברה מבוססות רצף חומצות גרעין שמייצרות פס על הג’ל בגודל האמפליקון המתאים יכולות להיות ברשימה קצרה להקרנה הבאה ללא תאים. הכינו תמיסת מלאי של 25 מיקרומטר של כל ערכות הפריימרים קדימה ואחורה במים נטולי נוקלאז (ראו פרוטוקול משלים). קבע את מספר תגובות ההגברה המבוססות על רצף חומצות גרעין ותגובות ללא תאים לאחר מכן שיש להגדיר. הדבר תלוי במספר מתגי ה-toehold וערכות הפריימר המתאימות.הערה: בעת סינון הפריימרים, חשוב תמיד לכלול פקד ללא תבנית עבור כל ערכת פריימרים כדי לקחת בחשבון את כל תוצרי הרקע שעלולים להיווצר עקב הגברה לא ספציפית הקשורה לפריימר. הגדר תגובה אחת של 5 μL באופן הבא (קנה מידה זה לפי הצורך). להפשיר את כל הריאגנטים על הקרח. הרכיבו תערובת מאסטר תגובה של מאגר התגובה, תערובת הנוקלאוטידים ומעכב RNase על פי טבלה 6. מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה עד שהמשקעים הלבנים מסיסים, ולאחר מכן מחלקים אליקוטים לצינורות PCR.אם תערובת האב מיועדת לסינון פריימרים המבוססים על רצף חומצות גרעין, אל תכלול את הפריימרים מהתערובת הראשית בהתחלה (יש להוציא 2.55 μL של תערובת מאסטר). אחרת, אם מבצעים ניתוח רגישות פריימר, ניתן לכלול את הפריימרים בתמהיל הראשי (ובמקרה זה יש לחלק 2.75 μL aliquots). מוסיפים את תערובת האנזימים לאחר שלבי הדנטורציה ושיווי המשקל. אם מסננים פריימרים המבוססים על רצף חומצות גרעין, הוסיפו את הפריימרים קדימה ואחורה לצינורות המתאימים. על מחזור תרמי, הגדר את פרוטוקול הדגירה כמתואר בטבלה 7. הוסיפו 1 μL של מים נטולי נוקלאז או 1 μL של RNA טריגר מטרה ב-2 pM או כ-10 6 עותקים/μL, והקפידו לסמן את הצינורות בהתאם. מערבבים על ידי צנרת עדינה ומסובבים לזמן קצר את הצינורות.הערה: עבור סינון ערכת פריימר, השתמש בריכוז של RNA טריגר מטרה שהוא גבוה מספיק כדי לא לפגוע בגבול התחתון של זיהוי שיטת ההגברה האיזותרמית, אך לא גבוה מספיק כדי לספק הפעלה של מתג ה-toehold אם לא תתרחש הגברה. העבר את הצינורות למחזור התרמי והתחל את הדגירה. לאחר 12 דקות, הסר את הצינורות והוסף 1.25 μL של תערובת האנזימים לכל צינור. מערבבים על ידי צנרת למעלה ולמטה וצנטריפוגה קצרה של הצינורות.הערה: בשלב זה, ניתן לשמור את הצינורות בטמפרטורת החדר; עם זאת, תערובת האנזימים צריכה להישמר על קרח עד להוספה לצינורות. החזירו את הצינורות למחזור התרמי, תוך דילוג על שלב ההחזקה של 41 מעלות צלזיוס כדי להתחיל את הדגירה של תגובה של שעה אחת.הערה: לאחר הדגירה, ניתן להניח את התגובות על קרח לעיבוד באותו יום או להקפיא בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לעיבוד מאוחר יותר. בצע את שלבים 6.2-6.7 וטבלה 8 כדי להרכיב תגובות מתג ללא תאים המבוססות על נייר כדי להעריך את ביצועי הפריימר. נתחו נתונים כמתואר בשלבים 7.1-7.2 ובאיור 3.