Étude de conception à mise en œuvre pour le développement et la validation par le patient de diagnostics de commutation de maintien à pied sur papier

Toutes les procédures impliquant des participants humains doivent être menées conformément aux normes éthiques et aux directives pertinentes, y compris les principes éthiques pour la recherche médicale impliquant des sujets humains établis par la Déclaration d’Helsinki de l’Association médicale mondiale. Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique de la recherche humaine sous le numéro de protocole de licence CAAE: 80247417.4.0000.5190. Le Fiocruz-PE Institutional Review Board (IRB) a levé le consentement éclairé de tous les patients inclus dans cette étude pour les échantillons diagnostiques. REMARQUE: L’appareil PLUM sera ci-après dénommé « lecteur de plaque portable ». 1. Conception informatique d’amorces d’amplification basées sur des séquences d’acides nucléiques Scanner le génome Zika pour identifier un ensemble de régions candidates à l’amplification d’environ 200 nucléotides (nt) à 300 nt de longueur en plaçant la séquence génomique dans NCBI/Nucleotide BLAST25,26. Comparer le génome aux séquences d’ARN de référence (refseq_rna) et rechercher des sites qui restent hautement conservés et qui n’ont pas d’homologie avec le génome humain (les autres paramètres BLAST restent inchangés). Sélectionnez au moins deux sites pour concevoir l’interrupteur de maintien synthétique. Utilisez les critères de sélection de Deiman et coll.27 pour générer des paires d’amorces d’amplification basées sur des séquences d’acides nucléiques avant et inverse pour chaque région d’amplification candidate. En bref, suivez les critères suivants pour concevoir des amorces : (1) teneur en GC entre 40 % et 60 %; (2) 20 à 24 nt de longueur avec une température de fusion de l’ADN supérieure à 41 °C; (3) pas de séries de quatre nucléotides identiques ou plus; (4) le nucléotide final 3′ est une base A; (5) faible structure secondaire d’amorce et probabilité de formation de dimères. Criblez 8 à 10 paires d’amorces pour chaque région cible (recommandé). Ajouter la séquence de préfixe contenant la séquence promotrice T7 AATTCTAATACGACTCACTATAGGG AGAAGG(séquence promotrice T7 soulignée) à l’extrémité 5′ des amorces avant pour permettre la transcription des amplicons à l’aide de l’ARN polymérase T7 (RNAP). Commandez les amorces en tant qu’oligos d’ADN auprès d’une société de synthèse d’ADN. 2. Conception informatique des interrupteurs de maintien Installez NUPACK28 version 3.2 (suite de conception d’acide nucléique) en suivant les instructions du site Web29. Utilisez un système d’exploitation UNIX et MATLAB (plate-forme de calcul numérique) comme langage de programmation (recommandé). Identifier les séquences cibles (p. ex. génome viral) spécifiques à l’agent pathogène d’intérêt pour la conception de l’interrupteur de maintien comme à l’étape 1.1. Choisissez les séquences cibles Zika parmi les amplicons basés sur les séquences d’acides nucléiques générés à l’étape 1.2.REMARQUE: En pratique, les amorces d’amplification basées sur la séquence d’acide nucléique ou les interrupteurs synthétiques peuvent être conçus et testés en premier, en fonction des besoins des utilisateurs. Si des régions cibles d’intérêt particulières ont déjà été établies (p. ex., à partir de publications ou de protocoles de diagnostic existants), la conception et le criblage des commutateurs peuvent avoir lieu en premier, suivis de la conception et du criblage des amorces d’amplification basées sur la séquence d’acide nucléique. S’il n’y a pas de régions cibles établies, examinez d’abord les amorces d’amplification basées sur la séquence des acides nucléiques par rapport au génome complet afin de réduire les cibles de choix tout en sélectionnant l’efficacité de l’amplification de l’amorce. Si plusieurs séquences pour l’agent pathogène sont disponibles, il est préférable de concevoir des amorces d’amplification basées sur des séquences d’acides nucléiques qui se concentrent sur les régions hautement conservées (plutôt que de cribler l’ensemble du génome). Téléchargez et installez le logiciel MATLAB requis sur l’ordinateur. Configurez les variables d’environnement pour permettre l’appel des fonctions de la suite de conception d’acides nucléiques dans le logiciel. Pour ce