Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics

Katariina Jaenes; Severino Jefferson Ribeiro da Silva; Justin R. J. Vigar; Kaiyue Wu; Masoud Norouzi; Pouriya Bayat; Margot Karlikow; Seray Cicek; Yuxiu Guo; Alexander A. Green; Lindomar Pena; Keith Pardee

doi:10.3791/63223

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioengineering

تصميم إلى دراسة التنفيذ من أجل التطوير والتحقق من صحة المريض لتشخيصات مفتاح تثبيت إصبع القدم الورقية

Published: June 17, 2022

doi:

10.3791/63223

Katariina Jaenes*¹, Severino Jefferson Ribeiro da Silva*^1,2, Justin R. J. Vigar*¹, Kaiyue Wu^3,4, Masoud Norouzi¹, Pouriya Bayat¹, Margot Karlikow¹, Seray Cicek¹, Yuxiu Guo¹, Alexander A. Green^3,4, Lindomar Pena², Keith Pardee^1,5

¹Leslie Dan Faculty of Pharmacy,University of Toronto, ²Laboratory of Virology and Experimental Therapy (LAVITE), Department of Virology, Aggeu Magalhães Institute (IAM),Oswaldo Cruz Foundation (Fiocruz), ³Department of Biomedical Engineering,Boston University, ⁴Molecular Biology, Cell Biology & Biochemistry Program, Graduate School of Arts and Sciences,Boston University, ⁵Department of Mechanical and Industrial Engineering,University of Toronto

Summary

يعد الوصول إلى التشخيصات اللامركزية ومنخفضة التكلفة وعالية السعة التي يمكن نشرها في المجتمع للاختبار اللامركزي أمرا بالغ الأهمية لمكافحة الأزمات الصحية العالمية. تصف هذه المخطوطة كيفية بناء تشخيصات ورقية لتسلسلات الحمض النووي الريبي الفيروسي التي يمكن اكتشافها باستخدام قارئ بصري محمول.

Abstract

إن الوصول إلى التشخيصات الجزيئية منخفضة العبء التي يمكن نشرها في المجتمع للاختبار أمر متزايد الأهمية وله آثار أوسع ذات مغزى على رفاهية المجتمعات والاستقرار الاقتصادي. شهدت السنوات الأخيرة ظهور العديد من طرق التشخيص الجديدة متساوية الحرارة لتلبية الحاجة إلى التشخيص الجزيئي السريع والمنخفض التكلفة. لقد ساهمنا في هذا الجهد من خلال تطوير التشخيصات القائمة على تبديل أصابع القدم والتحقق من صحتها ، بما في ذلك تشخيص فيروسات زيكا وشيكونغونيا التي ينقلها البعوض ، والتي قدمت أداء مشابها للمقايسات القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (RT-qPCR) المعياري الذهبي. هذه التشخيصات غير مكلفة لتطويرها وتصنيعها ، ولديها القدرة على توفير القدرة التشخيصية للبيئات منخفضة الموارد. هنا يوفر البروتوكول جميع الخطوات اللازمة لتطوير مقايسة قائمة على التبديل للكشف عن فيروس زيكا. تأخذ المقالة القراء خلال عملية تطوير التشخيص التدريجي. أولا، تعمل التسلسلات الجينومية لفيروس زيكا كمدخلات للتصميم الحسابي للمفاتيح المرشحة باستخدام برمجيات مفتوحة المصدر. بعد ذلك ، يتم عرض تجميع أجهزة الاستشعار للفحص التجريبي مع تسلسل الحمض النووي الريبي الاصطناعي وتحسين الحساسية التشخيصية. بمجرد الانتهاء ، يتم إجراء التحقق من الصحة مع عينات المرضى بالتوازي مع RT-qPCR ، وقارئ بصري مصمم لهذا الغرض ، PLUM. يوفر هذا العمل خارطة طريق تقنية للباحثين لتطوير أجهزة استشعار منخفضة التكلفة قائمة على مفتاح تثبيت القدم للتطبيقات في صحة الإنسان والزراعة والرصد البيئي.

Introduction

ظل RT-qPCR التكنولوجيا القياسية الذهبية للتشخيص السريري نظرا لحساسيته وخصوصيته الممتازة. على الرغم من قوتها العالية ، إلا أن الطريقة تعتمد على معدات وكواشف باهظة الثمن ومتخصصة تتطلب توزيعا وتخزينا يتم التحكم في درجة حرارتهما. وهذا يشكل حواجز كبيرة أمام إمكانية الوصول إلى وسائل التشخيص الجيدة على الصعيد العالمي، لا سيما في أوقات تفشي الأمراض وفي المناطق التي يكون فيها الوصول إلى المختبرات المجهزة تجهيزا جيدا محدودا ^1,2. وقد لوحظ ذلك خلال فاشية فيروس زيكا 2015/2016 في البرازيل. مع توفر خمسة مختبرات مركزية فقط لتوفير اختبار RT-qPCR ، نتج عن ذلك اختناقات كبيرة ، مما حد من الوصول إلى التشخيص. كان هذا تحديا خاصا للأفراد في المناطق شبه الحضرية ، الذين تأثروا بشدة بالفاشية ^3,4. في محاولة لتحسين الوصول إلى التشخيصات ، يظهر البروتوكول منصة تم تطويرها مع إمكانية توفير تشخيصات لامركزية ومنخفضة التكلفة وعالية السعة في البيئات منخفضة الموارد. كجزء من هذا ، تم إنشاء خط أنابيب اكتشاف تشخيصي ، يقترن بالتضخيم متساوي الحرارة وأجهزة استشعار اصطناعية قائمة على مفتاح الحمض النووي الريبي مع أنظمة التعبير الخالية من الخلايا الورقية ^5,6.

تعد أنظمة تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) ، ولا سيما الأنظمة الخالية من الخلايا القائمة على الإشريكية القولونية ، منصة جذابة لمجموعة واسعة من تطبيقات الاستشعار الحيوي من المراقبة البيئية ^7,8 إلى تشخيص مسببات الأمراض⁵،⁶،⁹،¹⁰،¹¹^،¹² . تتألف أنظمة CFPS من المكونات اللازمة للنسخ والترجمة ، ولها مزايا كبيرة على أجهزة الاستشعار الحيوية للخلية الكاملة. على وجه التحديد ، لا يقتصر الاستشعار على جدار الخلية ، وبشكل عام ، فهي معيارية في التصميم ، وآمنة بيولوجيا ، وغير مكلفة ، ويمكن تجفيفها بالتجميد للاستخدام المحمول. تتيح القدرة على تجميد التفاعلات القائمة على دائرة الجينات الجافة على ركائز مثل الورق أو المنسوجات النقل والتخزين طويل الأجل في درجة حرارة الغرفة⁵ وحتى دمجها في التكنولوجيا القابلة للارتداء¹³.

