Ontwerp-tot-implementatiestudie voor ontwikkeling en patiëntvalidatie van op papier gebaseerde sleufschakelaardiagnostiek

Alle procedures waarbij menselijke deelnemers betrokken zijn, moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met ethische normen en relevante richtlijnen, waaronder de ethische principes voor medisch onderzoek met menselijke proefpersonen die zijn vastgesteld in de Verklaring van Helsinki van de World Medical Association. Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie voor menselijk onderzoek onder licentieprotocolnummer CAAE: 80247417.4.0000.5190. Geïnformeerde toestemming van alle patiënten die in deze studie waren opgenomen, werd door de Fiocruz-PE Institutional Review Board (IRB) voor diagnostische monsters kwijtgescholden. OPMERKING: Het PLUM-apparaat wordt hierna een ‘draagbare plaatlezer’ genoemd. 1. Computationeel ontwerp van op nucleïnezuur gebaseerde amplificatieprimers Scan het Zika-genoom om een reeks kandidaatregio’s voor amplificatie te identificeren die ongeveer 200 nucleotiden (nt) tot 300 nt lang zijn door de genomische sequentie in NCBI / Nucleotide BLAST25,26 te plaatsen. Vergelijk het genoom met referentie-RNA-sequenties (refseq_rna) en zoek naar locaties die sterk geconserveerd blijven en geen homologie hebben met het menselijk genoom (andere BLAST-parameters blijven ongewijzigd). Selecteer ten minste twee locaties om de synthetische grijpschakelaar te ontwerpen. Gebruik de selectiecriteria van Deiman et al.27 om paren van voorwaartse en omgekeerde op nucleïnezuursequentie gebaseerde amplificatieprimers te genereren voor elk kandidaat-versterkingsgebied. In het kort, volg deze criteria voor het ontwerpen van primers: (1) GC-gehalte tussen 40% -60%; (2) 20 tot 24 nt lang bij dna-smelttemperatuur van meer dan 41 °C; (3) geen runs van vier of meer identieke nucleotiden; (4) het laatste 3′-nucleotide is een A-basen; (5) lage secundaire primerstructuur en dimeervormingskans. Scherm 8-10 primerparen voor elk doelgebied (aanbevolen). Voeg de voorvoegselsequentie met de T7-promotorsequentie AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG (T7-promotorsequentie onderstreept) toe aan het 5′-uiteinde van de voorwaartse primers om transcriptie van de ampliconen met behulp van T7-RNA-polymerase (RNAP) mogelijk te maken. Bestel de primers als DNA-oligo’s bij een DNA-synthesebedrijf. 2. Computationeel ontwerp van de grijpschakelaars Installeer NUPACK28 versie 3.2 (nucleïnezuur design suite) op basis van de instructies op de website29. Gebruik een UNIX-besturingssysteem en MATLAB (numeriek computerplatform) als programmeertaal (aanbevolen). Identificeer de doelsequenties (bijv. viraal genoom) die specifiek zijn voor de ziekteverwekker die van belang is voor de ontwerpen van de grijpschakelaar zoals in stap 1.1. Kies de Zika-doelsequenties uit de op nucleïnezuursequentie gebaseerde ampliconen die in stap 1.2 zijn gegenereerd.OPMERKING: In de praktijk kunnen de op nucleïnezuursequentie gebaseerde versterkingsprimers of de synthetische grijpschakelaars eerst worden ontworpen en getest, afhankelijk van de behoeften van de gebruikers. Als er al bepaalde doelregio’s van belang zijn vastgesteld (bijvoorbeeld op basis van bestaande publicaties of diagnostische protocollen), kunnen het ontwerp en de screening van de greepschakelaar eerst plaatsvinden, gevolgd door ontwerp en screening op amplificatieprimers op basis van nucleïnezuursequenties. Als er geen vastgestelde doelregio’s zijn, screen dan eerst nucleïnezuursequentie-gebaseerde amplificatieprimers tegen het volledige genoom om de doelen van keuze te beperken terwijl wordt geselecteerd op primer-versterkingsefficiëntie. Als er meerdere sequenties voor de ziekteverwekker beschikbaar zijn, is het het beste om op nucleïnezuursequentie gebaseerde amplificatieprimers te ontwerpen die zich richten op sterk geconserveerde regio’s (in plaats van het hele genoom te screenen). Download en installeer de vereiste MATLAB-software op de computer. Stel de omgevingsvariabelen zo in dat de