Design-to-Implementierungsstudie zur Entwicklung und Patientenvalidierung der papierbasierten Zehenschalterdiagnostik

Alle Verfahren, an denen menschliche Teilnehmer beteiligt sind, müssen in Übereinstimmung mit ethischen Standards und einschlägigen Richtlinien durchgeführt werden, einschließlich der ethischen Grundsätze für medizinische Forschung am Menschen, die in der Erklärung des Weltärztebundes von Helsinki festgelegt wurden. Diese Studie wurde von der Ethikkommission für Humanforschung unter der Lizenzprotokollnummer CAAE: 80247417.4.0000.5190 genehmigt. Das Fiocruz-PE Institutional Review Board (IRB) verzichtete auf die Einwilligung nach Aufklärung aller Patienten, die in diese Studie einbezogen wurden, für diagnostische Proben. HINWEIS: Das PLUM-Gerät wird im Folgenden als “tragbares Plattenlesegerät” bezeichnet. 1. Computergestütztes Design von Nukleinsäuresequenz-basierten Amplifikationsprimern Scannen Sie das Zika-Genom, um eine Reihe von Kandidatenregionen für die Amplifikation zu identifizieren, die etwa 200 Nukleotide (nt) bis 300 nt lang sind, indem Sie die genomische Sequenz in NCBI / Nukleotid BLAST25,26 einfügen. Vergleichen Sie das Genom mit Referenz-RNA-Sequenzen (refseq_rna) und suchen Sie nach Stellen, die hochkonserviert bleiben und keine Homologie mit dem menschlichen Genom aufweisen (andere BLAST-Parameter bleiben unverändert). Wählen Sie mindestens zwei Standorte aus, um den synthetischen Zehenhalteschalter zu entwerfen. Verwenden Sie die Auswahlkriterien von Deiman et al.27 , um Paare von vorwärts- und rückwärts Nukleinsäuresequenz-basierten Amplifikationsprimern für jede mögliche Amplifikationsregion zu generieren. Kurz gesagt, befolgen Sie diese Kriterien für die Gestaltung von Primern: (1) GC-Gehalt zwischen 40% -60%; (2) 20 bis 24 nt lang mit DNA-Schmelztemperatur über 41 °C; (3) keine Läufe von vier oder mehr identischen Nukleotiden; (4) das letzte 3′-Nukleotid ist eine A-Base; (5) geringe Wahrscheinlichkeit der Primer-Sekundärstruktur und Dimerbildung. Bildschirm 8-10 Primerpaare für jede Zielregion (empfohlen). Die Präfixsequenz, die die T7-Promotorsequenz AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG (T7-Promotorsequenz unterstrichen) enthält, wird an das 5′-Ende der Vorwärtsprimer angehängt, um die Transkription der Amplicons unter Verwendung der T7-RNA-Polymerase (RNAP) zu ermöglichen. Bestellen Sie die Primer als DNA-Oligos bei einem DNA-Syntheseunternehmen. 2. Computergestütztes Design von Zehenhalteschaltern Installieren Sie NUPACK28 Version 3.2 (Nukleinsäure-Design-Suite) basierend auf den Anweisungen auf der Website29. Verwenden Sie ein UNIX-Betriebssystem und MATLAB (Numeric Computing Platform) als Programmiersprache (empfohlen). Identifizieren Sie die Zielsequenzen (z. B. virales Genom), die spezifisch für den Erreger sind, der für die Zehenschalterdesigns von Interesse ist, wie in Schritt 1.1. Wählen Sie die Zika-Zielsequenzen aus den in Schritt 1.2 generierten Nukleinsäuresequenz-basierten Amplikons aus.HINWEIS: In der Praxis können je nach Bedarf der Benutzer entweder die auf Nukleinsäuresequenz basierenden Amplifikationsprimer oder die synthetischen Zehenhalteschalter zuerst entworfen und getestet werden. Wenn bestimmte Zielregionen von Interesse bereits festgelegt wurden (z. B. aus bestehenden Publikationen oder Diagnoseprotokollen), kann zuerst das Design und Screening von Zehengriffschaltern erfolgen, gefolgt von Design und Screening für nukleinsäuresequenzbasierte Amplifikationsprimer. Wenn es keine festgelegten Zielregionen gibt, screenen Sie zunächst Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikationsprimer gegen das vollständige Genom, um die Ziele der Wahl einzugrenzen, während Sie für die Effizienz der Primeramplifikation auswählen. Wenn mehrere Sequenzen für den Erreger verfügbar sind, ist es am besten, nukleinsäuresequenzbasierte Amplifikationsprimer zu entwerfen, die sich auf hochkonservierte Regionen konzentrieren (anstatt das gesamte Genom zu untersuchen). Laden Sie die erforderliche MATLAB-Software herunter und installieren Sie sie auf dem Computer. Richten Sie die Umgebungsvariablen so ein, dass die Funktionen der Nukleinsäure-Designsuite in der Software aufgerufen werden können. Öffnen