faire, ouvrez le logiciel, puis ouvrez (ou créez) un fichier startup.m dans le dossier de travail par défaut. Ensuite, copiez les lignes de code suivantes dans le fichier startup.m et enfin, ajoutez le dossier contenant les fichiers binaires de la suite de conception d’acides nucléiques au PATH :NUPACKINSTALL = ‘/Users/[user_name]/…/nupack3.2.2’;setenv(‘NUPACKINSTALL’,NUPACKINSTALL);setenv(‘CHEMIN’,[getenv(‘CHEMIN’),sprintf(‘:%s/build/bin’,NUPACKINSTALL)]); Ouvrez le logiciel de la plate-forme de calcul numérique et accédez au dossier du logiciel de conception. Exécutez les algorithmes de conception accessibles à https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN. Entrez les séquences cibles dans le design_input_file.csv situé dans le sous-dossier d’entrée. Les entrées incluent Nom, Séquence externe, Séquence interne, Température, Nom de sortie et Séquence de sortie comme défini dans le Tableau 1. Si aucun site d’amorçage n’est encore déterminé pour la cible, gardez les séquences intérieures et externes identiques. Seuls les 29 premiers nt du rapporteur seront pris en compte au cours du processus de conception. Lorsque vous avez terminé, enregistrez et fermez la feuille de calcul mise à jour.REMARQUE : La séquence de sortie est la séquence de la protéine rapporteur qu’il est prévu d’utiliser pour le dosage (p. ex., lacZ). La spécification des séquences interne et externe garantit que l’algorithme ne générera pas d’interrupteurs de maintien synthétiques qui chevauchent l’une ou l’autre des amorces. Il garantit également que le test reconnaît trois sites uniques dans le génome Zika afin d’améliorer sa spécificité. Sélectionnez les paramètres à utiliser pour la fonction de conception : toehold_switch_design_run(num_designs,input_file, options). Remplissez les valeurs de paramètre comme suit :num_designs – le nombre de conceptions supérieures pour chaque sortie cible du logiciel. La valeur par défaut est 6 et peut être modifiée selon les besoins (un minimum de six conceptions pour chaque cible est recommandé). input_file – ce paramètre spécifie le nom du fichier qui fournit les informations de séquence d’entrée. La valeur par défaut est ‘design_input_file.csv’ et peut être modifiée si nécessaire. Choisissez parmi les options suivantes – (1) Série A et Série B : la ou les versions du commutateur de maintien que le code va générer. Réglez SeriesB sur 1 et SeriesA sur 0 pour générer un interrupteur de maintien de la série B, qui est le format utilisé dans le diagnostic du virus Zika6; (2) Parallèle : réglé sur 1 pour exploiter plusieurs cœurs afin de calculer les conceptions ; sinon, définissez sur 0 ; (3) Antisens : réglez sur 1 pour générer des interrupteurs de maintien qui hybrident la séquence antisens (c’est-à-dire le complément inverse) de l’entrée cible; sinon, affectez la valeur 0. Exécutez la fonction de conception à l’aide des paramètres sélectionnés : toehold_switch_design_run(num_designs,input_file,options). L’algorithme commencera alors à générer les conceptions d’interrupteur de maintien pour les cibles d’intérêt. Une fois la conception terminée, localisez les séquences de conception du commutateur de maintien du pied supérieur et les séquences cibles correspondantes dans le dossier final_designs sous la forme de feuilles de calcul au format .csv. Les séquences d’ADN de l’interrupteur de maintien générées par l’algorithme contiendront la séquence promotrice T7 à l’extrémité 5′ et la séquence de liaison 21 nt conservée AACCTGGCGGCAGCGCAAAAG à l’extrémité 3′. Examinez les séquences de conception de commutateurs de maintien supérieur résultantes par rapport à d’autres virus courants en les plaçant sur NCBI-BLAST et en vérifiant l’homologie des séquences. Acceptez les séquences avec une homologie de 40 % ou moins. Ordonner les séquences en épingle à cheveux de l’interrupteur à pied en tant qu’oligos d’ADN et les assembler plus tard avec le gène rapporteur en commutateurs entièrement fonctionnels. Commandez les amorces PCR nécessaires pour l’assemblage ultérieur du capteur en fonction de la protéine rapporteur choisie. Paramètre Définition Nom Noms souhaités des séquences de commutation de sortie toehold. Séquence extérieure Transcription complète de la NASBA produite à partir de l’amplification. Séquence interne Séquence externe excluant les sites de liaison de