הערה: בנוסף לפקדים שהוזכרו קודם לכן, חשוב לכלול גם את הבקרה השלילית כדי לקחת בחשבון כל אות רקע שעשוי לנבוע מהתגובה. בנוסף, חשוב לכלול גם בקרה עם המתג ו-2 pM (ריכוז סופי) של רנ”א מטרה, כבקרת הגברה ללא NASBA. זהה זוגות פריימרים מועמדים כדי להתקדם עם ניתוח רגישות. זוגות פריימרים נבחרים על סמך השאלה אם הפעלת מתג toehold מתרחשת בעקבות הוספת התגובה הדוגרת. במידת הצורך, חזור על מסך הפריימר עם שילובי פריימר נוספים. שמירה על דגימות RNA על קרח בכל עת, בצע את מערך הדילול הסדרתי הבא של רנ”א מטרה במים נטולי נוקלאז: 104, 103, 10 2, 101 ו- 100 עותקי RNA / μL. חזור על הגברה מבוססת רצף חומצות גרעין ותגובות ללא תאים עם ערכות הפריימר שנבחרו (שלבים 8.2-8.7), בדיקת סדרת הדילול הסדרתי על מנת לזהות את ערכות הפריימר המספקות את הרגישות הטובה ביותר. ראו איור 5 כדוגמה לתוצאות לקביעת הרגישות של קבוצת הפריימרים.הערה: באופן אידיאלי, מתג ה-toehold שנבחר וזוג הפריימרים צריכים לזהות עד 1-100 עותקי RNA יעד לכל μL של ה-RNA (ריכוז תמיסת מלאי). חזור על ניסוי הרגישות להגברה המבוססת על רצף חומצות גרעין במשולש ביולוגי. שלב זה משמש כדי לאשר את שכפול התוצאות לפני המעבר לניסויים עם דגימות המטופל. אופציונלי: כדי שיהיה מקור אמין לדנ”א של המתג לשימוש ארוך טווח ולהובלה, שכפלו את רצפי המתגים שנבחרו לפלסמיד באמצעות כל שיטת שיבוט קונבנציונלית. באופן דומה, ניתן גם לשכפל את רצף ה-RNA של טריגר המטרה לפלסמיד לבחירה לאחסון. רכיב נפח לכל תגובה ריכוז סופי מאגר התגובה של נאס”א 1.67 מיקרון פי 1 תערובת נוקלאוטידים של NASBA 0.833 מיקרון פי 1 פריימר קדמי 25 μM 0.1 מיקרון 0.5 מיקרומטר פריימר הפוך 25 μM 0.1 מיקרון 0.5 מיקרומטר מעכב RNase (40 U/μL) 0.05 מיקרון 0.4 U/μL רנ”א מטרה 1 מיקרון תערובת אנזימים NASBA 1.25 מיקרון ליטר פי 1 נפח כולל 5 מיקרון טבלה 6: רכיבי התגובה של NASBA. צעד טמפרטורה זמן דנטורציה 65 °C 2 דק’ שיווי משקל 41 מעלות צלזיוס 10 דק’ אחז 41 מעלות צלזיוס ∞ דגירה 41 מעלות צלזיוס 1 שעה אחז 4 °C – טבלה 7: תנאי התגובה של ה-NASBA. רכיב נפח ריכוז סופי לכל תגובה פתרון א’ 2.38 מיקרון ליטר 40% פתרון ב’ 1.78 מיקרון 30% מעכב RNase 0.03 מיקרון 0.5% v/v החייאה (25 מ”ג/מ”ל) 0.14 מיקרון 0.6 מ”ג/מ”ל מתג טוהולד X μL 33 נאנומטר רנ”א מטרה (אם רלוונטי) X μL 1 מיקרומטר נאס”א (אם רלוונטי) 0.85 מיקרון 1:7 מים נטולי נוקלאז עד 5.94 מיקרון – נפח כולל: 5.94 מיקרון טבלה 8: רכיבי תגובה נטולת תאים מבוססי נייר. 9. איסוף דגימות מטופלים ומיצוי RNA ויראלי הערה: סעיף זה מתאר את הפרוטוקול לאיסוף דגימות מטופלים ולחילוץ הרנ”א באמצעות ערכת טיהור RNA. הפרוטוקול שלהלן משמש לקבלת סרום מדם היקפי. הדגימות ששימשו במחקר זה נאספו מחולים המציגים חום, אקסנתמה, ארתרלגיה או תסמינים קשורים אחרים של זיהום arbovirus במדינת פרנמבוקו, ברזיל. לאסוף דגימות דם היקפיות מחולים החשודים כנגועים בארבו-וירוס. בצע venipuncture (צינור דם שלם) באמצעות טכניקה אספטית סטנדרטית. תייג את צינורות הדגימה עם קוד אנונימי ואת תאריך איסוף הדגימה. דם צנטריפוגה כדי להפריד את הסרום ב 2,300 x גרם במשך 10 דקות. באמצעות פיפטה, הכינו אליקוטים של סרום (200 μL) שישמשו להפקת RNA בצינורות 1.5 מ”ל.