functies van de nucleïnezuurontwerpsuite in de software kunnen worden aangeroepen. Hiertoe opent u de software en opent (of maakt u) een startup.m-bestand in de standaardwerkmap. Kopieer vervolgens de volgende regels code naar het bestand startup.m en voeg ten slotte de map met de binaire bestanden van de nucleïnezuurontwerpsuite toe aan het PATH:NUPACKINSTALL = ‘/Gebruikers/[user_name]/…/nupack3.2.2’;setenv(‘NUPACKINSTALL’,NUPACKINSTALL);setenv(‘PATH’,[getenv(‘PATH’),sprintf(‘:%s/build/bin’,NUPACKINSTALL)]); Open de numerieke computerplatformsoftware en navigeer naar de map ontwerpsoftware. Voer de ontwerpalgoritmen uit die toegankelijk zijn op https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN. Voer de doelreeksen in de design_input_file.csv in de invoersubmap. De ingangen omvatten Naam, Buitenste sequentie, Binnenste sequentie, Temperatuur, Uitvoernaam en Uitvoervolgorde zoals gedefinieerd in Tabel 1. Als er nog geen primingplaatsen zijn bepaald voor het doel, houd dan de binnenste en buitenste sequenties hetzelfde. Alleen de eerste 29 nt van de verslaggever wordt tijdens het ontwerpproces in aanmerking genomen. Als u klaar bent, slaat u de bijgewerkte spreadsheet op en sluit u deze.OPMERKING: De uitvoersequentie is de volgorde van het reportereiwit dat gepland is om voor de test te worden gebruikt (bijv. lacZ). Het specificeren van de binnenste en buitenste sequenties zorgt ervoor dat het algoritme geen synthetische toehold-schakelaars genereert die overlappen met een van de primers. Het zorgt er ook voor dat de test drie unieke locaties in het Zika-genoom herkent om de specificiteit ervan te verbeteren. Selecteer de parameters die u wilt gebruiken voor de ontwerpfunctie: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file, opties). Vul de parameterwaarden in als:num_designs – het aantal topontwerpen voor elke doeluitvoer door de software. De standaardwaarde is 6 en kan indien nodig worden gewijzigd (een minimum van zes ontwerpen voor elk doel wordt aanbevolen). input_file – deze parameter geeft de naam op van het bestand dat de informatie over de invoerreeks bevat. De standaardwaarde is ‘design_input_file.csv’ en kan indien nodig worden gewijzigd. Kies uit de volgende opties – (1) SeriesA en SeriesB: de versie(s) van de toehold-schakelaar die de code zal genereren. Stel SeriesB in op 1 en SeriesA op 0 om serie B-sleufschakelaar te genereren, het formaat dat wordt gebruikt in de Zika-virusdiagnose6; (2) Parallel: ingesteld op 1 om meerdere kernen te gebruiken om de ontwerpen te berekenen; anders ingesteld op 0; (3) Antisense: ingesteld op 1 om toehold-schakelaars te genereren die de antisense-sequentie (d.w.z. het omgekeerde complement) van de doelingang hybridiseren; anders ingesteld op 0. Voer de ontwerpfunctie uit met de geselecteerde parameters: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file,options). Het algoritme zal dan beginnen met het genereren van de toehold switch ontwerpen voor de doelen van belang. Zoek na voltooiing van het ontwerp de ontwerpsequenties van de bovenste toehold-switch en de bijbehorende doelsequenties in de map final_designs in de vorm van spreadsheets met .csv indeling. De DOOR het algoritme gegenereerde sequenties van de sleufschakelaar bevatten de T7-promotorsequentie aan het 5′-uiteinde en de geconserveerde 21-nt linkersequentie AACCTGGCGGGGGCGCAAAAG aan het 3′-uiteinde. Scherm de resulterende ontwerpsequenties van de bovenste sleufschakelaar af tegen andere veel voorkomende virussen door ze op NCBI-BLAST te zetten en te controleren op sequentie homologie. Accepteer sequenties met 40% homologie of minder. Bestel de haarspeldbochtsequenties van de toehold switch als DNA-oligo’s en monteer ze later met het reporter-gen tot volledig functionele schakelaars. Bestel de benodigde PCR-primers voor de volgende sensorassemblage, afhankelijk van het rapporteiwit van keuze. Parameter Definitie Naam De gewenste namen van de uitgangsneus geschakelde sequenties. Buitenste reeks Volledig NASBA-transcript geproduceerd uit versterking. Innerlijke volgorde De buitenste reeks met uitzondering van de primerbindingsplaatsen. Het komt overeen met de buitenste reeks, maar sluit de delen van de transcripties uit die binden aan de voorwaartse en omgekeerde primers. Temperatuur De temperatuur die door de algoritmen wordt gebruikt om de RNA-structuren te berekenen. Uitvoernaam De naam van het uitgangsgen (bijv. lacZ, gfp). Uitvoervolgorde De sequentie van het uitgangsgen. Tabel 1: De definitie van elke parameter die wordt gebruikt in de toehold switchdesign software. 