وقد أظهرت الأعمال السابقة أنه يمكن استخدام النظم الخالية من خلايا الإشريكية القولونية للكشف عن العديد من التحليلات، على سبيل المثال، المعادن السامة مثل الزئبق، والمضادات الحيوية مثل التتراسيكلين⁷،14، والمواد الكيميائية المسببة لاضطرابات الغدد الصماء 15،16، والمؤشرات الحيوية مثل حمض الهيبوريك 17، وجزيئات استشعار النصاب المرتبطة بمسببات الأمراض⁹،18 والمواد غير المشروعة مثل الكوكايين¹⁷^، وغاما هيدروكسي بوتيرات (GHB)¹⁹. بالنسبة للكشف عن الأحماض النووية الخاصة بالتسلسل ، اعتمدت الاستراتيجيات في معظمها على استخدام أجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على التبديل إلى جانب تقنيات التضخيم متساوي الحرارة. مفاتيح Toehold هي منظمات ريبو اصطناعية (يشار إليها أيضا باسم “المفاتيح” ببساطة في بقية النص) تحتوي على بنية دبوس شعر تمنع الترجمة النهائية عن طريق عزل موقع ربط الريبوسوم (RBS) وكودون البداية. عند التفاعل مع الحمض النووي الريبي المحفز المستهدف ، يتم تخفيف بنية دبوس الشعر ويتم تمكين الترجمة اللاحقة لإطار القراءة المفتوح^{للمراسل 20}.

يمكن أيضا استخدام التضخيم متساوي الحرارة كتشخيص جزيئي²¹ ؛ ومع ذلك ، فإن هذه الطرق عرضة للتضخيم غير النوعي ، مما قد يقلل من خصوصية الاختبار وبالتالي دقته إلى أقل من RT-qPCR ²². في العمل الذي تم الإبلاغ عنه هنا ، تم استخدام التضخيم متساوي الحرارة في المنبع لأجهزة الاستشعار القائمة على التبديل لتوفير تضخيم إشارة مشترك يتيح الكشف عن الأحماض النووية ذات الصلة سريريا (الفيمتومولار إلى الأتومولار). يوفر هذا الاقتران بين الطريقتين أيضا نقطتي تفتيش خاصة بالتسلسل توفران معا مستوى عال من الخصوصية. باستخدام هذا النهج ، أظهر العمل السابق الكشف عن فيروسات مثل Zika⁶ و Ebola⁵ و Norovirus¹⁰ ، وكذلك البكتيريا المسببة للأمراض مثل المطثية العسيرة²³ والتيفوئيد¹² المقاوم للمضادات الحيوية. في الآونة الأخيرة ، تم عرض مفاتيح تثبيت القدم الخالية من الخلايا للكشف عن SARS-CoV-2 في الجهود المبذولة لتوفير تشخيصات يمكن الوصول إليها لوباء COVID-19¹¹،¹²^،¹³.

يحدد البروتوكول التالي تطوير والتحقق من صحة مقايسة مفتاح تثبيت القدم الاصطناعية الخالية من الخلايا والورقية للكشف عن فيروس زيكا ، من تصميم أجهزة الاستشعار الحيوية السيليكو ، من خلال خطوات التجميع والتحسين ، إلى التحقق الميداني مع عينات المرضى. يبدأ البروتوكول بتصميم السيليكو لأجهزة الاستشعار القائمة على مفتاح تثبيت إصبع القدم RNA وبادئات التضخيم متساوي الحرارة الخاصة بالحمض النووي الريبي الفيروسي Zika. على الرغم من وجود العديد من طرق التضخيم متساوي الحرارة ، إلا أن استخدام التضخيم القائم على تسلسل الحمض النووي (NASBA) لزيادة تركيز هدف الحمض النووي الريبي الفيروسي الموجود في التفاعل ، مما يتيح حساسية كبيرة سريريا تم إثباته. من الناحية العملية ، تتمتع طرق التضخيم متساوي الحرارة بميزة العمل عند درجة حرارة ثابتة ، مما يلغي الحاجة إلى معدات متخصصة ، مثل الدراجات الحرارية ، والتي تقتصر عموما على المواقع المركزية.

بعد ذلك ، تم وصف عملية تجميع مستشعرات مفتاح إصبع القدم الاصطناعية مع تسلسلات ترميز المراسل من خلال PCR الامتداد المتداخل ، وفحص مستشعرات تبديل إصبع القدم الاصطناعية للحصول على الأداء الأمثل في الأنظمة الخالية من الخلايا باستخدام الحمض النووي الريبي الاصطناعي. بالنسبة لهذه المجموعة من مستشعرات فيروس زيكا، اخترنا جين lacZ الذي يشفر إنزيم β-galactosidase، القادر على شق ركيزة لونية، كلوروفينول ريد-β-D-galactopyranoside (CPRG)، لإحداث تغير في اللون الأصفر إلى الأرجواني يمكن اكتشافه بالعين أو باستخدام قارئ لوحة. بمجرد تحديد المفاتيح الاصطناعية عالية الأداء ، يتم وصف عملية فحص البادئات للتضخيم متساوي الحرارة القائم على تسلسل الحمض النووي للتسلسل المستهدف المقابل باستخدام الحمض النووي الريبي الاصطناعي للعثور على المجموعات التي توفر أفضل حساسية.

أخيرا ، يتم التحقق من أداء منصة التشخيص في الموقع في أمريكا اللاتينية (الشكل 1). لتحديد دقة التشخيص السريري ، يتم إجراء الفحص الورقي الخالي من الخلايا باستخدام عينات فيروس زيكا من المرضى. بالتوازي مع ذلك ، يتم إجراء فحص RT-qPCR القياسي الذهبي للمقارنة. لمراقبة المقايسات الخالية من الخلايا اللونية ، نقوم بتمكين القياس الكمي للنتائج في الموقع في المناطق التي لا تتوفر فيها الدراجات الحرارية. يتم أيضا تقديم قارئ الألواح المجمع يدويا المسمى محمول ، منخفض التكلفة ، سهل الاستخدام ، متعدد الوسائط (بلوم ؛ يشار إليه فيما يلي باسم قارئ الألواح المحمولة) هنا²⁴. تم تطوير قارئ الألواح المحمول في البداية كجهاز مصاحب لتشخيص مفتاح تثبيت القدم الاصطناعي الخالي من الخلايا ، ويوفر طريقة يسهل الوصول إليها لاحتضان النتائج وقراءتها بطريقة عالية الإنتاجية ، مما يوفر تحليلا برمجيا متكاملا قائما على رؤية الكمبيوتر للمستخدمين.

الشكل 1: سير العمل لاختبار عينات المرضى باستخدام تفاعلات مفتاح تثبيت القدم الورقية الخالية من الخلايا. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Protocol