Sie dazu die Software, und öffnen (oder erstellen) Sie dann eine Datei startup.m im Standardarbeitsordner. Kopieren Sie als Nächstes die folgenden Codezeilen in die Datei startup.m, und fügen Sie schließlich den Ordner mit den Binärdateien der Nucleic Acid Design Suite zum PATH hinzu:NUPACKINSTALL = ‘/Benutzer/[user_name]/…/nupack3.2.2’;setenv(‘NUPACKINSTALL’,NUPACKINSTALL);setenv(‘PATH’,[getenv(‘PATH’),sprintf(‘:%s/build/bin’,NUPACKINSTALL)]); Öffnen Sie die Numeric Computing Platform-Software, und navigieren Sie zum Ordner Design Software. Führen Sie die Entwurfsalgorithmen aus, auf die auf https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN zugegriffen werden kann. Geben Sie die Zielsequenzen in die design_input_file.csv ein, die sich im Eingabeunterordner befindet. Zu den Eingaben gehören Name, äußere Sequenz, innere Sequenz, Temperatur, Ausgabename und Ausgabesequenz, wie in Tabelle 1 definiert. Wenn noch keine Grundierungsstellen für das Ziel festgelegt sind, halten Sie innere und äußere Sequenzen gleich. Nur die ersten 29 nt des Reporters werden während des Designprozesses berücksichtigt. Wenn Sie fertig sind, speichern und schließen Sie die aktualisierte Tabelle.HINWEIS: Die Ausgabesequenz ist die Sequenz des Reporterproteins, das für den Assay verwendet werden soll (z. B. lacZ). Durch die Angabe der inneren und äußeren Sequenzen wird sichergestellt, dass der Algorithmus keine synthetischen Zehenhalteschalter erzeugt, die sich mit einem der Primer überlappen. Es stellt auch sicher, dass der Assay drei einzigartige Stellen im Zika-Genom erkennt, um seine Spezifität zu verbessern. Wählen Sie die Parameter aus, die für die Designfunktion verwendet werden sollen: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file, Optionen). Füllen Sie die Parameterwerte wie folgt aus:num_designs – die Anzahl der Top-Designs für jede Zielausgabe durch die Software. Der Standardwert ist 6 und kann bei Bedarf geändert werden (mindestens sechs Designs für jedes Ziel werden empfohlen). input_file – Dieser Parameter gibt den Namen der Datei an, die die Eingabesequenzinformationen bereitstellt. Der Standardwert ist ‘design_input_file.csv’ und kann bei Bedarf geändert werden. Wählen Sie aus den folgenden Optionen – (1) SerieA und SerieB: die Version(en) des Zehenschalters, die der Code generiert. Setzen Sie SeriesB auf 1 und SeriesA auf 0, um den Zehenschalter der Serie B zu generieren, das das Format ist, das in der Zika-Virusdiagnose6 verwendet wird. (2) Parallel: auf 1 gesetzt, um mehrere Kerne zur Berechnung der Designs zu nutzen; Andernfalls auf 0 gesetzt. (3) Antisense: auf 1 gesetzt, um Zehengriffschalter zu erzeugen, die die Antisense-Sequenz (d.h. das umgekehrte Komplement) des Zieleingangs hybridisieren; Andernfalls auf 0 festgelegt. Führen Sie die Designfunktion mit den ausgewählten Parametern aus: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file,options). Der Algorithmus beginnt dann, die Zehenhalteschalterdesigns für die interessierenden Ziele zu generieren. Suchen Sie nach Abschluss des Entwurfs die Designsequenzen des oberen Zehenschalters und die entsprechenden Zielsequenzen im Ordner final_designs in Form von Tabellen im .csv Format. Die vom Algorithmus erzeugten Zehenschalter-DNA-Sequenzen enthalten die T7-Promotorsequenz am 5′-Ende und die konservierte 21-nt-Linkersequenz AACCTGGCGGCAGCGCAAAG am 3′-Ende. Screenen Sie die resultierenden Top-Toehold-Switch-Designsequenzen gegen andere gängige Viren, indem Sie sie auf NCBI-BLAST legen und auf Sequenzhomologie prüfen. Akzeptieren Sie Sequenzen mit 40% Homologie oder weniger. Ordnen Sie die Zehenschalter-Haarnadelsequenzen als DNA-Oligos an und setzen Sie sie später mit dem Reportergen zu voll funktionsfähigen Schaltern zusammen. Bestellen Sie die notwendigen PCR-Primer für die anschließende Sensormontage in Abhängigkeit vom Reporterprotein Ihrer Wahl. Parameter Definition Name Die gewünschten Namen der Ausgangs-Zehenschaltersequenzen. Äußere Sequenz Vollständiges NASBA-Transkript aus Amplifikation. Innere Reihenfolge Die äußere Sequenz ohne die Primerbindungsstellen. Es stimmt mit der äußeren Sequenz überein, schließt jedoch die Teile der Transkripte aus, die an die Vorwärts- und Rückwärtsprimer binden. Temperatur Die Temperatur, die von den Algorithmen verwendet wird, um die RNA-Strukturen zu berechnen. Name der Ausgabe Der Name des Ausgangsgens (z. B. lacZ, gfp). Ausgabereihenfolge Die Sequenz des Ausgabegens. Tabelle 1: Die Definition der einzelnen Parameter, die in der Toehold Switchdesign Software verwendet werden. 