3. Constructie van grijpschakelaars door PCR OPMERKING: Deze stappen beschrijven de constructie van LacZ-sleufschakelaars door overlapuitbreiding PCR. Hier wordt het DNA-oligo gebruikt als forward primer en de T7 terminator als reverse primer. We gebruiken het pCOLADuet-LacZ plasmide als sjabloon voor het lacZ-gen (addgene: 75006). Alle andere DNA-sjablonen die de overeenkomstige sequentie bevatten, kunnen als sjablonen worden gebruikt, op voorwaarde dat de T7-terminator wordt opgenomen in de uiteindelijke constructie. Zodra synthetische DNA-oligo’s van de commerciële leverancier zijn ontvangen, bereidt u oplossingen van het synthetische DNA en omgekeerde amplificatieprimer in een concentratie van 10 μM in nucleasevrij water. Monteer reacties in PCR-buizen op ijs volgens tabel 2.OPMERKING: PCR-volumes kunnen naar behoefte worden geschaald. Gebruik een minimale hoeveelheid (0,1-1 ng) pCOLADuet-LacZ DNA-sjabloon om te voorkomen dat een extra plasmideverwijderingsstap of achtergrond LacZ-signaal nodig is. Voor hogere hoeveelheden DNA-sjablonen volgt u de PCR met een DpnI-restrictie-enzym digest om de resterende plasmidesjabloon te verwijderen. Plaats de reacties in een thermische cycler, volgens de in tabel 3 vermelde fietsomstandigheden. Analyseer de PCR-producten op een agarose-gel (figuur 2; zie aanvullend protocol en30). Zuiver de PCR-producten met behulp van een pcr-zuiveringskit op basis van een spinkolom en eluteer het DNA in 15-30 μL nucleasevrij water, volgens de instructies van de fabrikant. Kwantificeer het DNA met behulp van een spectrofotometer. Bestanddeel Volume Concentratie 5x Q5-reactiebuffer 10 μL 1x 10 mM dNTPs 1 μL 200 μM 10 mM Forward Primer (Synthetische Schakelaar DNA FW) 2,5 μL 0,5 μM 10 mM Omgekeerde Primer (T7 terminator RV) 2,5 μL 0,5 μM Sjabloon DNA (pCOLADuet-LacZ) veranderlijk <1 ng Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0,5 μL 0,02 U/μL Nucleasevrij water tot 50 μL – Tabel 2: De PCR-componenten die worden gebruikt om toehold-schakelaars te bouwen. Stap Temperatuur Tijd Initiële denaturatie 98 °C 30 s 35 cycli Denaturatie 98 °C 10 s Annealing 60 °C 20 s Extensie 72 °C 1.45 min Definitieve verlenging 72 °C 5 min. Houden 4 °C – Tabel 3: Fietsomstandigheden die worden gebruikt bij de bouw van grijpschakelaars door PCR. 4. Bereiding van synthetisch RNA-doelwit (Trigger) Gebruik een moleculair biologische ontwerpsoftware om de synthetische trigger-RNA-sjablonen (geselecteerd in stap 1.1) aan te passen om een upstream T7-promotorsequentie op te nemen, zodat de volledige sjabloon kort blijft (<200 bp). Ontwerp voorwaartse en omgekeerde primers om de trigger sequence primer te versterken (voor oligosequenties zie Aanvullend Protocol). Rangschik de sequenties als DNA-oligo’s. Na ontvangst reconstitueer je het synthetische trigger-DNA en de amplificatieprimers tot 10 μM in nucleasevrij water. Monteer de overeenkomstige PCR’s in dunwandige buizen op ijs volgens tabel 2 en gebruik 0,5 μL van het trigger-DNA-ultrameer (uiteindelijke concentratie van 0,1 μM) als sjabloon-DNA. Plaats de reacties in een thermische cycler en gebruik de in tabel 3 vermelde fietsomstandigheden. Gebruik een verlengingstijd van 15 s. Beoordeel de kwaliteit en zuiver trigger PCR-producten zoals beschreven in stap 3.3 en het Aanvullend Protocol.OPMERKING: Om het proces te versnellen, kunnen kolomgezuiverde trigger PCR-producten ook direct worden gebruikt voor de initiële screening van de grijpschakelaar. 