يجب إجراء جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمعايير الأخلاقية والمبادئ التوجيهية ذات الصلة ، بما في ذلك المبادئ الأخلاقية للبحوث الطبية التي تشمل مواضيع بشرية التي حددها إعلان هلسنكي للجمعية الطبية العالمية. تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات البحث البشري بموجب بروتوكول الترخيص رقم CAAE: 80247417.4.0000.5190. تم التنازل عن الموافقة المستنيرة لجميع المرضى المشمولين في هذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية Fiocruz-PE (IRB) للعينات التشخيصية. ملاحظة: سيشار إلى جهاز PLUM فيما بعد باسم “قارئ اللوحات المحمولة”. 1. التصميم الحسابي لبادئات التضخيم القائمة على تسلسل الحمض النووي امسح جينوم زيكا لتحديد مجموعة من المناطق المرشحة للتضخيم التي يبلغ طولها حوالي 200 نيوكليوتيد (nt) إلى 300 nt عن طريق وضع التسلسل الجينومي في NCBI / Nucleotide BLAST25,26. قارن الجينوم بتسلسل الحمض النووي الريبي المرجعي (refseq_rna) وابحث عن المواقع التي تظل محفوظة بدرجة عالية وليس لها تماثل مع الجينوم البشري (تظل معلمات BLAST الأخرى دون تغيير). حدد موقعين على الأقل لتصميم مفتاح تثبيت القدم الاصطناعي. استخدم معايير اختيار Deiman et al.27 لإنشاء أزواج من بادئات التضخيم القائمة على تسلسل الحمض النووي الأمامي والخلفي لكل منطقة تضخيم مرشحة. باختصار ، اتبع هذه المعايير لتصميم البادئات: (1) محتوى GC بين 40٪ -60٪ ؛ (2) 20 إلى 24 نيوتن في الطول مع درجة حرارة انصهار الحمض النووي أعلى من 41 درجة مئوية ؛ (3) عدم تشغيل أربعة نيوكليوتيدات متطابقة أو أكثر ؛ (4) النوكليوتيدات النهائية 3 ‘هي قاعدة A ؛ (5) هيكل ثانوي تمهيدي منخفض واحتمال تكوين ديمر. شاشة 8-10 أزواج التمهيدي لكل منطقة مستهدفة (موصى به). إلحاق تسلسل البادئة الذي يحتوي على تسلسل المروج T7AATTC TAATACGACTCACTATAGGG AGAAGG(تسلسل المروج T7 تحته خط) بالطرف 5 ‘من البادئات الأمامية للسماح بنسخ الأمبليكونات باستخدام بوليميراز T7 RNA (RNAP). اطلب البادئات على شكل أوليجوس DNA من شركة تخليق الحمض النووي. 2. التصميم الحسابي لمفاتيح تثبيت القدم قم بتثبيت NUPACK28 الإصدار 3.2 (مجموعة تصميم الحمض النووي) بناء على الإرشادات الموجودة على موقع الويب29. استخدم نظام التشغيل UNIX و MATLAB (منصة الحوسبة الرقمية) كلغة برمجة (مستحسن). حدد التسلسلات المستهدفة (على سبيل المثال ، الجينوم الفيروسي) الخاصة بالعامل الممرض محل الاهتمام لتصميمات مفتاح تثبيت القدم كما في الخطوة 1.1. اختر تسلسلات هدف زيكا من الأمبليكونات القائمة على تسلسل الحمض النووي المتولدة في الخطوة 1.2.ملاحظة: من الناحية العملية ، يمكن تصميم واختبار إما بادئات التضخيم القائمة على تسلسل الحمض النووي أو مفاتيح تثبيت القدم الاصطناعية أولا ، اعتمادا على احتياجات المستخدمين. إذا تم بالفعل إنشاء مناطق مستهدفة معينة ذات أهمية (على سبيل المثال ، من المنشورات الحالية أو بروتوكولات التشخيص) ، فقد يحدث تصميم مفتاح تثبيت القدم وفحصه أولا ، يليه تصميم وفحص بادئات التضخيم القائمة على تسلسل الحمض النووي. إذا لم تكن هناك مناطق مستهدفة محددة ، فقم أولا بفحص بادئات التضخيم القائمة على تسلسل الحمض النووي مقابل الجينوم الكامل لتضييق نطاق الأهداف المختارة أثناء اختيار كفاءة تضخيم التمهيدي. إذا توفرت تسلسلات متعددة للممرض ، فمن الأفضل تصميم بادئات تضخيم قائمة على تسلسل الحمض النووي تركز على المناطق المحفوظة للغاية (بدلا من فحص الجينوم بأكمله). قم بتنزيل وتثبيت برنامج MATLAB المطلوب على الكمبيوتر. قم بإعداد متغيرات البيئة للسماح باستدعاء وظائف مجموعة تصميم الحمض النووي في البرنامج. للقيام بذلك، افتح البرنامج، ثم قم بفتح (أو إنشاء) ملف startup.m في مجلد العمل الافتراضي. بعد ذلك ، انسخ الأسطر التالية من التعليمات البرمجية إلى ملف startup.m وأخيرا ، أضف المجلد الذي يحتوي على ثنائيات مجموعة تصميم الحمض النووي إلى PATH:NUPACKINSTALL = ‘/المستخدمون/[user_name]/…/nupack3.2.2’;setenv (‘NUPACKINSTALL’,NUPACKINSTALL);setenv(‘PATH’,[getenv(‘PATH’),sprintf(‘:٪s/build/bin’,NUPACKINSTALL)]); افتح برنامج منصة الحوسبة الرقمية وانتقل إلى مجلد برنامج التصميم. قم بتشغيل خوارزميات التصميم التي يمكن الوصول إليها في https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN. أدخل التسلسلات الهدف في design_input_file.csv الموجود في مجلد الإدخال الفرعي. تتضمن المدخلات الاسم والتسلسل الخارجي والتسلسل الداخلي ودرجة الحرارة واسم الإخراج وتسلسل الإخراج كما هو محدد في الجدول 1. إذا لم يتم تحديد مواقع التحضير للهدف بعد ، فاحتفظ بالتسلسلات الداخلية والخارجية كما هي. سيتم النظر فقط في أول 29 nt من المراسل أثناء عملية التصميم. عند الانتهاء، احفظ جدول البيانات المحدث وأغلقه.ملاحظة: تسلسل الإخراج هو تسلسل بروتين المراسل المخطط استخدامه في الفحص (على سبيل المثال ، lacZ). يضمن تحديد التسلسلات الداخلية والخارجية أن الخوارزمية لن تولد مفاتيح تثبيت القدم الاصطناعية التي تتداخل مع أي من البادئات. كما أنه يضمن أن يتعرف الفحص على ثلاثة مواقع فريدة في جينوم زيكا لتحسين خصوصيته. حدد المعلمات المراد استخدامها لوظيفة التصميم: toehold_switch_design_run(num_designs،input_file ، خيارات). املأ قيم المعلمات على النحو التالي:num_designs – عدد أفضل التصميمات لكل إخراج مستهدف بواسطة البرنامج. الافتراضي هو 6 ويمكن تغييره حسب الحاجة (يوصى بحد أدنى ستة تصميمات لكل هدف). input_file – تحدد هذه المعلمة اسم الملف الذي يوفر معلومات تسلسل الإدخال. القيمة الافتراضية هي “design_input_file.csv” ويمكن تغييرها حسب الحاجة. اختر من بين الخيارات التالية – (1) SeriesA و SeriesB: إصدار (إصدارات) مفتاح تثبيت القدم الذي سينشئه الرمز. اضبط SeriesB على 1 و SeriesA على 0 لإنشاء مفتاح إصبع القدم من السلسلة B ، وهو التنسيق المستخدم في تشخيص فيروس زيكا6 ؛ (2) متوازي: اضبط على 1 لتسخير نوى متعددة لحساب التصاميم ؛ خلاف ذلك ، اضبط على 0 ؛ (3) Antisense: اضبط على 1 لإنشاء مفاتيح تثبيت القدم التي تهجين تسلسل antisense (أي المكمل العكسي) للإدخال المستهدف ؛ وإلا، فاضبط على 0. قم بتشغيل وظيفة التصميم باستخدام المعلمات المحددة: toehold_switch_design_run (num_designs ، input_file ، خيارات). ستبدأ الخوارزمية بعد ذلك في إنشاء تصميمات مفتاح تثبيت القدم للأهداف ذات الاهتمام. عند اكتمال التصميم ، حدد موقع تسلسلات تصميم مفتاح التبديل العلوي والتسلسلات المستهدفة المقابلة في مجلد final_designs في شكل جداول بيانات بتنسيق .csv. ستحتوي تسلسلات الحمض النووي لمفتاح تثبيت القدم التي تم إنشاؤها بواسطة الخوارزمية على تسلسل المروج T7 في نهاية 5 ‘وتسلسل الرابط 21 nt المحفوظ AACCTGGCGGCAGCGCAAAAG في نهاية 3’. قم بفحص تسلسلات تصميم مفتاح إصبع القدم العلوي الناتج مقابل الفيروسات الشائعة الأخرى عن طريق وضعها على NCBI-BLAST والتحقق من تماثل التسلسل. اقبل التسلسلات ذات التماثل بنسبة 40٪ أو أقل. اطلب تسلسل دبوس شعر تبديل إصبع القدم على شكل قلطة الحمض النووي ثم قم بتجميعها لاحقا مع جين المراسل في مفاتيح تعمل بكامل طاقتها. اطلب بادئات PCR اللازمة لتجميع المستشعر اللاحق اعتمادا على بروتين المراسل المختار. البارامتر تعريف اسم الأسماء المطلوبة لتسلسلات تبديل إصبع القدم الناتج. التسلسل الخارجي نسخة كاملة من NASBA تم إنتاجها من التضخيم. التسلسل الداخلي التسلسل الخارجي باستثناء مواقع ربط التمهيدي. يطابق التسلسل الخارجي ولكنه يستبعد أجزاء النصوص التي ترتبط بالبادئات الأمامية والخلفية. درجة الحرارة درجة الحرارة المستخدمة من قبل الخوارزميات لحساب هياكل الحمض النووي الريبي. اسم الإخراج اسم جين الإخراج (مثل lacZ ، gfp). تسلسل الإخراج تسلسل جين الإخراج. الجدول 1: تعريف كل معلمة مستخدمة في برنامج تصميم مفتاح تثبيت القدم. 3. بناء مفاتيح تثبيت القدم بواسطة PCR ملاحظة: تصف هذه الخطوات إنشاء مفاتيح تثبيت إصبع القدم LacZ عن طريق PCR ملحق التداخل. هنا ، يتم استخدام oligo DNA كأساس أمامي ويتم استخدام فاصل T7 كأساس عكسي. نستخدم بلازميد pCOLADuet-LacZ كقالب لجين lacZ (addgene: 75006). يمكن استخدام أي قوالب DNA أخرى تحتوي على التسلسل المقابل كقوالب ، بشرط أن يتم تضمين فاصل T7 في البناء النهائي. بمجرد استلام أوليجوس الحمض النووي الاصطناعي من المزود التجاري ، قم بإعداد محاليل الحمض النووي الاصطناعي والتمهيدي للتضخيم العكسي بتركيز 10 ميكرومتر في الماء الخالي من النيوكلياز. تجميع التفاعلات في أنابيب PCR على الجليد وفقا للجدول 2.ملاحظة: يمكن تغيير حجم وحدات تخزين تفاعل البوليميراز المتسلسل حسب الحاجة. استخدم الحد الأدنى من الكمية (0.1-1 نانوغرام) من قالب الحمض النووي pCOLADuet-LacZ لتجنب الحاجة إلى خطوة إضافية لإزالة البلازميد أو إشارة LacZ الخلفية. للحصول على كميات أعلى من قالب الحمض النووي ، اتبع تفاعل البوليميراز المتسلسل مع هضم إنزيم تقييد DpnI لإزالة قالب البلازميد المتبقي. ضع التفاعلات في جهاز تدوير حراري ، باتباع ظروف الدورة المدرجة في الجدول 3. تحليل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام الأغاروز (الشكل 2 ؛ انظر البروتوكول التكميلي و30). قم بتنقية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعة تنقية PCR القائمة على عمود الدوران وقم بإخراج الحمض النووي في 15-30 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تحديد كمية الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي. مكون حجم تركيز 5X Q5 رد فعل العازلة 10 ميكرولتر 1x 10 مللي متر dNTPs 1 ميكرولتر 200 ميكرومتر 10 مللي متر التمهيدي الأمامي (التبديل الاصطناعي DNA FW) 2.5 ميكرولتر 0.5 ميكرومتر 10 مللي متر التمهيدي العكسي (T7 المنهي RV) 2.5 ميكرولتر 0.5 ميكرومتر قالب الحمض النووي (pCOLADuet-LacZ) متغير <1 نانوغرام Q5 بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة 0.5 ميكرولتر 0.02 وحدة / ميكرولتر مياه خالية من النيوكلياز إلى 50 ميكرولتر – الجدول 2: مكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل المستخدمة لبناء مفاتيح تثبيت القدم. درج درجة الحرارة الوقت تمسخ أولي 98 درجة مئوية 30 ثانية 35 دورة تمسخ 98 درجة مئوية 10 ثانية الصلب 60 درجة مئوية 20 ثانية امتداد 72 درجة مئوية 1.45 دقيقة التمديد النهائي 72 درجة مئوية 5 دقائق مسك 4 درجة مئوية – الجدول 3: ظروف ركوب الدراجات المستخدمة أثناء بناء مفاتيح تثبيت القدم بواسطة PCR. 4. إعداد هدف الحمض النووي الريبي الاصطناعي (الزناد) باستخدام برنامج تصميم البيولوجيا الجزيئية ، قم بتعديل قوالب الحمض النووي الريبي للمشغل الاصطناعي (المحددة في الخطوة 1.1) لتشمل تسلسل مروج T7 المنبع ، مما يضمن بقاء القالب الكامل قصيرا (<200 نقطة أساس). صمم مواد أولية للأمام وللخلف لتضخيم التمهيدي لتسلسل الزناد (لتسلسل oligo ، يرجى الاطلاع على البروتوكول التكميلي). رتب التسلسلات على صورة أوليغو الحمض النووي. بمجرد استلامها ، أعد تكوين الحمض النووي المحفز الاصطناعي وبادئات التضخيم إلى 10 ميكرومتر في الماء الخالي من النيوكلياز. قم بتجميع PCRs المقابلة في أنابيب رقيقة الجدار على الجليد وفقا للجدول 2 واستخدم 0.5 ميكرولتر من الحمض النووي المحفز ultramer (التركيز النهائي 0.1 ميكرومتر) كقالب DNA. ضع التفاعلات في دورة حرارية واستخدم ظروف ركوب الدراجات المدرجة في الجدول 3. استخدم وقت تمديد 15 ثانية. تقييم جودة وتنقية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح في الخطوة 3.3 والبروتوكول التكميلي.