3. Konstruktion von Zehengriffschaltern mittels PCR HINWEIS: Diese Schritte beschreiben den Aufbau von LacZ-Zehenschaltern mittels Überlappungsverlängerungs-PCR. Hier wird der DNA-Oligo als Vorwärtsprimer und der T7-Terminator als Reverse-Primer verwendet. Wir verwenden das pCOLADuet-LacZ-Plasmid als Vorlage für das lacZ-Gen (addgene: 75006). Alle anderen DNA-Vorlagen, die die entsprechende Sequenz enthalten, können als Vorlagen verwendet werden, sofern der T7-Terminator im endgültigen Konstrukt enthalten ist. Sobald synthetische DNA-Oligos vom kommerziellen Anbieter erhalten wurden, werden Lösungen der synthetischen DNA und des Reverse-Amplifikationsprimers in einer Konzentration von 10 μM in nukleasefreiem Wasser hergestellt. Reaktionen in PCR-Röhrchen auf Eis gemäß Tabelle 2 zusammensetzen.HINWEIS: PCR-Volumina können nach Bedarf skaliert werden. Verwenden Sie eine minimale Menge (0,1-1 ng) der pCOLADuet-LacZ-DNA-Vorlage, um die Notwendigkeit eines zusätzlichen Plasmidentfernungsschritts oder Hintergrund-LacZ-Signals zu vermeiden. Für höhere DNA-Vorlagenmengen folgen Sie der PCR mit einem DpnI-Restriktionsenzymverdauen, um die Restplasmidvorlage zu entfernen. Legen Sie die Reaktionen gemäß den in Tabelle 3 aufgeführten Zyklusbedingungen in einen Thermocycler. Analysieren Sie die PCR-Produkte auf einem Agarosegel (Abbildung 2; siehe Zusatzprotokoll und30). Reinigen Sie die PCR-Produkte mit einem Spinsäulen-basierten PCR-Aufreinigungskoffer und eluieren Sie die DNA in 15-30 μL nukleasefreiem Wasser gemäß den Anweisungen des Herstellers. Quantifizieren Sie die DNA mit einem Spektralphotometer. Bestandteil Volumen Konzentration 5X Q5 Reaktionspuffer 10 μL 1x 10 mM dNTPs 1 μL 200 μM 10 mM Forward Primer (synthetischer Switch DNA FW) 2,5 μL 0,5 μM 10 mM Reverse Primer (T7 Terminator RV) 2,5 μL 0,5 μM Template-DNA (pCOLADuet-LacZ) Variable <1 ng Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase 0,5 μL 0,02 U/μL Nukleasefreies Wasser bis 50 μL – Tabelle 2: Die PCR-Komponenten, die zur Konstruktion von Zehenschaltern verwendet werden. Schritt Temperatur Zeit Erste Denaturierung 98 °C 30 s 35 Zyklen Denaturierung 98 °C 10 s Glühen 60 °C 20 s Erweiterung 72 °C 1.45 min Endgültige Verlängerung 72 °C 5 Minuten Halten 4 °C – Tabelle 3: Zyklische Bedingungen, die beim Bau von Zehenhalteschaltern mittels PCR verwendet wurden. 4. Vorbereitung des synthetischen RNA-Targets (Trigger) Modifizieren Sie mithilfe einer molekularbiologischen Designsoftware die synthetischen Trigger-RNA-Vorlagen (ausgewählt in Schritt 1.1), um eine vorgeschaltete T7-Promotorsequenz aufzunehmen, um sicherzustellen, dass die vollständige Vorlage kurz bleibt (<200 bp). Entwerfen Sie Vorwärts- und Rückwärtsprimer, um den Triggersequenzprimer zu verstärken (für Oligosequenzen siehe Zusatzprotokoll). Ordnen Sie die Sequenzen als DNA-Oligos. Nach Erhalt rekonstituieren Sie die synthetische Trigger-DNA und Amplifikationsprimer auf 10 μM in nukleasefreiem Wasser. Die entsprechenden PCRs werden in dünnwandigen Röhrchen auf Eis gemäß Tabelle 2 zusammengesetzt und 0,5 μL des Trigger-DNA-Ultramers (Endkonzentration von 0,1 μM) als Template-DNA verwendet. Legen Sie die Reaktionen in einen Thermocycler und verwenden Sie die in Tabelle 3 aufgeführten Zyklusbedingungen. Verwenden Sie eine Verlängerungszeit von 15 s. Bewerten Sie die Qualität und reinigen Sie PCR-Produkte, wie in Schritt 3.3 und Zusatzprotokoll beschrieben.HINWEIS: Um den Prozess zu beschleunigen, können säulengereinigte Trigger-PCR-Produkte auch direkt für das erste Zehenhalteschalter-Screening verwendet werden. 