הערה: אם לא ניתן לבצע את מיצוי הרנ”א זמן קצר לאחר איסוף הדגימה, יש לאחסן דגימות סרום בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לפני יישומים במורד הזרם. פיפטה 560 μL של Buffer AVL מוכן (חיץ ליזיס ויראלי) המכיל את הרנ”א המוביל לתוך צינור 1.5 מ”ל. הוסיפו 140 מיקרוגרם של סרום לתערובת ה-RNA של Buffer AVL/carrier בצינור. מערבבים על ידי מערבולת דופק במשך 15 שניות. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן צנטריפוגה קצרה את הדגימה כדי לאסוף את התוכן בתחתית הצינור. הוסיפו 560 μL של אתנול (96%-100%) לדגימה וערבבו לפי מערבולת דופק במשך 15 שניות. לאחר הערבוב, צנטריפוגה את הדגימה כדי לאסוף את התוכן בתחתית הצינור. הוסיפו בזהירות 630 μL של התמיסה משלב 9.4 לעמוד הספין מבלי להרטיב את החישוק. לאחר שלב זה, סגור את המכסה, וצנטריפוגה ב 6,000 x גרם למשך דקה אחת. הכניסו את עמוד הספין לצינור איסוף נקי של 2 מ”ל והשליכו את צינור האיסוף המשומש המכיל את הסינון. פתח בזהירות את עמודת הסיבוב וחזור על שלב 9.5. פתחו בזהירות את עמודת הספין והוסיפו 500 מיקרון של Buffer AW1 (מאגר כביסה 1). סגור את המכסה, וצנטריפוגה בגודל 6,000 x g למשך דקה אחת. הכניסו את עמוד הספין לצינור איסוף נקי של 2 מ”ל והשליכו את צינור האיסוף המשומש המכיל את הסינון. פתח בזהירות את עמודת הסיבוב והוסף 500 μL של Buffer AW2 (מאגר כביסה 2). סגרו את המכסה ואת הצנטריפוגה ב-20,000 x גרם למשך 3 דקות. הכניסו את עמוד הספין לצינור איסוף נקי של 2 מ”ל, והשליכו את צינור האיסוף המשומש המכיל את הסינון. כדי למנוע זיהום על ידי חיץ שיורי AW2, שעלול לגרום לבעיות בתגובות אנזימטיות במורד הזרם, הנח את עמוד הספין לתוך צינור איסוף נקי של 2 מ”ל והשלך את צינור האיסוף המשומש עם התנין. צנטריפוגה ב 20,000 x גרם במשך דקה אחת. מניחים את עמוד הספין בצינור נקי של 1.5 מ”ל ומשליכים את צינור האיסוף המשומש עם התנין. פתח בזהירות את עמודת הספין והוסף 60 μL של Buffer AVE (חיץ אלוטיון) בשיווי משקל לטמפרטורת החדר. לאחר שלב זה, סגרו את הפקק, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. צנטריפוגה ב-6,000 x גרם למשך דקה. לאחר מכן ניתן להשתמש ב-RNA המלוטש כקלט עבור ה-NASBA וה-RT-qPCR במקביל. בצע את שלבים 8.3 עד 8.11 כדי לבצע הגברה מבוססת רצף חומצות גרעין ותגובות מבוססות נייר ללא תאים באמצעות 1 μL של RNA המטופל שחולץ, תוך הקפדה לכלול תגובות בקרה שליליות וחיוביות. לאחר התגובות, הכינו את לוחית התגובה בעלת 384 הבארות והפעילו את הבדיקה במכשיר קורא הצלחות הנייד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (ראו פירוט בפרוטוקול המשלים).