ملاحظة: لتسريع العملية ، يمكن أيضا استخدام منتجات PCR للمشغل المنقى بالعمود مباشرة لفحص مفتاح تثبيت القدم الأولي. 5. النسخ في المختبر لتسلسلات الزناد المحددة قم بتجميع مكونات التفاعل على الجليد وفقا للجدول 4. احتضان تفاعلات النسخالمختبري (IVT) عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات ، تليها معالجة DNase I لإزالة قالب الحمض النووي. بالنسبة لخطوة DNase I ، أضف 70 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، و 10 ميكرولتر من 10x DNase I Buffer ، و 2 ميكرولتر من DNase I (خال من RNase) ، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. إذا لم تنتقل إلى الخطوة 5.4 على الفور ، فقم بإلغاء تنشيط DNase I بإضافة 50 mM EDTA وتعطيل الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. خطوة اختيارية: قم بإجراء تحليل كهربائي جل بولي أكريلاميد (على سبيل المثال ، اليوريا PAGE) على منتجات IVT لتقييم جودة الحمض النووي الريبي كما هو موضح في البروتوكول التكميلي. قم بتنقية منتجات IVT الزناد باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي القائمة على العمود وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، ثم حدد تركيز الحمض النووي الريبي ونقاوته باستخدام القياس الطيفي. انظر البروتوكول التكميلي للحصول على تعليمات حول كيفية تحديد المولارية ورقم النسخة / ميكرولتر من الحمض النووي الريبي. مكون حجم تركيز 10X رد فعل العازلة 1.5 ميكرولتر 0.75 مرة 25 مللي متر مزيج NTP 6 ميكرولتر 7.5 مللي متر قالب الزناد الحمض النووي X ميكرولتر 1 ميكروغرام T7 RNA بوليميراز ميكس 1.5 ميكرولتر – مياه خالية من النيوكلياز X ميكرولتر إلى 20 ميكرولتر الجدول 4: النسخ في المختبر (IVT) لتسلسلات الزناد المختارة. 6. الفحص الأولي للمفاتيح ملاحظة: يصف هذا القسم الخطوات المقترنة بإعداد تفاعلات مفتاح تثبيت إصبع القدم الورقي الخالي من الخلايا، وكيفية فحص مفاتيح تثبيت أصابع القدم عالية الأداء. يجب إعداد ورق الترشيح المحظور BSA المستخدم في الخطوة 6.10 مسبقا كما هو موضح في البروتوكول التكميلي. تحضير محلول مخزون CPRG عن طريق إذابة 25 ملغ من المسحوق في 1 مل من الماء الخالي من النيوكلياز. احتفظ بالمحلول على الثلج في جميع الأوقات وخزنه في درجة حرارة -20 درجة مئوية للاستخدام طويل الأمد. حدد عدد التفاعلات المراد إعدادها. لكل مفتاح تثبيت تم تقييمه ، قم بتضمين عنصر تحكم بدون قالب (لا يوجد مفتاح ولا يوجد RNA مستهدف – يعرف باسم التحكم الخالي من الخلايا وحده) لحساب أي إشارة خلفية قد تنشأ من المزيج الرئيسي. قم بتضمين عنصر تحكم بالتبديل فقط لتقييم تسرب مفتاح الخلفية أو معدل إيقاف التشغيل في حالة عدم وجود الحمض النووي الريبي المستهدف. قم بتجميع مزيج رئيسي للتفاعل الخالي من الخلايا من المحلول A والمحلول B ومثبط RNase و CPRG على الجليد وفقا للبروتوكول القياسي المدرج في الجدول 5.ملاحظة: الخطوات الموضحة هنا هي لمزيج رئيسي سيكون كافيا لمجموعة ثلاثية من تفاعلات 1.8 ميكرولتر مع حجم مضاف بنسبة 10٪ لحساب خطأ الامتصاص. يجب ضبط حجم المزيج الرئيسي حسب الحاجة اعتمادا على عدد مفاتيح تثبيت أصابع القدم التي تم فحصها. لكل تفاعل ثلاثي خال من الخلايا ، قم بتوزيع المزيج الرئيسي في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مع الحفاظ على جميع الأنابيب على الجليد. بالنسبة للأنبوب الذي يتم وضعه جانبا كعنصر تحكم خال من الخلايا بمفرده ، أضف الماء الخالي من النيوكلياز إلى الحجم النهائي البالغ 5.84 ميكرولتر ، واخلطه عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة. بالنسبة لبقية الأنابيب ، أضف الحمض النووي لمفتاح تثبيت إصبع القدم المنقى PCR إلى تركيز نهائي يبلغ 33 نانومتر. بالنسبة للأنابيب الموضوعة جانبا كأدوات تحكم بالتبديل وحده ، أضف الماء الخالي من النيوكلياز إلى الحجم النهائي البالغ 5.84 ميكرولتر. بالنسبة للأنابيب الموضوعة جانبا لاختبار مفتاح تثبيت القدم ومجموعة الحمض النووي الريبي المستهدف ، أضف الحمض النووي الريبي المستهدف المنسوخ في المختبر إلى تركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر. بعد ذلك ، أضف الماء الخالي من النيوكلياز إلى الحجم النهائي 5.84 ميكرولتر. امزج جميع التفاعلات جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة. أضف 30 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز إلى الآبار المحيطة بآبار التفاعل على صفيحة سوداء ذات قاع شفاف 384 بئرا. هذا يقلل من التبخر على مدار التجربة ويحسن التكاثر.ملاحظة: في حالة استخدام جهاز قارئ الألواح المحمول ، ضع رقائق PCR فوق اللوحة ، واستخدم سكينا دقيقا لقطع الآبار المخصصة لتفاعلك ، وكذلك كل من آبار الزاوية الأربعة. تمنع رقائق PCR التعرض المفرط لكاميرا قارئ الألواح المحمولة من الآبار الفارغة. باستخدام لكمة وملاقط خزعة 2 مم ، قم بقطع أقراص ورق الترشيح المحظورة ب BSA ووضعها في آبار التفاعل إما عن طريق إخراج المثقاب أو باستخدام الملقط (انظر البروتوكول التكميلي لإعداد ورق الترشيح المحظور ب BSA). قم بتوزيع ثلاثة أضعاف أحجام 1.8 ميكرولتر من كل أنبوب تفاعل على أقراص ورق الترشيح في لوحة 384 بئرا ، مع الاحتفاظ بجميع العينات ، وكذلك لوحة 384 بئر ، على الجليد في جميع الأوقات.