5. In-vitro-Transkription ausgewählter Triggersequenzen Reaktionskomponenten auf Eis gemäß Tabelle 4 zusammenbauen. Inkubieren von I-n-vitro-Transkriptionsreaktionen (IVT) bei 37 °C für 4 h, gefolgt von einer DNase-I-Behandlung, um dieTemplate-DNA zu entfernen. Für den DNase I-Schritt fügen Sie 70 μL nukleasefreies Wasser, 10 μL 10x DNase I Buffer und 2 μL DNase I (RNase-frei) hinzu und inkubieren bei 37 °C für 15 min. Wenn Sie nicht sofort mit Schritt 5.4 fortfahren, inaktivieren Sie DNase I mit der Zugabe von 50 mM EDTA und Wärmeinaktivierung bei 65 °C für 10 min. Optionaler Schritt: Führen Sie eine denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Analyse (z. B. Harnstoff-PAGE) an den IVT-Produkten durch, um die RNA-Qualität wie im Zusatzprotokoll beschrieben zu beurteilen. Reinigen Sie die Trigger-IVT-Produkte mit einem säulenbasierten RNA-Cleanup-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers und quantifizieren Sie dann die RNA-Konzentration und -Reinheit mittels Spektrophotometrie. Anweisungen zur Bestimmung der Molarität und Kopienzahl/μL der RNA finden Sie im Zusatzprotokoll . Bestandteil Volumen Konzentration 10X Reaktionspuffer 1,5 μL 0,75x 25 mM NTP-Mischung 6 μL 7,5 mM Template-Trigger-DNA X μL 1 μg T7-RNA-Polymerase-Mix 1,5 μL – Nukleasefreies Wasser X μL Bis 20 μL Tabelle 4: In-vitro-Transkription (IVT) ausgewählter Triggersequenzen. 6. Erstprüfung der Schalter HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Schritte beschrieben, die mit der Einrichtung von zellfreien, papierbasierten Zehenschalterreaktionen verbunden sind, und wie Sie nach leistungsstarken Zehenschaltern suchen. Das in Schritt 6.10 verwendete BSA-blockierte Filterpapier sollte im Voraus wie im Zusatzprotokoll beschrieben vorbereitet werden. Bereiten Sie eine CPRG-Stammlösung vor, indem Sie 25 mg des Pulvers in 1 ml nukleasefreiem Wasser auflösen. Bewahren Sie die Lösung immer auf Eis auf und lagern Sie sie bei -20 °C für eine langfristige Anwendung. Bestimmen Sie die Anzahl der einzurichtenden Reaktionen. Fügen Sie für jeden bewerteten Zehengriffschalter eine No-Template-Kontrolle (kein Schalter und keine Ziel-RNA – auch bekannt als zellfreie Alleinkontrolle) hinzu, um jedes Hintergrundsignal zu berücksichtigen, das aus dem Master-Mix entstehen kann. Fügen Sie eine Schaltersteuerung hinzu, um die Leckigkeit des Hintergrundschalters oder die OFF-Rate in Abwesenheit von Ziel-RNA zu beurteilen. Eine zellfreie Reaktionsmastermischung aus Lösung A, Lösung B, RNase-Inhibitor und CPRG wird gemäß dem in Tabelle 5 aufgeführten Standardprotokoll auf Eis zusammengestellt.HINWEIS: Die hier beschriebenen Schritte gelten für eine Mastermischung, die für einen dreifachen Satz von 1,8 μL-Reaktionen mit zusätzlichem 10%-Volumen ausreicht, um den Pipettierfehler zu berücksichtigen. Die Master-Mix-Lautstärke sollte je nach Anzahl der abgeschirmten Zehenschalter nach Bedarf angepasst werden. Für jede dreifache zellfreie Reaktion die Mastermischung in ein PCR-Röhrchen geben und alle Röhrchen auf Eis halten. Für das Röhrchen, das als zellfreie alleinige Kontrolle beiseite gelegt wird, fügen Sie nukleasefreies Wasser zu einem Endvolumen von 5,84 μL hinzu, mischen Sie durch Pipettieren auf und ab und zentrifugieren Sie kurz. Für den Rest der Röhrchen fügen Sie PCR-gereinigte Zehenschalter-DNA zu einer Endkonzentration von 33 nM hinzu. Für Röhrchen, die als Schalter allein vorgesehen sind, fügen Sie nukleasefreies Wasser zu einem Endvolumen von 5,84 μL hinzu. Für Röhrchen, die zum Testen der Zehengriffschalter- und Ziel-RNA-Kombination beiseite gelegt werden, fügen Sie in vitro transkribierte Ziel-RNA zu einer Endkonzentration von 1 μM hinzu. Dann fügen Sie nukleasefreies Wasser zu einem Endvolumen von 5,84 μL hinzu. Mischen Sie alle Reaktionen gründlich, indem Sie auf und ab pipettieren, und zentrifugieren Sie kurz. Fügen Sie 30 μL nukleasefreies Wasser in die Vertiefungen rund um die Reaktionstöpfe auf einer schwarzen 384-Well-Platte mit klarem Boden hinzu. Dies minimiert die Verdunstung im Verlauf des Experiments und verbessert die Reproduzierbarkeit.HINWEIS: Wenn Sie das tragbare Plattenlesegerät verwenden, legen Sie eine PCR-Folie über die Platte und schneiden Sie mit einem Präzisionsmesser die für Ihre Reaktion vorgesehenen Vertiefungen sowie jede der vier Eckmulden aus. Die PCR-Folie verhindert die Überbelichtung der tragbaren Plattenleserkamera aus leeren Vertiefungen. Schneiden Sie BSA-blockierte Filterpapierscheiben mit einem 2-mm-Biopsiestempel und einer Pinzette in die Reaktionsmulden und legen Sie sie