5. In vitro transcriptie van geselecteerde triggersequenties Monteer reactiecomponenten op ijs volgens tabel 4. Incubeer in vitro transcriptie (IVT) reacties bij 37 °C gedurende 4 uur, gevolgd door DNase I-behandeling om het sjabloon-DNA te verwijderen. Voeg voor de DNase I-stap 70 μL nucleasevrij water, 10 μL 10x DNase I-buffer en 2 μL DNase I (RNase-vrij) toe en incubeer bij 37 °C gedurende 15 minuten. Als u niet onmiddellijk doorgaat naar stap 5.4, inactiveer DNase I dan met de toevoeging van 50 mM EDTA en warmte-inactivering bij 65 °C gedurende 10 minuten. Optionele stap: Voer denaturerende polyacrylamide-gel-elektroforese (bijv. ureum-PAGE) analyse uit op de IVT-producten om de RNA-kwaliteit te beoordelen zoals beschreven in het aanvullend protocol. Zuiver de trigger IVT-producten met behulp van een kolomgebaseerde RNA-opruimkit volgens de instructies van de fabrikant en kwantificeer vervolgens de RNA-concentratie en zuiverheid met behulp van spectrofotometrie. Zie het Aanvullend Protocol voor instructies over het bepalen van de molariteit en het kopienummer/μL van het RNA. Bestanddeel Volume Concentratie 10x reactiebuffer 1,5 μL 0,75x 25 mM NTP mix 6 μL 7,5 mM Template trigger DNA X μL 1 μg T7 RNA Polymerase Mix 1,5 μL – Nucleasevrij water X μL Tot 20 μL Tabel 4: In vitro transcriptie (IVT) van geselecteerde triggersequenties. 6. Eerste screening van de schakelaars OPMERKING: In dit gedeelte worden de stappen beschreven die gepaard gaan met het instellen van celvrije, op papier gebaseerde toehold-switchreacties en hoe u kunt screenen op goed presterende toehold-schakelaars. Het BSA-geblokkeerde filterpapier dat in stap 6.10 is gebruikt, moet van tevoren worden voorbereid zoals beschreven in het Aanvullend Protocol. Bereid een CPRG-stockoplossing door 25 mg van het poeder op te lossen in 1 ml nucleasevrij water. Bewaar de oplossing te allen tijde op ijs en bewaar bij -20 °C voor langdurig gebruik. Bepaal het aantal reacties dat moet worden ingesteld. Neem voor elke beoordeelde toehold-switch een no template control op (geen switch en geen target-RNA- ook wel bekend als cell-free alone control) om rekening te houden met elk achtergrondsignaal dat kan voortvloeien uit de mastermix. Neem een schakelaar alleen controle op om te beoordelen op de achtergrondschakelaar lekkage of UIT-snelheid in afwezigheid van doel-RNA. Stel een celvrije reactiemastermix van oplossing A, oplossing B, RNase-remmer en CPRG samen op ijs volgens het standaardprotocol in tabel 5.OPMERKING: De hier beschreven stappen zijn voor een hoofdmix die voldoende is voor een drievoudige set van 1,8 μL-reacties met toegevoegd volume van 10% om rekening te houden met pipetteerfouten. Het mastermixvolume moet indien nodig worden aangepast, afhankelijk van het aantal afgeschermde toehold-schakelaars. Voor elke drievoudige celvrije reactie doseert u de mastermix in een PCR-buis, waarbij alle buizen op ijs blijven. Voor de buis die opzij is gezet als de celvrije alleen-regeling, voeg nucleasevrij water toe aan een eindvolume van 5,84 μL, meng door op en neer te pipetteren en centrifugeer kort. Voeg voor de rest van de buizen PCR-gezuiverd sleufschakelaar-DNA toe aan een eindconcentratie van 33 nM. Voor buizen die alleen als schakelaar zijn gereserveerd, voegt u nucleasevrij water toe aan een eindvolume van 5,84 μL. Voor buizen die zijn gereserveerd om de toehold-schakelaar en doel-RNA-combinatie te testen, voegt u in vitro getranscribeerd doel-RNA toe aan een eindconcentratie van 1 μM. Voeg vervolgens nucleasevrij water toe aan een eindvolume van 5,84 μL. Meng alle reacties grondig door op en neer te pipetteren en centrifugeer kort. Voeg 30 μL nucleasevrij water toe aan de putten rond de reactieputten op een zwarte, heldere bodemplaat van 384 goed. Dit minimaliseert verdamping in de loop van het experiment en verbetert de reproduceerbaarheid.OPMERKING: Als u het draagbare plaatlezerapparaat gebruikt, plaatst u een PCR-folie over de plaat en gebruikt u een precisiemes om de putten uit te snijden die bedoeld zijn voor uw reactie, evenals elk van de