ملاحظة: في حالة استخدام جهاز قارئ الألواح المحمول ، أضف 1.8 ميكرولتر من CPRG (0.6 مجم / مل) إلى كل زاوية من الزوايا الأربع للوحة التي تحتوي على 384 بئرا. يوفر اللون الأصفر من CPRG التعرف على الأنماط لقارئ اللوحة المحمول لمحاذاة قالب اللوحة الرقمية متعددة الآبار في تحليل الصور. قم بتغطية آبار اللوحة بفيلم PCR لمنع التبخر. ضع اللوحة في قارئ الأطباق ، اقرأ OD570 عند 37 درجة مئوية كل دقيقة لمدة 130 دقيقة. مكون حجم التركيز النهائي لكل تفاعل الحل أ 2.38 ميكرولتر 40% الحل ب 1.78 ميكرولتر 30% مثبطات إنزيم RNase 0.03 ميكرولتر 0.5٪ فولت / فولت CPRG (25 مجم / مل) 0.14 ميكرولتر 0.6 مجم / مل مفتاح إصبع القدم X ميكرولتر 33 نانومتر الحمض النووي الريبي المستهدف X ميكرولتر 1 ميكرومتر مياه خالية من النيوكلياز إلى 5.94 ميكرولتر – الحجم الإجمالي: 5.94 ميكرولتر الجدول 5: مكونات تفاعل النسخ والترجمة الخالية من الخلايا PURExpress. 7. تحديد مفاتيح تثبيت أصابع القدم عالية الأداء ملاحظة: يصف هذا القسم كيفية تحليل البيانات من الخطوة 6 من أجل تحديد مفاتيح تثبيت أصابع القدم الأفضل أداء للمضي قدما. ابدأ تحليل البيانات عن طريق التطبيع أولا إلى امتصاص OD570 في الخلفية. للقيام بذلك ، اطرح قياسات OD 570 للتفاعلات التي لا تحتوي على أي مفتاح أو RNA مستهدف (أي آبار خالية من الخلايا وحدها) من قياسات OD570 الأخرى. قم بتنعيم البيانات الطبيعية باستخدام متوسط متحرك من ثلاث نقاط واضبط الحد الأدنى لقيمة كل بئر على الصفر. انظر الشكل 3 للحصول على مثال لبيانات الدورة الزمنية العادية التي تم جمعها لمفاتيح تثبيت القدم 27B و 33B و 47B. باستخدام هذه البيانات المعالجة ، احسب تغيير الطي (أو نسبة التشغيل / الإيقاف) عن طريق تحديد الفرق في معدل تغير اللون (أي التغيير في OD570 بمرور الوقت) بين مفتاح تثبيت القدم والآبار المستهدفة والتبديل وحده (انظر البروتوكول التكميلي لحساب النسبة ؛ الشكل 4). حدد المفاتيح ذات أعلى تغيير في طي التشغيل / الإيقاف لمزيد من التوصيف. احذف مفاتيح تثبيت القدم ضعيفة الأداء التي تعرض أقل تغيير في الطي. 8. فحص التمهيدي للتضخيم القائم على تسلسل الحمض النووي والحساسية ملاحظة: في الخطوات التالية ، يتم أولا إجراء فحص لبادئات التضخيم الوظيفي متساوي الحرارة ، ثم يتم تقييم حساسيتها من خلال تحديد عدد نسخ الحمض النووي الريبي المستهدفة لكل ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الاصطناعي الذي يمكن لمفتاح تثبيت إصبع القدم اكتشافه بشكل موثوق عندما يقترن بالتضخيم متساوي الحرارة. بعد التضخيم متساوي الحرارة ، قم بإجراء تفاعلات خالية من الخلايا لتحديد مجموعات التمهيدي الناجحة القائمة على تسلسل الحمض النووي. ومع ذلك ، قد يكون من الأكثر فعالية من حيث التكلفة تشغيل المواد الهلامية بولي أكريلاميد أو الأغاروز على تفاعلات التضخيم القائمة على تسلسل الحمض النووي لتضييق مجموعة مجموعات التمهيدي المرشحة أولا. في هذه الحالة ، يمكن إدراج مجموعات التمهيدي للتضخيم القائم على تسلسل الحمض النووي والتي تولد شريطا على الجل بحجم amplicon المناسب في القائمة المختصرة للفحص اللاحق الخالي من الخلايا. اصنع محلول مخزون 25 ميكرومتر من جميع مجموعات التمهيدي الأمامية والخلفية في ماء خال من النيوكلياز (انظر البروتوكول التكميلي). أوجد عدد تفاعلات التضخيم القائمة على تسلسل الحمض النووي والتفاعلات اللاحقة الخالية من الخلايا التي يلزم إعدادها. سيعتمد هذا على عدد مفاتيح تثبيت أصابع القدم ومجموعات التمهيدي المعنية.ملاحظة: عند فحص البادئات ، من المهم دائما تضمين عنصر تحكم بدون قالب لكل مجموعة أولية لحساب أي عناصر أساسية قد تنشأ بسبب التضخيم غير المحدد المرتبط بالتمهيدي. قم بإعداد تفاعل واحد 5 ميكرولتر على النحو التالي (قم بقياس هذا حسب الحاجة). ذوبان جميع الكواشف على الجليد. قم بتجميع مزيج رئيسي للتفاعل من مخزن التفاعل المؤقت ومزيج النيوكليوتيدات ومثبط RNase وفقا للجدول 6. تخلط جيدا عن طريق سحب لأعلى ولأسفل حتى يذوب الراسب الأبيض ، ثم قم بتوزيع القسمة في أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل.إذا كان المزيج الرئيسي مخصصا لفحص بادئات التضخيم القائمة على تسلسل الحمض النووي ، فقم باستبعاد البادئات من المزيج الرئيسي في البداية (استغني عن 2.55 ميكرولتر من المزيج الرئيسي). خلاف ذلك ، في حالة إجراء تحليل حساسية التمهيدي ، يمكن تضمين البادئات في المزيج الرئيسي (في هذه الحالة الاستغناء عن 2.75 ميكرولتر من القسمة الأولية). أضف مزيج الإنزيم بعد مرحلتي التمسخ والتوازن. في حالة فحص بادئات التضخيم القائمة على تسلسل الحمض النووي ، أضف البادئات الأمامية والخلفية إلى الأنابيب المناسبة. على جهاز التدوير الحراري ، قم بإعداد بروتوكول الحضانة كما هو موضح في الجدول 7. أضف 1 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز أو 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المستهدف عند 2 جزء في المتر أو حوالي 106 نسخ / ميكرولتر ، مع التأكد من تسمية الأنابيب وفقا لذلك. تخلط عن طريق ماصة لطيفة وتدور لفترة وجيزة أسفل الأنابيب.ملاحظة: لفحص مجموعة التمهيدي ، استخدم تركيزا من الحمض النووي الريبي المحفز المستهدف مرتفعا بما يكفي لعدم التأثير على الحد الأدنى للكشف عن طريقة التضخيم متساوي الحرارة ، ولكنه ليس مرتفعا بما يكفي لتوفير تنشيط مفتاح تثبيت القدم في حالة عدم حدوث تضخيم. انقل الأنابيب إلى العجلة الحرارية وابدأ الحضانة. بعد 12 دقيقة ، قم بإزالة الأنابيب وإضافة 1.25 ميكرولتر من مزيج الإنزيم إلى كل أنبوب. تخلط عن طريق ماصة لأعلى ولأسفل وطرد مركزي لفترة وجيزة الأنابيب.ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن الاحتفاظ بالأنابيب في درجة حرارة الغرفة ؛ ومع ذلك ، يجب أن يبقى مزيج الإنزيم على الجليد حتى يضاف إلى الأنابيب. أعد الأنابيب إلى المدورة الحرارية ، متخطيا خطوة الانتظار 41 درجة مئوية لبدء حضانة التفاعل لمدة 1 ساعة.ملاحظة: بعد الحضانة ، يمكن وضع التفاعلات على الثلج للمعالجة في نفس اليوم أو تجميدها عند -20 درجة مئوية للمعالجة اللاحقة. اتبع الخطوات 6.2-6.7 والجدول 8 لتجميع تفاعلات مفتاح تثبيت القدم الورقية الخالية من الخلايا لتقييم أداء التمهيدي. تحليل البيانات كما هو موضح في الخطوات 7.1-7.2 والشكل 3.