entweder durch Auswerfen des Stempels oder mit einer Pinzette in die Reaktionsmulden (siehe Zusatzprotokoll zur Herstellung von BSA-blockiertem Filterpapier). Geben Sie dreifache 1,8-μL-Volumina aus jedem Reaktionsröhrchen auf die Filterpapierscheiben in der 384-Well-Platte, wobei alle Proben sowie die 384-Well-Platte jederzeit auf Eis bleiben.HINWEIS: Wenn Sie das tragbare Plattenlesegerät verwenden, fügen Sie 1,8 μL CPRG (0,6 mg/ml) zu jeder der vier Ecken der 384-Well-Platte hinzu. Die gelbe Farbe des CPRG bietet Mustererkennung für den tragbaren Plattenleser zur Ausrichtung der digitalen Multiwell-Plattenvorlage in der Bildanalyse. Decken Sie die Vertiefungen der Platte mit PCR-Film ab, um eine Verdunstung zu verhindern. Legen Sie die Platte in ein Plattenlesegerät, lesen Sie OD570 bei 37 °C alle min für 130 min. Bestandteil Volumen Endkonzentration pro Reaktion Lösung A 2,38 μL 40% Lösung B 1,78 μL 30% RNase-Inhibitor 0,03 μL 0,5% v/v CPRG (25 mg / ml) 0,14 μL 0,6 mg/ml Zehenschalter X μL 33 nM Ziel-RNA X μL 1 μM Nukleasefreies Wasser bis 5,94 μL – Gesamtvolumen: 5,94 μL Tabelle 5: PURExpress-zellfreie Transkriptions-Translationsreaktionskomponenten. 7. Identifizieren von leistungsstarken Zehenhalteschaltern HINWEIS: In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie Sie Daten aus Schritt 6 analysieren, um die leistungsstärksten Zehenschalter auszuwählen. Beginnen Sie mit der Datenanalyse, indem Sie zunächst die OD570-Absorption im Hintergrund normalisieren. Um dies zu tun, subtrahieren Sie die OD 570-Messungen von Reaktionen, die keine Schalter- oder Ziel-RNA haben (d.h. zellfreie Alone-Wells) von den anderen OD570-Messungen. Glätten Sie die normalisierten Daten mit einem gleitenden Drei-Punkte-Durchschnitt und stellen Sie den Mindestwert jedes Wells auf Null ein. In Abbildung 3 sehen Sie ein Beispiel für normalisierte Zeitverlaufsdaten, die für die Zehenhalteschalter 27B, 33B und 47B erfasst wurden. Berechnen Sie anhand dieser verarbeiteten Daten die Faltenänderung (oder das ON/OFF-Verhältnis), indem Sie die Differenz in der Farbänderungsrate (d. h. Änderung des OD570 im Laufe der Zeit) zwischen dem Zehenhalteschalter und den Ziel- und Schalterwells allein bestimmen (siehe Zusatzprotokoll zur Berechnung des Verhältnisses ; Abbildung 4). Wählen Sie Schalter mit dem höchsten ON/OFF-Faltwechsel zur weiteren Charakterisierung. Lassen Sie die schlecht funktionierenden Zehenhalteschalter weg, die die niedrigste Faltänderung anzeigen. 8. Nukleinsäuresequenz-basiertes Amplifikationsprimer-Screening und Empfindlichkeit HINWEIS: In den folgenden Schritten wird zuerst ein Screening auf funktionelle isotherme Amplifikationsprimer durchgeführt, und dann wird ihre Empfindlichkeit bewertet, indem die Anzahl der Ziel-RNA-Kopien pro μL synthetischer RNA bestimmt wird, die ein bestimmter Zehengriffschalter zuverlässig erkennen kann, wenn er mit isothermer Amplifikation gekoppelt ist. Führen Sie nach der isothermen Amplifikation zellfreie Reaktionen durch, um erfolgreiche Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikationsprimer-Sets zu identifizieren. Es kann jedoch kostengünstiger sein, Polyacrylamid- oder Agarosegele auf Nukleinsäuresequenz-basierten Amplifikationsreaktionen laufen zu lassen, um zunächst den Pool der Kandidatenprimer-Sets einzugrenzen. In diesem Fall können nukleinsäuresequenzbasierte Amplifikationsprimer-Sets, die eine Bande auf dem Gel in der entsprechenden Amplikongröße erzeugen, für ein anschließendes zellfreies Screening in die engere Wahl gezogen werden. Aus allen Vorwärts- und Rückwärtsprimersätzen wird eine 25-μM-Stammlösung in nukleasefreiem Wasser hergestellt (siehe Zusatzprotokoll). Bestimmen Sie die Anzahl der auf Nukleinsäuresequenzen basierenden Amplifikationsreaktionen und nachfolgender zellfreier Reaktionen, die eingerichtet werden müssen. Dies hängt von der Anzahl der Zehenhalteschalter und den jeweiligen Primer-Sets ab.HINWEIS: Beim Screening der Primer ist es wichtig, für jeden Primersatz immer ein No-Template-Steuerelement einzuschließen, um Hintergrundartefakte zu berücksichtigen, die aufgrund einer unspezifischen Verstärkung im Zusammenhang mit dem Primer auftreten können. Richten Sie eine 5-μL-Reaktion wie folgt ein (skalieren