l’amorce. Il correspond à la séquence externe, mais exclut les parties des transcrits qui se lient aux amorces avant et arrière. Température Température utilisée par les algorithmes pour calculer les structures de l’ARN. Nom de sortie Le nom du gène de sortie (par exemple lacZ, gfp). Séquence de sortie Séquence du gène de sortie. Tableau 1 : Définition de chaque paramètre utilisé dans le logiciel de conception du commutateur de maintien du pied. 3. Construction d’interrupteurs de maintien par PCR REMARQUE: Ces étapes décrivent la construction des interrupteurs LacZ par PCR d’extension de chevauchement. Ici, l’oligo d’ADN est utilisé comme amorce directe et le terminateur T7 est utilisé comme amorce inverse. Nous utilisons le plasmide pCOLADuet-LacZ comme matrice pour le gène lacZ (addgene: 75006). Tout autre modèle d’ADN contenant la séquence correspondante peut être utilisé comme modèle, à condition que le terminateur T7 soit inclus dans la construction finale. Une fois que les oligos d’ADN synthétique ont été reçus du fournisseur commercial, préparer des solutions d’ADN synthétique et d’amorce d’amplification inverse à une concentration de 10 μM dans de l’eau exempte de nucléase. Assembler les réactions dans des tubes de PCR sur de la glace conformément au tableau 2.REMARQUE: Les volumes PCR peuvent être mis à l’échelle selon les besoins. Utilisez une quantité minimale (0,1-1 ng) de gabarit d’ADN pCOLADuet-LacZ pour éviter d’avoir besoin d’une étape supplémentaire d’élimination du plasmide ou d’un signal LacZ de fond. Pour des quantités plus élevées de matrice d’ADN, suivez la PCR avec un digesteur d’enzymes de restriction DpnI pour éliminer la matrice plasmidique résiduelle. Placer les réactions dans un cycleur thermique, en suivant les conditions de cyclage indiquées dans le tableau 3. Analyser les produits de PCR sur un gel d’agarose (Figure 2; voir Protocole additionnel et30). Purifiez les produits PCR à l’aide d’un kit de purification PCR à base de colonne de spin et éluez l’ADN dans 15-30 μL d’eau sans nucléase, selon les instructions du fabricant. Quantifier l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Composant Volume Concentration Tampon de réaction Q5 5X 10 μL 1x 10 mM dNTP 1 μL 200 μM Amorce avant 10 mM (Synthetic Switch DNA FW) 2,5 μL 0,5 μM Amorce inversée 10 mM (terminateur T7 RV) 2,5 μL 0,5 μM Modèle ADN (pCOLADuet-LacZ) variable <1 ng Q5 ADN polymérase haute fidélité 0,5 μL 0,02 U/μL Eau sans nucléase à 50 μL – Tableau 2 : Composants PCR utilisés pour construire les interrupteurs de maintien des orteils. Pas Température Heure Dénaturation initiale 98 °C 30 s 35 cycles Dénaturation 98 °C 10 s Recuit 60 °C 20 s Extension 72 °C 1 min 45 min Prolongation finale 72 °C 5 min Tenir 4 °C – Tableau 3 : Conditions de cyclage utilisées lors de la construction des interrupteurs de maintien par PCR. 4. Préparation de la cible d’ARN synthétique (déclencheur) À l’aide d’un logiciel de conception de biologie moléculaire, modifier les modèles d’ARN déclencheurs synthétiques (sélectionnés à l’étape 1.1) pour inclure une séquence promotrice T7 en amont, en veillant à ce que le modèle complet reste court (<200 pb). Concevoir des amorces avant et arrière pour amplifier l’amorce de la séquence de déclenchement (pour les séquences oligo, voir Protocole supplémentaire). Ordonner les séquences en oligos d’ADN. Une fois reçu, reconstituer l’ADN de déclenchement synthétique et les amorces d’amplification à 10 μM dans de l’eau sans nucléase. Assembler les PCR correspondantes dans des tubes à paroi mince sur de la glace conformément au tableau 2 et utiliser 0,5 μL de l’ultramère d’ADN déclencheur (concentration finale de 0,1 μM) comme ADN matriciel. Placez les réactions dans un thermocycleur et utilisez les conditions de cyclage indiquées dans le tableau 3. Utilisez un temps de prolongation de 15 s. Évaluer la qualité et purifier les produits de PCR déclencheurs tels que décrits à l’étape 3.3 et au Protocole supplémentaire.REMARQUE: Pour accélérer le processus, les produits PCR à déclenchement purifiés par colonne peuvent également être directement utilisés pour le dépistage initial de l’interrupteur de maintien du pied. 5. Transcription in vitro de séquences déclenchantes sélectionnées Assembler les composants de réaction sur la glace conformément au tableau 4. Incuber