הערה: שני ריכוזי RNA של 104 ו-102 PFU/mL, המופקים מנגיף זיקה בתרבית, משמשים כבקרות חיוביות לכל הניסויים במהלך האימות הקליני. בנוסף לפקדים שהוזכרו קודם לכן, חשוב לכלול גם את ההדק (10 ng/μL) כבקרה חיובית. בסוף כל ניסוי, ניתן להעלות את הנתונים הגולמיים (קובץ .csv) מקורא לוחות המחוונים למסד נתונים מאובטח באינטרנט. בנוסף, קורא הצלחות הנייד מפיק דוח המציין אם הדגימות חיוביות או שליליות לנגיף זיקה (איור 6); עיין בסעיף התוצאות המייצגות לקבלת דוגמאות של כל הגרפים שהתקבלו במהלך הדגירה (איור 7).הערה: משתמשים יכולים גם להעביר קבצים מקורא הצלחות הנייד למחשב שלהם באמצעות ה-USB. 10. מכשיר קורא צלחות נייד מכשיר קורא הצלחות הנייד (איור 8) יכול לשמש כחלופה לקורא צלחותרגיל 24. לקבלת הפרוטוקול והתוצאות המייצגות, ראה פרוטוקול משלים. 11. RT-qPCR לזיהוי וירוס זיקה הערה: סעיף זה מתאר את השלבים לביצוע RT-qPCR לזיהוי וירוס זיקה מדגימות מטופלים (ראה פרוטוקול משלים). כדי למנוע זיהום, הרכיבו את רכיבי RT-qPCR באזור מבודד מתהליך ההגברה (למשל, מכסה מנוע נקי). הניחו את מאגר RT-qPCR, האנזימים והפריימר/בדיקות על קרח או על בלוק קר. לאחר מכן, הוסיפו את התגובות לצלחת של 384 בארות על קרח לפי טבלה 9.הערה: בקרה שלילית (בקרת מיצוי ובקרה שאינה תבנית [NTC]) ובקרה חיובית (104 PFU/mL) מומלצות לכל הניסויים. לאחר הוספת הריאגנטים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ”ל, ערבבו את התגובה על ידי צנרת למעלה ולמטה (אל תערבבו), והעבירו 6.5 μL לכל באר. הוסף 3.5 μL מכל תבנית RNA במשולש. הניחו סרט PCR מעל החלק העליון של הצלחת. צנטריפוגה צלחת 384-באר ב 600 x גרם במשך 2 דקות. הנח את הלוחית במכונת RT-qPCR באמצעות תנאי המחזור הבאים המתוארים בטבלה 10. כדי לנתח את התוצאות, השתמש בתוכנת התכנון והניתוח של מכונת RT-qPCR ושקול את הסף והבסיס האוטומטיים (ראה פרטים בפרוטוקול המשלים). רכיב נפח ריכוז 2X QuantiNova Probe RT-PCR מאסטר מיקס 5 מיקרון פי 1 פריימר קדמי 100 μM 0.08 מיקרון 0.8 מיקרומטר פריימר הפוך 100 μM 0.08 מיקרון 0.8 מיקרומטר 25 מיקרומטר בדיקה 0.04 מיקרון 0.1 מיקרומטר QuantiNova ROX צבע ייחוס 0.05 מיקרון פי 1 QuantiNova Probe RT Mix 0.1 מיקרון פי 1 תבנית RNA 3.5 מיקרון – מים נטולי נוקלאז עד 10 מיקרון – טבלה 9: רכיבי RT-qPCR להגברת RNA של נגיף זיקה בהתבסס על פרוטוקול המרכז לבקרת מחלות ומניעתן-CDC ארה”ב לזיהוי נגיף זיקה מדגימות חולים31. צעד טמפרטורה זמן תמלול לאחור 45 מעלות צלזיוס 15 דק’ שלב ההפעלה הראשונית של PCR 95 °C 5 דק’ 45 מחזורים דנטורציה 95 °C 5 שניות חישול/הארכה משולבים 60 מעלות צלזיוס 45 שניות טבלה 10: תנאי מחזור עבור RT-qPCR.