vier hoekputten. De PCR-folie voorkomt dat de draagbare plaatlezer camera overbelicht raakt door lege putten. Snijd met behulp van een 2 mm biopsiepons en pincet BSA-geblokkeerde filterpapierschijven en plaats ze in de reactieputten door de pons uit te werpen of door een pincet te gebruiken (zie Aanvullend Protocol voor het bereiden van BSA-geblokkeerd filterpapier). Dispense drievoudige volumes van 1,8 μL van elke reactiebuis op de filterpapierschijven in de 384-well plaat, waarbij alle monsters, evenals de 384-well plaat, te allen tijde op ijs worden gehouden.OPMERKING: Als u het draagbare plaatlezerapparaat gebruikt, voegt u 1,8 μL CPRG (0,6 mg /ml) toe aan elk van de vier hoeken van de 384-well plaat. De gele kleur van de CPRG biedt patroonherkenning aan de draagbare plaatlezer voor uitlijning van de digitale multiwell-plaatsjabloon in beeldanalyse. Bedek de putten van de plaat met PCR-film om verdamping te voorkomen. Plaats de plaat in een plaatlezer, lees OD570 bij 37 °C elke minuut gedurende 130 min. Bestanddeel Volume Eindconcentratie per reactie Oplossing A 2,38 μL 40% Oplossing B 1,78 μL 30% RNase-remmer 0,03 μL 0,5% v/v CPRG (25 mg/ml) 0,14 μL 0,6 mg/ml Toehold Schakelaar X μL 33 nM Doel-RNA X μL 1 μM Nucleasevrij water tot 5,94 μL – Totaal volume: 5,94 μL Tabel 5: PURExpress celvrije transcriptie-translatiereactiecomponenten. 7. Het identificeren van goed presterende grijpschakelaars OPMERKING: In dit gedeelte wordt beschreven hoe u gegevens uit stap 6 kunt analyseren om de best presterende toehold-switches te selecteren om mee verder te gaan. Begin met gegevensanalyse door eerst te normaliseren naar de od570-absorptie op de achtergrond. Om dit te doen, trekt u de OD570-metingen van reacties die geen schakelaar of doel-RNA hebben (d.w.z. celvrije alleen putten) af van de andere OD570-metingen . Maak de genormaliseerde gegevens glad met behulp van een driepunts voortschrijdend gemiddelde en stel de minimumwaarde van elke put in op nul. Zie figuur 3 voor een voorbeeld van genormaliseerde tijdsverloopgegevens die zijn verzameld voor de sleufschakelaars 27B, 33B en 47B. Bereken met behulp van deze verwerkte gegevens de vouwverandering (of AAN/UIT-verhouding) door het verschil te bepalen in de snelheid van kleurverandering (d.w.z. verandering in OD570 in de loop van de tijd) tussen de teengreepschakelaar en de doel- en schakelputten (zie aanvullend protocol voor het berekenen van de verhouding; Figuur 4). Selecteer schakelaars met de hoogste AAN/UIT-vouwverandering voor verdere karakterisering. Laat de slecht presterende klepschakelaars weg die de laagste vouwverandering weergeven. 8. Screening en gevoeligheid van amplificatieprimers op basis van nucleïnezuursequentie OPMERKING: In de volgende stappen wordt eerst een screening uitgevoerd op functionele isotherme amplificatieprimers en vervolgens wordt hun gevoeligheid beoordeeld door het aantal doel-RNA-kopieën per μL synthetisch RNA te bepalen dat een bepaalde toehold-schakelaar betrouwbaar kan detecteren in combinatie met isothermische amplificatie. Voer na isothermische amplificatie celvrije reacties uit om succesvolle op nucleïnezuursequentie gebaseerde amplificatieprimersets te identificeren. Het kan echter kosteneffectiever zijn om polyacrylamide of agarose-gels uit te voeren op op nucleïnezuursequentie gebaseerde amplificatiereacties om eerst de pool van kandidaat-primersets te verkleinen. In dat geval kunnen op nucleïnezuur gebaseerde amplificatieprimersets die een band op de gel genereren met de juiste amplicongrootte op de shortlist worden geplaatst voor daaropvolgende celvrije screening. Maak een 25 μM stockoplossing van alle voorwaartse en omgekeerde primersets in nucleasevrij water (zie Aanvullend Protocol). Bepaal het aantal op nucleïnezuursequentie gebaseerde amplificatiereacties en de daaropvolgende celvrije reacties die moeten worden opgezet. Dit is afhankelijk van het aantal toehold switches en respectievelijke primersets.OPMERKING: Bij het screenen van de primers is het belangrijk om altijd een no