des réactions de transcription in vitro (IVT) à 37 °C pendant 4 h, suivies d’un traitement à la DNase I pour enlever l’ADN modèle. Pour l’étape DNase I, ajouter 70 μL d’eau sans nucléase, 10 μL de tampon 10x DNase I et 2 μL de DNase I (sans RNase), et incuber à 37 °C pendant 15 min. Si vous ne passez pas immédiatement à l’étape 5.4, désactiver la DNase I avec l’ajout de 50 mM d’EDTA et l’inactivation thermique à 65 °C pendant 10 min. Étape facultative : Effectuer une analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant (p. ex., urée-PAGE) sur les produits de TPI afin d’évaluer la qualité de l’ARN tel que décrit dans le Protocole additionnel. Purifier les produits IVT déclencheurs à l’aide d’un kit de nettoyage de l’ARN à base de colonne conformément aux instructions du fabricant, puis quantifier la concentration et la pureté de l’ARN à l’aide de la spectrophotométrie. Voir Protocole supplémentaire pour obtenir des instructions sur la façon de déterminer la molarité et le nombre de copies/μL de l’ARN. Composant Volume Concentration Tampon de réaction 10X 1,5 μL 0,75x Mélange NTP 25 mM 6 μL 7,5 mM Modèle de déclencheur ADN X μL 1 μg Mélange d’ARN polymérase T7 1,5 μL – Eau sans nucléase X μL À 20 μL Tableau 4 : Transcription in vitro (IVT) de séquences déclenchantes sélectionnées. 6. Filtrage initial des commutateurs REMARQUE : cette section décrit les étapes associées à la configuration des réactions de maintien des orteils sans cellule et à base de papier, et comment rechercher des commutateurs de maintien d’orteil hautes performances. Le papier filtre bloqué BSA utilisé à l’étape 6.10 doit être préparé à l’avance, comme décrit dans le Protocole additionnel. Préparer une solution mère de CPRG en dissolvant 25 mg de poudre dans 1 mL d’eau sans nucléase. Conserver la solution sur glace en tout temps et la conserver à -20 °C pour une utilisation prolongée. Déterminez le nombre de réactions à configurer. Pour chaque interrupteur de maintien évalué, inclure un contrôle sans gabarit (pas d’interrupteur et pas d’ARN cible, autrement connu sous le nom de contrôle seul sans cellule) pour tenir compte de tout signal de fond pouvant découler du mélange principal. Inclure un contrôle de commutation uniquement pour évaluer la fuite du commutateur de fond ou le taux d’arrêt en l’absence d’ARN cible. Assembler un mélange maître réactionnel acellulaire composé de solution A, de solution B, d’inhibiteur de RNase et de CPRG sur glace conformément au protocole standard indiqué dans le tableau 5.REMARQUE : Les étapes décrites ici concernent un mélange maître qui sera suffisant pour un ensemble triple de réactions de 1,8 μL avec un volume ajouté de 10 % pour tenir compte de l’erreur de pipetage. Le volume du mixage principal doit être ajusté au besoin en fonction du nombre d’interrupteurs de maintien criblés. Pour chaque triple réaction acellulaire sans cellule, distribuer le mélange principal dans un tube PCR, en gardant tous les tubes sur la glace. Pour le tube mis de côté comme témoin seul sans cellule, ajouter de l’eau sans nucléase jusqu’à un volume final de 5,84 μL, mélanger en pipetant de haut en bas et centrifuger brièvement. Pour le reste des tubes, ajouter de l’ADN de commutation purifié par PCR à une concentration finale de 33 nM. Pour les tubes mis de côté comme interrupteurs seuls, ajouter de l’eau sans nucléase jusqu’à un volume final de 5,84 μL. Pour les tubes mis de côté pour tester la combinaison de l’interrupteur de maintien et de l’ARN cible, ajouter in vitro de l’ARN cible transcrit à une concentration finale de 1 μM. Ensuite, ajoutez de l’eau exempte de nucléases à un volume final de 5,84 μL. Bien mélanger toutes les réactions en tuytant de haut en bas et en centrifugeant brièvement. Ajouter 30 μL d’eau exempte de nucléases aux puits entourant les puits de réaction sur une plaque noire à fond clair de 384 puits. Cela minimise l’évaporation au cours de l’expérience et améliore la reproductibilité.REMARQUE: Si vous utilisez le lecteur de plaque portable, placez une feuille PCR sur la plaque et utilisez un couteau de précision pour découper les puits destinés à votre réaction, ainsi que chacun des quatre puits d’angle. La feuille PCR empêche la surexposition de la caméra de lecture de plaques portable des puits vides. À l’aide d’un poinçon de biopsie de 2 mm et d’une