Sie diese nach Bedarf). Alle Reagenzien auf Eis auftauen. Eine Reaktionsmastermischung aus Reaktionspuffer, Nukleotidmischung und RNase-Inhibitor wird gemäß Tabelle 6 zusammengestellt. Mischen Sie gründlich, indem Sie auf und ab pipettieren, bis der weiße Niederschlag gelöst ist, und geben Sie dann Aliquots in PCR-Röhrchen ab.Wenn die Mastermischung für das Screening von Nukleinsäuresequenz-basierten Amplifikationsprimern bestimmt ist, schließen Sie die Primer zunächst aus der Mastermischung aus (2,55 μL Master-Mix abgeben). Andernfalls, wenn eine Primersensitivitätsanalyse durchgeführt wird, können die Primer in die Mastermischung aufgenommen werden (in diesem Fall 2,75 μL Aliquots abgeben). Fügen Sie die Enzymmischung nach den Denaturierungs- und Gleichgewichtsphasen hinzu. Wenn Sie Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikationsprimer untersuchen, fügen Sie die Vorwärts- und Rückwärtsprimer zu den entsprechenden Röhrchen hinzu. Richten Sie auf einem Thermocycler das Inkubationsprotokoll wie in Tabelle 7 beschrieben ein. Fügen Sie 1 μL entweder nukleasefreies Wasser oder 1 μL Zieltrigger-RNA bei 2 pM oder etwa 106 Kopien/μL hinzu, wobei Sie die Röhrchen entsprechend kennzeichnen. Durch vorsichtiges Pipettieren mischen und die Röhrchen kurz herunterschleudern.HINWEIS: Verwenden Sie für das Primer-Set-Screening eine Konzentration der Zieltrigger-RNA, die hoch genug ist, um nicht auf die untere Nachweisgrenze der isothermen Amplifikationsmethode zu treffen, aber nicht hoch genug, um den Zehenhalteschalter zu aktivieren, wenn keine Amplifikation stattfinden würde. Bewegen Sie die Röhrchen zum Thermocycler und starten Sie die Inkubation. Nach 12 min die Röhrchen entfernen und 1,25 μL der Enzymmischung zu jedem Röhrchen geben. Durch Pipettieren auf und ab mischen und die Röhrchen kurz zentrifugieren.HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Rohre bei Raumtemperatur aufbewahrt werden; Die Enzymmischung sollte jedoch auf Eis gehalten werden, bis sie in die Röhrchen gegeben wird. Bringen Sie die Röhrchen zum Thermocycler zurück und überspringen Sie den 41 °C Hold-Schritt, um die 1-stündige Reaktionsinkubation zu starten.HINWEIS: Nach der Inkubation können die Reaktionen zur Verarbeitung am selben Tag auf Eis gelegt oder für die spätere Verarbeitung bei -20 °C eingefroren werden. Führen Sie die Schritte 6.2-6.7 und Tabelle 8 aus, um zellfreie Zehenschalterreaktionen auf Papierbasis zusammenzustellen und die Primerleistung zu bewerten. Analysieren Sie die Daten wie in den Schritten 7.1-7.2 und Abbildung 3 beschrieben.HINWEIS: Zusätzlich zu den zuvor genannten Kontrollen ist es wichtig, auch die Negativkontrolle einzubeziehen, um Hintergrundsignale zu berücksichtigen, die aus der Reaktion entstehen könnten. Darüber hinaus ist es wichtig, auch eine Kontrolle mit dem Schalter und 2 pM (Endkonzentration) der Ziel-RNA als No-NASBA-Amplifikationskontrolle einzubeziehen. Identifizieren Sie mögliche Primerpaare, um mit der Sensitivitätsanalyse fortzufahren. Primerpaare werden basierend darauf ausgewählt, ob die Aktivierung des Zehengriffschalters nach der Zugabe der inkubierten Reaktion erfolgt. Wiederholen Sie bei Bedarf das Primer-Screen mit weiteren Primer-Kombinationen. Wenn Sie die RNA-Proben immer auf Eis halten, machen Sie den folgenden seriellen Verdünnungssatz von Ziel-RNAs in nukleasefreiem Wasser: 104, 103, 10 2, 101 und 100 RNA-Kopien/μL. Wiederholen Sie die auf Nukleinsäuresequenz basierende Amplifikation und zellfreie Reaktionen mit den ausgewählten Primer-Sets (Schritte 8.2-8.7), und testen Sie die serielle Verdünnungsserie, um die Primer-Sets zu identifizieren, die die beste Empfindlichkeit bieten. In Abbildung 5 finden Sie ein Beispiel für Ergebnisse zur Bestimmung der Primer-Set-Empfindlichkeit.HINWEIS: Idealerweise sollten der ausgewählte Zehenschalter und das Primerpaar nur 1-100 Ziel-RNA-Kopien pro μL der RNA (Stammlösungskonzentration) nachweisen. Wiederholen Sie das auf Nukleinsäuresequenzen basierende Amplifikationssensitivitätsexperiment in biologischer dreifacher Ausfertigung. Dieser Schritt dient dazu, die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu bestätigen, bevor zu Experimenten mit Patientenproben übergegangen wird. Wahlfrei: Um eine zuverlässige Quelle der Switch-DNA für den Langzeitgebrauch und den Transport zu erhalten, klonen Sie die ausgewählte(n) Switch-Sequenz(en) mit einer herkömmlichen Klonierungsmethode in ein Plasmid. In ähnlicher Weise kann die Zieltrigger-RNA-Sequenz auch zur Speicherung in ein Plasmid der Wahl kloniert werden. Bestandteil Volumen pro Reaktion Endkonzentration NASBA-Reaktionspuffer 1,67 μL 1x NASBA-Nukleotid-Mix 0,833 μL 1x 25 μM Vorwärtsprimer 0,1 μL 0,5 μM 25 μM Reverse Primer 0,1 μL 0,5 μM RNase-Inhibitor (40 U/μL) 0,05 μL 0,4 U/μL Ziel-RNA 1 μL NASBA Enzymmischung 1,25 μL 1x Gesamtvolumen 5 μL Tabelle 6: NASBA-Reaktionskomponenten. Schritt Temperatur Zeit Denaturierung 65 °C 2 Minuten Gleichgewicht 41 °C 10 Minuten Halten 41 °C ∞ Inkubation 41 °C 1 Std. Halten 4 °C – Tabelle 7: Reaktionsbedingungen für die NASBA. Bestandteil Volumen Endkonzentration pro Reaktion Lösung A 2,38 μL 40% Lösung B 1,78 μL 30% RNase-Inhibitor 0,03 μL 0,5% v/v CPRG (25 mg / ml) 0,14 μL 0,6 mg/ml Zehenschalter X μL 33 nM Ziel-RNA (falls zutreffend) X μL 1 μM NASBA (falls zutreffend) 0,85 μL 1:7 Nukleasefreies Wasser bis 5,94 μL – Gesamtvolumen: 5,94 μL Tabelle 8: Papierbasierte zellfreie Reaktionskomponenten. 9. Entnahme von Patientenproben und Extraktion viraler RNA HINWEIS: In diesem Abschnitt wird das Protokoll zur Entnahme von Patientenproben und zur Extraktion der RNA mit einem RNA-Reinigungskit beschrieben. Das folgende Protokoll wird verwendet, um Serum aus peripherem Blut zu gewinnen. Die in dieser Studie verwendeten Proben wurden von Patienten mit Fieber, Exanthem, Arthralgie oder anderen verwandten Symptomen einer Arbovirus-Infektion im Bundesstaat Pernambuco, Brasilien, gesammelt. Sammeln Sie periphere Blutproben von mit Verdacht auf Arbovirus infizierte Patienten. Führen Sie Venenpunktion (Vollblutröhrchen) mit einer aseptischen Standardtechnik durch. Beschriften Sie die Probenröhrchen mit einem anonymen Code und dem Datum der Probenentnahme. Zentrifugieren Sie das Blut, um das Serum bei 2.300 x g für 10 min zu trennen. Bereiten Sie mit einer Pipette Aliquots von Serum (200 μL) vor, die für die RNA-Extraktion in 1,5-ml-Röhrchen verwendet werden.HINWEIS: Wenn es nicht möglich ist, die RNA-Extraktion kurz nach der Probenentnahme durchzuführen, sollten Serumproben vor der nachgeschalteten Anwendung bei -80 °C gelagert werden. 560 μL des vorbereiteten Puffers AVL (viraler Lysepuffer), der die Träger-RNA enthält, werden in ein 1,5 ml Röhrchen pipettiert. Geben Sie 140 μL Serum in die Buffer AVL/Carrier RNA-Mischung im Röhrchen. Mischen Sie durch Pulswirbeln für 15 s. Inkubieren Sie für 10 min bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie dann kurz die Probe, um den Inhalt am Boden des Röhrchens zu sammeln. 560 μL Ethanol (96%-100%) in die Probe geben und durch Impulswirbeln für 15 s mischen. Zentrifugieren Sie die Probe nach dem Mischen, um den Inhalt am Boden des Röhrchens zu sammeln. 630 μL der Lösung aus Schritt 9.4 werden vorsichtig in die Spinsäule gegeben, ohne den Rand zu benetzen. Nach diesem Schritt schließen Sie die Kappe und zentrifugieren Sie bei 6.000 x g für 1 Minute. Legen Sie die Spin-Säule in ein sauberes 2-ml-Sammelröhrchen und entsorgen Sie das gebrauchte Sammelröhrchen mit dem Filtrat. Öffnen Sie vorsichtig die Spin-Spalte und wiederholen Sie Schritt 9.5. Öffnen Sie vorsichtig die Schleudersäule und fügen Sie 500 μL Puffer AW1 (Waschpuffer 1) hinzu. Schließen Sie die Kappe und zentrifugieren Sie bei 6.000 x g für 1 Minute. Legen Sie die Spin-Säule in ein sauberes 2-ml-Sammelröhrchen und entsorgen Sie das gebrauchte Sammelröhrchen mit dem Filtrat. Öffnen Sie vorsichtig die Schleudersäule und fügen Sie 500 μL Puffer AW2 (Waschpuffer 2) hinzu. Kappe schließen und bei 20.000 x g für 3 min zentrifugieren. Legen Sie die Spin-Säule in ein sauberes 2-ml-Sammelröhrchen und entsorgen Sie das gebrauchte Sammelröhrchen mit dem Filtrat. Um eine Kontamination durch Restpuffer AW2 zu vermeiden, die Probleme bei nachgeschalteten enzymatischen Reaktionen verursachen könnte, legen Sie die Spin-Säule in ein sauberes 2-ml-Sammelröhrchen und entsorgen Sie das gebrauchte Sammelröhrchen mit dem Filtrat. Zentrifugieren bei 20.000 x g für 1 min. Legen Sie die Spin-Säule