template-besturingselement voor elke primerset op te nemen om rekening te houden met eventuele achtergrondartefacten die kunnen ontstaan als gevolg van primer-geassocieerde niet-specifieke versterking. Stel als volgt een reactie van 5 μL in (schaal deze indien nodig). Ontdooi alle reagentia op ijs. Stel een reactiemastermix samen van de reactiebuffer, nucleotidemix en RNase-remmer volgens tabel 6. Meng grondig door op en neer te pipetteren totdat het witte neerslag is opgelost en doseer vervolgens aliquots in PCR-buizen.Als de mastermix bedoeld is voor het screenen van op nucleïnezuur sequentie gebaseerde amplificatieprimers, sluit dan eerst de primers uit van de mastermix (dispense 2,55 μL mastermix). Anders kunnen, als u een primergevoeligheidsanalyse uitvoert, de primers worden opgenomen in de mastermix (in welk geval 2,75 μL aliquots worden verstrekt). Voeg het enzymmengsel toe na de denaturatie- en evenwichtsfasen. Als u nucleïnezuursequentie-gebaseerde amplificatieprimers screent, voegt u de voorste en omgekeerde primers toe aan de juiste buizen. Stel op een thermische cycler het incubatieprotocol in zoals beschreven in tabel 7. Voeg 1 μL nucleasevrij water of 1 μL doeltrigger-RNA toe bij 2 pM of ongeveer 106 kopieën /μL, en zorg ervoor dat de buisjes dienovereenkomstig worden geëtiketteerd. Meng door zachtjes te pipetteren en draai kort door de buizen.OPMERKING: Gebruik voor primer set screening een concentratie van target trigger RNA die hoog genoeg is om de ondergrens van detectie van de isotherme amplificatiemethode niet te beïnvloeden, maar niet hoog genoeg om activering van de toehold-schakelaar te bieden als er geen versterking zou optreden. Verplaats de buizen naar de thermische cycler en start de incubatie. Verwijder na 12 minuten de buisjes en voeg 1,25 μL van het enzymmengsel toe aan elke buis. Meng door op en neer te pipetteren en centrifugeer de buizen kort.OPMERKING: Op dit punt kunnen de buizen op kamertemperatuur worden gehouden; het enzymmengsel moet echter op ijs worden bewaard totdat het aan de buisjes wordt toegevoegd. Breng de buizen terug naar de thermische cycler en sla de 41 °C hold-stap over om de 1 uur reactie-incubatie te starten.OPMERKING: Na incubatie kunnen de reacties op ijs worden geplaatst voor verwerking op dezelfde dag of worden ingevroren bij -20 °C voor latere verwerking. Volg de stappen 6.2-6.7 en tabel 8 om op papier gebaseerde celvrije toehold-schakelreacties samen te stellen om de primerprestaties te beoordelen. Analyseer gegevens zoals beschreven in stap 7.1-7.2 en figuur 3.OPMERKING: Naast de eerder genoemde controles is het belangrijk om ook de negatieve controle op te nemen om rekening te houden met elk achtergrondsignaal dat uit de reactie kan voortvloeien. Daarnaast is het belangrijk om ook een controle met de schakelaar en 2 pM (eindconcentratie) van doel-RNA op te nemen, als een no-NASBA-amplificatiecontrole. Identificeer kandidaat-primerparen om verder te gaan met gevoeligheidsanalyse. Primerparen worden geselecteerd op basis van de vraag of de activering van de toehold-schakelaar optreedt na de toevoeging van de geïncubeerde reactie. Herhaal indien nodig het primerscherm met meer primercombinaties. Houd RNA-monsters te allen tijde op ijs en maak de volgende seriële verdunningsset van doel-RNA’s in nucleasevrij water: 104, 103, 102, 101 en 100 RNA-kopieën / μL. Herhaal op nucleïnezuursequentie gebaseerde amplificatie en celvrije reacties met de geselecteerde primersets (stappen 8.2-8.7), waarbij de seriële verdunningsreeks wordt getest om de primersets te identificeren die de beste gevoeligheid bieden. Zie figuur 5 voor een voorbeeld van resultaten voor het bepalen van de gevoeligheid van de primerset.OPMERKING: Idealiter zouden de geselecteerde toehold-schakelaar en het primerpaar slechts 1-100 doel-RNA-kopieën per μL van het RNA (stockoplossingconcentratie) moeten detecteren. Herhaal het op nucleïnezuur gebaseerde amplificatiegevoeligheidsexperiment in biologisch triplicaat. Deze stap dient om de reproduceerbaarheid