pince à épiler, couper les disques de papier filtre bloqués par BSA et les placer dans les puits de réaction soit en éjectant le poinçon, soit à l’aide d’une pince à épiler (voir Protocole supplémentaire pour la préparation du papier filtre bloqué par BSA). Distribuer trois volumes de 1,8 μL de chaque tube de réaction sur les disques de papier filtre de la plaque de 384 puits, en gardant tous les échantillons, ainsi que la plaque de 384 puits, sur la glace en tout temps.REMARQUE : Si vous utilisez le lecteur de plaques portatif, ajoutez 1,8 μL de CPRG (0,6 mg/mL) à chacun des quatre coins de la plaque de 384 puits. La couleur jaune du CPRG fournit la reconnaissance de formes au lecteur de plaques portable pour l’alignement du modèle de plaque multipuits numérique dans l’analyse d’image. Couvrir les puits de la plaque avec un film PCR pour éviter l’évaporation. Placer la plaque dans un lecteur de plaque, lire OD570 à 37 °C toutes les minutes pendant 130 min. Composant Volume Concentration finale par réaction Solution A 2,38 μL 40% Solution B 1,78 μL 30% Inhibiteur de la RNase 0,03 μL 0,5 % v/v GRCP (25 mg/mL) 0,14 μL 0,6 mg/mL Interrupteur de maintien X μL 33 nM ARN cible X μL 1 μM Eau sans nucléase à 5,94 μL – Volume total : 5,94 μL Tableau 5 : Composants de réaction de transcription-traduction sans cellules PURExpress. 7. Identification des interrupteurs de maintien des orteils hautement performants REMARQUE: Cette section décrit comment analyser les données de l’étape 6 afin de sélectionner les commutateurs de maintien de pointe les plus performants pour aller de l’avant. Commencez l’analyse des données en normalisant d’abord l’absorbance OD570 de fond. Pour ce faire, soustrayez les mesures OD 570 des réactions qui n’ont pas d’ARN commutateur ou cible (c’est-à-dire des puits seuls acellulaires) des autres mesures OD570. Lissez les données normalisées à l’aide d’une moyenne mobile à trois points et ajustez la valeur minimale de chaque puits à zéro. Voir la figure 3 pour un exemple de données normalisées de parcours temporel collectées pour les interrupteurs de maintien 27B, 33B et 47B. À l’aide de ces données traitées, calculer le changement de pli (ou rapport ON/OFF) en déterminant la différence dans le taux de changement de couleur (c.-à-d. changement de DO570 au fil du temps) entre l’interrupteur de maintien et les puits cibles et interrupteurs seuls (voir Protocole supplémentaire pour le calcul du rapport; Graphique 4). Sélectionnez les interrupteurs avec le changement de pli ON/OFF le plus élevé pour une caractérisation plus approfondie. Omettez les interrupteurs de maintien des orteils peu performants qui affichent le changement de pli le plus bas. 8. Criblage et sensibilité de l’amorce d’amplification basée sur la séquence des acides nucléiques REMARQUE: Dans les étapes suivantes, un criblage des amorces d’amplification isotherme fonctionnelles est d’abord effectué, puis leur sensibilité est évaluée en déterminant le nombre de copies d’ARN cible par μL d’ARN synthétique qu’un interrupteur de maintien donné peut détecter de manière fiable lorsqu’il est couplé à une amplification isotherme. Après l’amplification isotherme, effectuer des réactions acellulaires pour identifier les ensembles d’amorces d’amplification basés sur la séquence d’acide nucléique réussis. Cependant, il peut être plus rentable d’exécuter des gels de polyacrylamide ou d’agarose sur des réactions d’amplification basées sur la séquence d’acides nucléiques pour d’abord réduire le pool d’ensembles d’amorces candidats. Dans ce cas, les ensembles d’amorces d’amplification basés sur la séquence d’acides nucléiques qui génèrent une bande sur le gel à la taille d’amplicon appropriée peuvent être présélectionnés pour un dépistage ultérieur sans cellule. Préparer une solution mère de 25 μM de tous les ensembles d’amorces avant et arrière dans de l’eau exempte de nucléases (voir Protocole additionnel). Déterminer le nombre de réactions d’amplification basées sur la séquence d’acides nucléiques et de réactions acellulaires ultérieures qui doivent être mises en place. Cela dépendra du nombre de commutateurs de maintien et des jeux d’amorces respectifs.REMARQUE : Lors de l’examen des amorces, il est important de toujours inclure un contrôle sans modèle pour chaque jeu d’amorces afin de tenir compte de tous