in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen und entsorgen Sie das gebrauchte Sammelröhrchen mit dem Filtrat. Öffnen Sie vorsichtig die Spin-Säule und fügen Sie 60 μL Buffer AVE (Elutionspuffer) auf Raumtemperatur ein. Nach diesem Schritt schließen Sie die Kappe und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 1 Minute. Zentrifuge bei 6.000 x g für 1 min. Die eluierte RNA kann dann parallel als Input für die NASBA und RT-qPCRs verwendet werden. Befolgen Sie die Schritte 8.3 bis 8.11, um die nukleinsäuresequenzbasierte Amplifikation und papierbasierte zellfreie Reaktionen unter Verwendung von 1 μL extrahierter Patienten-RNA durchzuführen, wobei sichergestellt wird, dass negative und positive Kontrollreaktionen eingeschlossen sind. Nach den Reaktionen ist die Reaktionsplatte 384 Well vorzubereiten und den Assay im tragbaren Plattenlesegerät bei 37 °C durchzuführen (siehe Einzelheiten im Zusatzprotokoll).HINWEIS: Zwei RNA-Konzentrationen von 104 und 102 PFU/ml, extrahiert aus kultiviertem Zika-Virus, werden während der klinischen Validierung als Positivkontrollen für alle Experimente verwendet. Zusätzlich zu den zuvor genannten Kontrollen ist es wichtig, auch den Trigger (10 ng/μL) als Positivkontrolle einzubeziehen. Am Ende jedes Experiments können die Rohdaten (.csv Datei) aus dem prtable Plattenleser online in eine sichere Datenbank hochgeladen werden. Darüber hinaus generiert das tragbare Plattenlesegerät einen Bericht, der angibt, ob die Proben positiv oder negativ für das Zika-Virus sind (Abbildung 6); Beispiele für alle während der Inkubation erhaltenen Diagramme finden Sie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse (Abbildung 7).HINWEIS: Benutzer können Dateien auch vom tragbaren Plattenleser über USB auf ihren eigenen Computer übertragen. 10. Tragbares Plattenlesegerät Die tragbare Plattenlesevorrichtung (Bild 8) kann als Alternative zu einem herkömmlichen Plattenlesegerät24 verwendet werden. Das Protokoll und die repräsentativen Ergebnisse finden Sie unter Zusatzprotokoll. 11. RT-qPCR zum Nachweis des Zika-Virus HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Schritte zur Durchführung der RT-qPCR zum Nachweis des Zika-Virus anhand von Patientenproben beschrieben (siehe Zusatzprotokoll). Um eine Kontamination zu vermeiden, montieren Sie die RT-qPCR-Komponenten in einem vom Amplifikationsprozess isolierten Bereich (z. B. Clean-Hood). Legen Sie den RT-qPCR-Puffer, die Enzyme und den Primer/die Sonden auf Eis oder einen Cold-Block. Anschließend fügen Sie die Reaktionen zu einer 384-Well-Platte auf Eis gemäß Tabelle 9 hinzu.HINWEIS: Negative (Extraktionskontrolle und Nicht-Schablonenkontrolle [NTC]) und Positivkontrolle (104 PFU/ml) werden für alle Experimente empfohlen. Nachdem Sie die Reagenzien in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben haben, mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren auf und ab (nicht vortex) und geben Sie 6,5 μL in jede Vertiefung ab. Fügen Sie 3,5 μL jeder RNA-Vorlage in dreifacher Ausfertigung hinzu. Legen Sie einen PCR-Film über die Oberseite der Platte. Zentrifugieren Sie die 384-Well-Platte bei 600 x g für 2 min. Legen Sie die Platte unter Verwendung der folgenden in Tabelle 10 beschriebenen Zyklusbedingungen in ein RT-qPCR-Gerät. Um die Ergebnisse zu analysieren, verwenden Sie die RT-qPCR Maschinendesign- und Analysesoftware und berücksichtigen Sie den automatischen Schwellenwert und die Baseline (siehe Details im Zusatzprotokoll). Bestandteil Volumen Konzentration 2X QuantiNova Sonde RT-PCR Master Mix 5 μL 1 x 100 μM Vorwärtsprimer 0,08 μL 0,8 μM 100 μM Reverse Primer 0,08 μL 0,8 μM 25 μM Sonde 0,04 μL 0,1 μM QuantiNova ROX Referenzfarbstoff 0,05 μL 1 x QuantiNova Sonde RT Mix 0,1 μL 1 x Template-RNA 3,5 μL – Nukleasefreies Wasser bis 10 μL – Tabelle 9: RT-qPCR-Komponenten zur Amplifikation der Zika-Virus-RNA basierend auf dem Protokoll der Centers for Disease Control and Prevention-CDC USA zum Nachweis des Zika-Virus aus Patientenproben31. Schritt Temperatur Zeit Reverse Transkription 45 °C 15 Minuten PCR-Initialer Aktivierungsschritt 95 °C 5 Minuten 45 Zyklen Denaturierung 95 °C 5 s Kombiniertes Glühen/Ausdehnen 60 °C 45 s Tabelle 10: Zyklusbedingungen für RT-qPCR.