van de resultaten te bevestigen voordat u overgaat tot experimenten met patiëntmonsters. Facultatief: Om een betrouwbare bron van het switch-DNA te hebben voor langdurig gebruik en voor transport, kloont u de geselecteerde switchvolgorde(s) in een plasmide met behulp van een conventionele kloonmethode. Op dezelfde manier kan de RNA-sequentie van de doeltrigger ook worden gekloond in een plasmide naar keuze voor opslag. Bestanddeel Volume per reactie Eindconcentratie NASBA-reactiebuffer 1,67 μL 1x NASBA Nucleotide Mix 0,833 μL 1x 25 μM Voorwaartse Primer 0,1 μL 0,5 μM 25 μM Omgekeerde Primer 0,1 μL 0,5 μM RNase-remmer (40 U/μL) 0,05 μL 0,4 U/μL Doel-RNA 1 μL NASBA Enzym Mix 1,25 μL 1x Totaal volume 5 μL Tabel 6: NASBA-reactiecomponenten. Stap Temperatuur Tijd Denaturatie 65 °C 2 min. Evenwicht 41 °C 10 min. Houden 41 °C ∞ Incubatie 41 °C 1 u Houden 4 °C – Tabel 7: Reactieomstandigheden voor de NASBA. Bestanddeel Volume Eindconcentratie per reactie Oplossing A 2,38 μL 40% Oplossing B 1,78 μL 30% RNase-remmer 0,03 μL 0,5% v/v CPRG (25 mg/ml) 0,14 μL 0,6 mg/ml Toehold Schakelaar X μL 33 nM Doel-RNA (indien van toepassing) X μL 1 μM NASBA (indien van toepassing) 0,85 μL 1:7 Nucleasevrij water tot 5,94 μL – Totaal volume: 5,94 μL Tabel 8: Op papier gebaseerde celvrije reactiecomponenten. 9. Verzameling van patiëntmonsters en virale RNA-extractie OPMERKING: In dit gedeelte wordt het protocol beschreven om patiëntmonsters te verzamelen en het RNA te extraheren met behulp van een RNA-zuiveringskit. Het onderstaande protocol wordt gebruikt om serum uit perifeer bloed te verkrijgen. De monsters die in deze studie werden gebruikt, werden verzameld van patiënten met koorts, exantheem, artralgie of andere gerelateerde symptomen van arbovirusinfectie in de staat Pernambuco, Brazilië. Verzamel perifere bloedmonsters van vermoedelijk met arbovirus geïnfecteerde patiënten. Voer venapunctie (volbloedbuis) uit met behulp van een standaard aseptische techniek. Label de monsterbuizen met een anonieme code en de datum van monsterverzameling. Centrifugeer bloed om het serum te scheiden op 2.300 x g gedurende 10 minuten. Bereid met behulp van een pipet aliquots serum (200 μL) die zullen worden gebruikt voor RNA-extractie in buizen van 1,5 ml.OPMERKING: Als het niet mogelijk is om de RNA-extractie kort na het verzamelen van het monster uit te voeren, moeten serummonsters worden bewaard bij -80 °C voorafgaand aan downstream-toepassingen. Pipetteer 560 μL bereide buffer AVL (virale lysisbuffer) met het drager-RNA in een buisje van 1,5 ml. Voeg 140 μL serum toe aan het buffer AVL/drager-RNA-mengsel in de buis. Mix door puls-vortexing gedurende 15 s. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer het monster vervolgens kort om de inhoud op de bodem van de buis te verzamelen. Voeg 560 μL ethanol (96%-100%) toe aan het monster en meng door puls-vortexing gedurende 15 s. Na het mengen, centrifugeer het monster om de inhoud op de bodem van de buis te verzamelen. Voeg voorzichtig 630 μL van de oplossing uit stap 9.4 toe aan de spinkolom zonder de rand nat te maken. Sluit na deze stap de dop en centrifugeer gedurende 1 minuut op 6.000 x g . Plaats de spinkolom in een schone opvangbuis van 2 ml en gooi de gebruikte opvangbuis met het filtraat weg. Open voorzichtig de spin-kolom en herhaal stap 9.5. Open voorzichtig de spinkolom en voeg 500 μL Buffer AW1 (wasbuffer 1) toe. Sluit de dop en centrifugeer gedurende 1 minuut op 6.000 x g . Plaats de spinkolom in een schone opvangbuis van 2 ml en gooi de gebruikte opvangbuis met het filtraat weg. Open voorzichtig de spinkolom en voeg 500 μL Buffer AW2 (wasbuffer 2) toe. Sluit de dop en centrifugeer gedurende 3 minuten op 20.000 x g . Plaats de spinkolom in een schone opvangbuis van 2 ml en gooi de gebruikte opvangbuis met het filtraat weg. Om verontreiniging door restbuffer AW2 te voorkomen, die problemen kan veroorzaken in downstream enzymatische reacties, plaatst u de spinkolom in een schone 2 ml opvangbuis en gooit u de gebruikte opvangbuis weg met het filtraat. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 1 min. Plaats de spinkolom in een schone buis van 1,5 ml en gooi de gebruikte opvangbuis met het filtraat weg. Open voorzichtig de spinkolom en voeg 60 μL buffer AVE (elutiebuffer) toe, op kamertemperatuur gebracht. Sluit na deze stap de dop en incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Centrifugeer bij 6.000 x g gedurende 1 min. Het geëlueerde RNA kan vervolgens parallel worden gebruikt als input voor de NASBA en RT-qPCRs. Volg stap 8.3 tot en met 8.11 om de op nucleïnezuursequentie gebaseerde amplificatie en op papier gebaseerde celvrije reacties uit te voeren met behulp van 1 μL geëxtraheerd patiënt-RNA, waarbij ervoor wordt gezorgd dat negatieve en positieve controlereacties worden opgenomen. Bereid na de reacties de 384-well reactieplaat voor en voer de test uit in de draagbare plaatlezer bij 37 °C (zie details in het Aanvullend Protocol).OPMERKING: Twee RNA-concentraties van 104 en 102 PFU / ml, geëxtraheerd uit gekweekt zikavirus, worden gebruikt als positieve controles voor alle experimenten tijdens de klinische validatie. Naast de eerder genoemde controles is het belangrijk om ook de trigger (10 ng/μL) als positieve controle op te nemen. Aan het einde van elk experiment kunnen de onbewerkte gegevens (.csv bestand) van de prtable plate reader online worden geüpload naar een beveiligde database. Bovendien genereert de draagbare plaatlezer een rapport dat aangeeft of monsters positief of negatief zijn voor het Zika-virus (figuur 6); zie de sectie representatieve resultaten voor voorbeelden van alle grafieken die tijdens de incubatie zijn verkregen (figuur 7).OPMERKING: Gebruikers kunnen ook bestanden van de draagbare plaatlezer via de USB naar hun eigen computer overbrengen. 10. Draagbaar plaatlezerapparaat Het draagbare plaatlezerapparaat (figuur 8) kan worden gebruikt als alternatief voor een conventionele plaatlezer24. Voor het protocol en de representatieve resultaten, zie Aanvullend Protocol. 11. RT-qPCR voor Zika virus detectie OPMERKING: In deze sectie worden de stappen beschreven voor het uitvoeren van de RT-qPCR voor Zika-virusdetectie op basis van patiëntmonsters (zie Aanvullend Protocol). Om verontreiniging te voorkomen, assembleert u de RT-qPCR-componenten in een gebied dat geïsoleerd is van het versterkingsproces (bijv. clean-hood). Plaats de RT-qPCR-buffer, enzymen en primer/sondes op ijs of een koudblok. Voeg hierna de reacties toe aan een plaat met 384 putten op ijs volgens tabel 9.OPMERKING: Negatieve (extractiecontrole en niet-sjablooncontrole [NTC]) en positieve controle (104 PFU / ml) worden aanbevolen voor alle experimenten. Nadat u de reagentia aan een microcentrifugebuis van 1,5 ml hebt toegevoegd, mengt u de reactie door op en neer te pipetteren (vortex niet) en doseert u 6,5 μL in elke put. Voeg 3,5 μL van elke RNA-sjabloon toe in drievoud. Plaats een PCR-film over de bovenkant van de plaat. Centrifugeer de 384-well plaat op 600 x g gedurende 2 min. Plaats de plaat in een RT-qPCR-machine met behulp van de volgende in tabel 10 beschreven cyclusomstandigheden. Om de resultaten te analyseren, gebruikt u de RT-qPCR-machineontwerp- en analysesoftware en houdt u rekening met de automatische drempel en basislijn (zie details in het Aanvullend Protocol). Bestanddeel Volume Concentratie 2x QuantiNova Probe RT-PCR Master Mix | 5 μL 1 x 100 μM Voorwaartse Primer 0,08 μL 0,8 μM 100 μM Omgekeerde Primer 0,08 μL 0,8 μM 25 μM sonde 0,04 μL 0,1 μM QuantiNova ROX Referentiekleurstof 0,05 μL 1 x QuantiNova Probe RT Mix 0,1 μL 1 x Sjabloon RNA 3,5 μL – Nucleasevrij water tot 10 μL – Tabel 9: RT-qPCR-componenten om Zika-virus-RNA te versterken op basis van het Centers for Disease Control and Prevention-CDC USA-protocol om het Zika-virus uit patiëntmonsters te detecteren31. Stap Temperatuur Tijd Reverse transcriptie 45 °C 15 min. PCR initiële activeringsstap 95 °C 5 min. 45 cycli Denaturatie 95 °C 5 s Gecombineerd gloeien/verlengen 60 °C 45 s Tabel 10: Fietsomstandigheden voor RT-qPCR.