les artefacts d’arrière-plan pouvant survenir en raison de l’amplification non spécifique associée à l’amorce. Configurez une réaction de 5 μL comme suit (mettez à l’échelle au besoin). Décongeler tous les réactifs sur la glace. Assembler un mélange principal réactionnel composé du tampon réactionnel, du mélange nucléotidique et de l’inhibiteur de la RNase conformément au tableau 6. Bien mélanger en pipetant de haut en bas jusqu’à ce que le précipité blanc soit solubilisé, puis distribuer les aliquotes dans des tubes de PCR.Si le mélange maître sert à cribler des amorces d’amplification basées sur la séquence d’acides nucléiques, exclure d’abord les amorces du mélange maître (distribuer 2,55 μL de mélange maître). Sinon, si vous effectuez une analyse de sensibilité de l’amorce, les amorces peuvent être incluses dans le mélange maître (auquel cas distribuer 2,75 μL d’aliquotes). Ajouter le mélange enzymatique après les étapes de dénaturation et d’équilibre. Si vous filtrez des amorces d’amplification basées sur la séquence d’acides nucléiques, ajoutez les amorces avant et arrière aux tubes appropriés. Sur un cycleur thermique, configurez le protocole d’incubation comme décrit dans le tableau 7. Ajouter 1 μL d’eau exempte de nucléases ou 1 μL d’ARN déclencheur cible à 2 pM ou environ 106 copies/μL, en veillant à étiqueter les tubes en conséquence. Mélanger par pipetage doux et faire tourner brièvement les tubes.REMARQUE : Pour le criblage de l’ensemble d’amorces, utilisez une concentration d’ARN déclencheur cible suffisamment élevée pour ne pas empiéter sur la limite inférieure de détection de la méthode d’amplification isotherme, mais pas assez élevée pour activer l’interrupteur de maintien si aucune amplification ne devait se produire. Déplacez les tubes vers le thermocycleur et commencez l’incubation. Après 12 min, retirez les tubes et ajoutez 1,25 μL du mélange d’enzymes dans chaque tube. Mélanger en tuytant de haut en bas et centrifuger brièvement les tubes.NOTE: À ce stade, les tubes peuvent être conservés à température ambiante; Cependant, le mélange d’enzymes doit être conservé sur la glace jusqu’à ce qu’il soit ajouté aux tubes. Remettez les tubes dans le cycleur thermique, en sautant l’étape de maintien à 41 °C pour commencer l’incubation de réaction de 1 h.REMARQUE : Après l’incubation, les réactions peuvent être placées sur de la glace pour un traitement le jour même ou congelées à -20 °C pour un traitement ultérieur. Suivez les étapes 6.2 à 6.7 et le tableau 8 pour assembler les réactions de l’interrupteur de maintien sans pile à base de papier afin d’évaluer les performances de l’amorce. Analysez les données comme décrit aux étapes 7.1 à 7.2 et à la figure 3.REMARQUE: En plus des contrôles mentionnés précédemment, il est important d’inclure également le contrôle négatif pour tenir compte de tout signal de fond qui pourrait découler de la réaction. En outre, il est important d’inclure également un contrôle avec le commutateur et 2 pM (concentration finale) de l’ARN cible, en tant que contrôle d’amplification sans NASBA. Identifier les paires d’amorces candidates pour aller de l’avant avec l’analyse de sensibilité. Les paires d’amorces sont sélectionnées en fonction de l’activation de l’interrupteur de maintien après l’ajout de la réaction incubée. Si nécessaire, répétez l’écran d’apprêt avec plus de combinaisons d’apprêts. En gardant les échantillons d’ARN sur la glace en tout temps, faites l’ensemble de dilution en série suivant d’ARN cibles dans de l’eau sans nucléase : 104, 103, 10 2, 101 et 100 copies d’ARN/μL. Répétez l’amplification basée sur la séquence d’acide nucléique et les réactions sans cellules avec les ensembles d’amorces sélectionnés (étapes 8.2-8.7), en testant la série de dilutions en série afin d’identifier les ensembles d’amorces qui offrent la meilleure sensibilité. Voir la figure 5 pour un exemple de résultats permettant de déterminer la sensibilité de l’ensemble d’amorces.REMARQUE: Idéalement, l’interrupteur de maintien sélectionné et la paire d’amorces devraient détecter aussi peu que 1 à 100 copies d’ARN cible par μL d’ARN (concentration de solution mère). Répétez l’expérience de sensibilité d’amplification basée sur la séquence d’acide nucléique en triplat biologique. Cette étape sert à confirmer la reproductibilité des résultats avant de passer à des expériences avec des échantillons de patients. Optionnel: Pour disposer d’une source fiable de l’ADN de commutation pour une utilisation à long terme et pour le transport, clonez la ou les séquences de commutation sélectionnées dans un plasmide en utilisant n’importe quelle méthode de clonage conventionnelle. De même, la séquence d’ARN déclencheur cible peut également être clonée dans un plasmide de choix pour le stockage. Composant Volume par réaction Concentration finale Tampon de réaction NASBA 1,67 μL 1x NASBA Mélange de nucléotides 0,833 μL 1x Amorce avant 25 μM 0,1 μL 0,5 μM Amorce inversée 25 μM 0,1 μL 0,5 μM Inhibiteur de la RNase (40 U/μL) 0,05 μL 0,4 U/μL ARN cible 1 μL NASBA Mélange d’enzymes 1,25 μL 1x Volume total 5 μL Tableau 6 : Composants de la réaction NASBA. Pas Température Heure Dénaturation 65 °C 2 min Équilibration 41 °C 10 min Tenir 41 °C ∞ Incubation 41 °C 1 h Tenir 4 °C – Tableau 7 : Conditions de réaction pour la NASBA. Composant Volume Concentration finale par réaction Solution A 2,38 μL 40% Solution B 1,78 μL 30% Inhibiteur de la RNase 0,03 μL 0,5 % v/v GRCP (25 mg/mL) 0,14 μL 0,6 mg/mL Interrupteur de maintien X μL 33 nM ARN cible (le cas échéant) X μL 1 μM NASBA (le cas échéant) 0,85 μL 1:7 Eau sans nucléase à 5,94 μL – Volume total : 5,94 μL Tableau 8 : Composants de réaction acellulaires à base de papier. 9. Prélèvement d’échantillons de patients et extraction d’ARN viral REMARQUE : Cette section décrit le protocole de prélèvement d’échantillons de patients et d’extraction de l’ARN à l’aide d’un kit de purification de l’ARN. Le protocole ci-dessous est utilisé pour obtenir du sérum à partir de sang périphérique. Les échantillons utilisés dans cette étude ont été prélevés chez des patients présentant de la fièvre, un exanthème, une arthralgie ou d’autres symptômes connexes d’infection à arbovirus dans l’État de Pernambuco, au Brésil. Prélever des échantillons de sang périphérique de patients soupçonnés d’être infectés par des arbovirus. Effectuer une ponction veineuse (tube de sang total) en utilisant une technique aseptique standard. Étiquetez les tubes d’échantillon avec un code anonyme et la date de prélèvement de l’échantillon. Centrifuger le sang pour séparer le sérum à 2 300 x g pendant 10 min. À l’aide d’une pipette, préparer des aliquotes de sérum (200 μL) qui seront utilisées pour l’extraction de l’ARN dans des tubes de 1,5 mL.REMARQUE : S’il n’est pas possible d’effectuer l’extraction de l’ARN peu de temps après le prélèvement de l’échantillon, les échantillons de sérum doivent être conservés à -80 °C avant les applications en aval. Pipeter 560 μL de tampon AVL (tampon de lyse virale) préparé contenant l’ARN porteur dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 140 μL de sérum au mélange tampon AVL/ARN porteur dans le tube. Mélanger par tourbillon d’impulsions pendant 15 s. Incuber pendant 10 min à température ambiante, puis centrifuger brièvement l’échantillon pour recueillir le contenu au fond du tube. Ajouter 560 μL d’éthanol (96 %-100 %) à l’échantillon et mélanger par tourbillon d’impulsions pendant 15 s. Après mélange, centrifuger l’échantillon pour recueillir le contenu au fond du tube. Ajouter délicatement 630 μL de la solution de l’étape 9.4 à la colonne de rotation sans mouiller la jante. Après cette étape, fermez le bouchon et centrifugez à 6 000 x g pendant 1 min. Placer la colonne d’essorage dans un tube de collecte propre de 2 mL et jeter le tube de collecte usagé contenant le filtrat. Ouvrez délicatement la colonne de rotation et répétez l’étape 9.5. Ouvrez délicatement la colonne de spin et ajoutez 500 μL de tampon AW1 (tampon de lavage 1). Fermer le bouchon et centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min. Placer la colonne d’essorage dans un tube de collecte propre de 2 mL et jeter le tube de collecte usagé contenant le filtrat. Ouvrez délicatement la colonne de spin et ajoutez 500 μL de tampon AW2 (tampon de lavage 2). Fermer le bouchon et centrifuger à 20 000 x g pendant 3 min. Placer la colonne d’essorage dans un tube de collecte propre de 2 mL et jeter le tube de collecte usagé contenant le filtrat. Pour éviter la contamination par le tampon résiduel AW2, qui pourrait causer des problèmes dans les réactions enzymatiques en aval, placer la colonne de spin dans un tube de collecte propre de 2 mL et jeter le tube de collecte usagé avec le filtrat. Centrifuger à 20 000 x g pendant 1 min. Placer la colonne d’essorage dans un tube propre de 1,5 mL et jeter le tube collecteur usagé avec le filtrat. Ouvrez délicatement la colonne de spin et ajoutez 60 μL de tampon AVE (tampon d’élution) équilibré à température ambiante. Après cette étape, fermez le bouchon et incuber à température ambiante pendant 1 min. Centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min. L’ARN élué peut ensuite être utilisé comme entrée pour les NASBA et RT-qPCR en parallèle. Suivez les étapes 8.3 à 8.11 pour effectuer l’amplification basée sur la séquence d’acide nucléique et les réactions sans cellules à base de papier en utilisant 1 μL d’ARN de patient extrait, en veillant à inclure les réactions de contrôle négatives et positives. Après les réactions, préparer la plaque de réaction à 384 puits et exécuter l’essai dans le dispositif portatif de lecture de plaques à 37 °C (voir détails dans le protocole additionnel).REMARQUE : Deux concentrations d’ARN de 104 et 102 UFP/mL, extraites du virus Zika en culture, sont utilisées comme témoins positifs pour toutes les expériences au cours de la validation clinique. En plus des contrôles mentionnés précédemment, il est important d’inclure également le déclencheur (10 ng / μL) comme témoin positif. À la fin de chaque expérience, les données brutes (.csv fichier) du lecteur de plaques prtable peuvent être téléchargées dans une base de données sécurisée en ligne. De plus, le lecteur de plaques portatif génère un rapport indiquant si les échantillons sont positifs ou négatifs pour le virus Zika (Figure 6); voir la section des résultats représentatifs pour des exemples de tous les graphiques obtenus pendant l’incubation (figure 7).REMARQUE: Les utilisateurs peuvent également transférer des fichiers du lecteur de plaques portable vers leur propre ordinateur via l’USB. 10. Dispositif portatif de lecture de plaques Le lecteur de plaques portatif (figure 8) peut être utilisé comme alternative à un lecteur de plaquesconventionnel 24. Pour le protocole et les résultats représentatifs, voir Protocole additionnel. 11. RT-qPCR pour la détection du virus Zika REMARQUE : Cette section décrit les étapes à suivre pour effectuer la RT-qPCR pour la détection du virus Zika à partir d’échantillons de patients (voir Protocole supplémentaire). Pour éviter toute contamination, assemblez les composants RT-qPCR dans une zone isolée du processus d’amplification (p. ex., hotte propre). Placez le tampon RT-qPCR, les enzymes et l’amorce/les sondes sur de la glace ou un bloc froid. Ensuite, ajoutez les réactions à une plaque de 384 puits sur glace conformément au tableau 9.REMARQUE : Les tests négatifs (contrôle d’extraction et contrôle sans gabarit [NTC]) et positifs (104 UFP/mL) sont recommandés pour toutes les expériences. Après avoir ajouté les réactifs dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL, mélanger la réaction en pipetant de haut en bas (ne pas vortex) et distribuer 6,5 μL dans chaque puits. Ajouter 3,5 μL de chaque matrice d’ARN en trois exemplaires. Placez un film PCR sur le dessus de la plaque. Centrifuger la plaque de 384 puits à 600 x g pendant 2 min. Placez la plaque dans une machine RT-qPCR en utilisant les conditions de cyclage suivantes décrites dans le tableau 10. Pour analyser les résultats, utilisez le logiciel de conception et d’analyse de la machine RT-qPCR et tenez compte du seuil automatique et de la ligne de base (voir les détails dans le Protocole supplémentaire). Composant Volume Concentration 2X QuantiNova Probe RT-PCR Master Mix 5 μL 1 X Amorce avant de 100 μM 0,08 μL 0,8 μM Amorce inversée 100 μM 0,08 μL 0,8 μM Sonde 25 μM 0,04 μL 0,1 μM Colorant de référence QuantiNova ROX 0,05 μL 1 X QuantiNova Probe RT Mix 0,1 μL 1 X ARN modèle 3,5 μL – Eau sans nucléase à 10 μL – Tableau 9 : Composants RT-qPCR pour amplifier l’ARN du virus Zika sur la base du protocole des Centers for Disease Control and Prevention (CDC USA) pour détecter le virus Zika à partir d’échantillons de patients31. Pas Température Heure Transcription inverse 45 °C 15 min Étape d’activation initiale de la PCR 95 °C 5 min 45 Cycles Dénaturation 95 °C 5 s Recuit/extension combiné 60 °C 45 s Tableau 10 : Conditions de cyclage pour la RT-qPCR.