ملاحظة: بالإضافة إلى عناصر التحكم المذكورة سابقا ، من المهم أيضا تضمين عنصر التحكم السلبي لحساب أي إشارة خلفية قد تنشأ عن التفاعل. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم أيضا تضمين عنصر تحكم مع المفتاح و 2 pM (التركيز النهائي) للحمض النووي الريبي المستهدف ، كعنصر تحكم في التضخيم بدون NASBA. تحديد أزواج التمهيدي المرشحة للمضي قدما في تحليل الحساسية. يتم اختيار أزواج التمهيدي بناء على ما إذا كان تنشيط مفتاح تثبيت القدم يحدث بعد إضافة التفاعل المحتضن. إذا لزم الأمر ، كرر شاشة التمهيدي مع المزيد من مجموعات التمهيدي. حفظ عينات الحمض النووي الريبي على الجليد في جميع الأوقات ، قم بعمل مجموعة التخفيف التسلسلي التالية من الحمض النووي الريبي المستهدف في الماء الخالي من النيوكلياز: 104 ، 103 ، 10 2 ، 101 ، و 100 نسخ RNA / ميكرولتر. كرر التضخيم القائم على تسلسل الحمض النووي والتفاعلات الخالية من الخلايا مع مجموعات التمهيدي المحددة (الخطوات 8.2-8.7) ، واختبار سلسلة التخفيف التسلسلي من أجل تحديد مجموعات التمهيدي التي توفر أفضل حساسية. انظر الشكل 5 للحصول على مثال لنتائج تحديد حساسية مجموعة التمهيدي.ملاحظة: من الناحية المثالية ، يجب أن يكتشف مفتاح تثبيت القدم المحدد وزوج التمهيدي ما لا يقل عن 1-100 نسخة من الحمض النووي الريبي المستهدف لكل ميكرولتر من الحمض النووي الريبي (تركيز محلول المخزون). كرر تجربة حساسية التضخيم القائمة على تسلسل الحمض النووي في ثلاثية بيولوجية. تعمل هذه الخطوة على تأكيد استنساخ النتائج قبل الانتقال إلى التجارب مع عينات المرضى. اختياري: للحصول على مصدر موثوق للحمض النووي للتبديل للاستخدام طويل الأمد وللنقل ، قم باستنساخ تسلسل (تسلسلات) التبديل المحدد في بلازميد باستخدام أي طريقة استنساخ تقليدية. وبالمثل ، يمكن أيضا استنساخ تسلسل الحمض النووي الريبي المستهدف في بلازميد مفضل للتخزين. مكون حجم لكل رد فعل التركيز النهائي NASBA رد فعل العازلة 1.67 ميكرولتر 1x ناسبا النوكليوتيدات مزيج 0.833 ميكرولتر 1x 25 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام 0.1 ميكرولتر 0.5 ميكرومتر 25 ميكرومتر التمهيدي العكسي 0.1 ميكرولتر 0.5 ميكرومتر مثبطات إنزيم RNase (40 وحدة / ميكرولتر) 0.05 ميكرولتر 0.4 وحدة / ميكرولتر الحمض النووي الريبي المستهدف 1 ميكرولتر ناسبا انزيم ميكس 1.25 ميكرولتر 1x الحجم الإجمالي 5 ميكرولتر الجدول 6: مكونات تفاعل NASBA. درج درجة الحرارة الوقت تمسخ 65 درجة مئوية 2 دقيقة الموازنة 41 درجة مئوية 10 دقائق مسك 41 درجة مئوية ∞ حضانة المرض 41 درجة مئوية 1 ساعة مسك 4 درجة مئوية – الجدول 7: ظروف رد الفعل ل NASBA. مكون حجم التركيز النهائي لكل تفاعل الحل أ 2.38 ميكرولتر 40% الحل ب 1.78 ميكرولتر 30% مثبطات إنزيم RNase 0.03 ميكرولتر 0.5٪ فولت / فولت CPRG (25 مجم / مل) 0.14 ميكرولتر 0.6 مجم / مل مفتاح إصبع القدم X ميكرولتر 33 نانومتر الحمض النووي الريبي المستهدف (إن وجد) X ميكرولتر 1 ميكرومتر NASBA (إن وجد) 0.85 ميكرولتر 1:7 مياه خالية من النيوكلياز إلى 5.94 ميكرولتر – الحجم الإجمالي: 5.94 ميكرولتر الجدول 8: مكونات التفاعل الخالية من الخلايا الورقية. 9. جمع عينات المرضى واستخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي ملاحظة: يصف هذا القسم بروتوكول جمع عينات المرضى واستخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي. يستخدم البروتوكول أدناه للحصول على مصل من الدم المحيطي. تم جمع العينات المستخدمة في هذه الدراسة من المرضى الذين يعانون من الحمى أو الطفح الجلدي أو ألم مفصلي أو غيرها من الأعراض ذات الصلة لعدوى الفيروس المفصلي في ولاية بيرنامبوكو بالبرازيل. جمع عينات الدم المحيطية من المرضى المشتبه في إصابتهم بفيروس arbovirus. إجراء بزل الوريد (أنبوب الدم الكامل) باستخدام تقنية معقمة قياسية. قم بتسمية أنابيب العينة برمز مجهول وتاريخ جمع العينة. دم الطرد المركزي لفصل المصل عند 2300 × جم لمدة 10 دقائق. باستخدام ماصة ، قم بإعداد حصص المصل (200 ميكرولتر) التي سيتم استخدامها لاستخراج الحمض النووي الريبي في أنابيب سعة 1.5 مل.ملاحظة: إذا لم يكن من الممكن إجراء استخراج الحمض النووي الريبي بعد وقت قصير من جمع العينات ، فيجب تخزين عينات المصل عند -80 درجة مئوية قبل التطبيقات النهائية. ماصة 560 ميكرولتر من المخزن المؤقت AVL (المخزن المؤقت للتحلل الفيروسي) الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي الناقل في أنبوب سعة 1.5 مل. أضف 140 ميكرولتر من المصل إلى خليط Buffer AVL / DNA الناقل في الأنبوب. تخلط عن طريق دوامة النبض لمدة 15 ثانية. احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع المحتويات في الجزء السفلي من الأنبوب. أضف 560 ميكرولتر من الإيثانول (96٪ -100٪) إلى العينة واخلطها عن طريق دوامة النبض لمدة 15 ثانية. بعد الخلط ، قم بالطرد المركزي للعينة لجمع المحتويات في قاع الأنبوب. أضف بعناية 630 ميكرولتر من المحلول من الخطوة 9.4 إلى عمود الدوران دون ترطيب الحافة. بعد هذه الخطوة ، أغلق الغطاء ، وأجهزة الطرد المركزي عند 6000 × جم لمدة 1 دقيقة. ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع نظيف سعة 2 مل وتخلص من أنبوب التجميع المستخدم الذي يحتوي على الراشح. افتح عمود الدوران بعناية وكرر الخطوة 9.5. افتح عمود الدوران بعناية وأضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت AW1 (المخزن المؤقت للغسيل 1). أغلق الغطاء ، وأجهزة الطرد المركزي عند 6000 × جم لمدة 1 دقيقة. ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع نظيف سعة 2 مل وتخلص من أنبوب التجميع المستخدم الذي يحتوي على الراشح. افتح عمود الدوران بعناية وأضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت AW2 (المخزن المؤقت للغسيل 2). أغلق الغطاء وأجهزة الطرد المركزي عند 20000 × جم لمدة 3 دقائق. ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع نظيف سعة 2 مل ، وتخلص من أنبوب التجميع المستخدم الذي يحتوي على الراشح. لتجنب التلوث بالمخزن المؤقت المتبقي AW2 ، والذي قد يسبب مشاكل في التفاعلات الأنزيمية النهائية ، ضع العمود المغزلي في أنبوب تجميع نظيف سعة 2 مل وتخلص من أنبوب التجميع المستخدم مع الراشح. جهاز طرد مركزي في 20000 × ز لمدة 1 دقيقة. ضع عمود الدوران في أنبوب نظيف سعة 1.5 مل وتخلص من أنبوب التجميع المستخدم مع الراشح. افتح عمود الدوران بعناية وأضف 60 ميكرولتر من Buffer AVE (المخزن المؤقت للشطف) المتوازن مع درجة حرارة الغرفة. بعد هذه الخطوة ، أغلق الغطاء ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة. جهاز طرد مركزي في 6000 × ز لمدة 1 دقيقة. يمكن بعد ذلك استخدام الحمض النووي الريبي المستخلص كمدخل ل NASBA و RT-qPCRs بالتوازي. اتبع الخطوات من 8.3 إلى 8.11 لإجراء التضخيم القائم على تسلسل الحمض النووي والتفاعلات الخالية من الخلايا الورقية باستخدام 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المستخرج للمريض ، مما يضمن تضمين تفاعلات التحكم السلبية والإيجابية. بعد التفاعلات ، قم بإعداد لوحة تفاعل 384 بئر وقم بتشغيل الفحص في جهاز قارئ اللوحة المحمول عند 37 درجة مئوية (انظر التفاصيل في البروتوكول التكميلي).ملاحظة: يستخدم تركيزان من الحمض النووي الريبي مقدارهما 104 و102 PFU/mL، المستخرجان من فيروس زيكا المستزرع كضوابط إيجابية لجميع التجارب أثناء التحقق السريري. بالإضافة إلى عناصر التحكم المذكورة سابقا ، من المهم أيضا تضمين الزناد (10 نانوغرام / ميكرولتر) كعنصر تحكم إيجابي. في نهاية كل تجربة ، يمكن تحميل البيانات الأولية (.csv الملف) من قارئ لوحة prtable إلى قاعدة بيانات آمنة عبر الإنترنت. وبالإضافة إلى ذلك، يولد قارئ اللوحات المحمولة تقريرا يبين ما إذا كانت العينات إيجابية أو سلبية لفيروس زيكا (الشكل 6)؛ انظر قسم النتائج التمثيلية للحصول على أمثلة لجميع الرسوم البيانية التي تم الحصول عليها أثناء الحضانة (الشكل 7).ملاحظة: يمكن للمستخدمين أيضا نقل الملفات من قارئ اللوحات المحمولة إلى أجهزة الكمبيوتر الخاصة بهم عبر USB. 10. جهاز قارئ لوحة المحمولة يمكن استخدام جهاز قارئ الألواح المحمول (الشكل 8) كبديل لقارئ اللوحة التقليدي24. للاطلاع على البروتوكول والنتائج التمثيلية، انظر البروتوكول التكميلي. 11. RT-qPCR للكشف عن فيروس زيكا ملاحظة: يوضح هذا القسم خطوات إجراء RT-qPCR للكشف عن فيروس زيكا من عينات المرضى (انظر البروتوكول التكميلي). لتجنب التلوث ، قم بتجميع مكونات RT-qPCR في منطقة معزولة عن عملية التضخيم (على سبيل المثال ، غطاء نظيف). ضع المخزن المؤقت RT-qPCR والإنزيمات والتمهيدي / المجسات على الثلج أو كتلة باردة. بعد ذلك ، أضف التفاعلات إلى لوحة 384 بئر على الجليد وفقا للجدول 9.ملاحظة: يوصى باستخدام التحكم السلبي (التحكم في الاستخراج والتحكم غير القالب [NTC]) والتحكم الإيجابي (104 PFU / mL) لجميع التجارب. بعد إضافة الكواشف إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، امزج التفاعل عن طريق السحب لأعلى ولأسفل (لا دوامة) ، وقم بتوزيع 6.5 ميكرولتر في كل بئر. أضف 3.5 ميكرولتر من كل قالب RNA في ثلاث نسخ. ضع فيلم PCR فوق الجزء العلوي من اللوحة. جهاز طرد مركزي للوحة 384 بئر عند 600 × جم لمدة 2 دقيقة. ضع اللوحة في جهاز RT-qPCR باستخدام ظروف ركوب الدراجات التالية الموضحة في الجدول 10. لتحليل النتائج، استخدم برنامج تصميم وتحليل آلة RT-qPCR والنظر في العتبة التلقائية وخط الأساس (انظر التفاصيل في البروتوكول التكميلي). مكون حجم تركيز 2X كوانتينوفا بروب RT-PCR ماستر ميكس 5 ميكرولتر 1 × 100 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام 0.08 ميكرولتر 0.8 ميكرومتر 100 ميكرومتر التمهيدي العكسي 0.08 ميكرولتر 0.8 ميكرومتر مسبار 25 ميكرومتر 0.04 ميكرولتر 0.1 ميكرومتر كوانتينوفا ROX صبغة مرجعية 0.05 ميكرولتر 1 × كوانتينوفا بروب آر تي ميكس 0.1 ميكرولتر 1 × قالب الحمض النووي الريبي 3.5 ميكرولتر – مياه خالية من النيوكلياز إلى 10 ميكرولتر – الجدول 9: مكونات RT-qPCR لتضخيم الحمض النووي الريبي لفيروس زيكا استنادا إلى بروتوكول مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها – CDC USA للكشف عن فيروس زيكا من عينات المرضى31. درج درجة الحرارة الوقت النسخ العكسي 45 درجة مئوية 15 دقيقة خطوة التنشيط الأولية ل PCR 95 درجة مئوية 5 دقائق 45 دورة تمسخ 95 درجة مئوية 5 ثانية الجمع بين التلدين / التمديد 60 درجة مئوية 45 ثانية الجدول 10: ظروف ركوب الدراجات ل RT-qPCR.

Representative Results

بعد خط أنابيب التصميم الحسابي ، تم تنفيذ بناء ثلاثة مفاتيح تثبيت بواسطة PCR. تم تحليل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز (الشكل 2). يشير وجود شريط واضح يبلغ حوالي 3000 نقطة أساس ، وهو ما يقرب من حجم جين lacZ المقترن بمفتاح تثبيت القدم ، عادة إلى رد فعل ناجح. بدلا من ذلك ، يشير الممر بدون نطاق أو نطاقات متعددة أو نطاق بحجم غير صحيح إلى فشل PCR. في حالة فشل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يجب تحسين ظروف التفاعل و / أو تسلسل التمهيدي. تم فحص مفاتيح تثبيت القدم المجمعة لتقييم كل مستشعر مقابل الحمض النووي الريبي المشغل المنسوخ في المختبر (الشكل 3). بينما أظهرت جميع المستشعرات الثلاثة امتصاصا متزايدا ل OD570 ، كان للمفتاح 27B (الشكل 3A) أسرع معدل في المعدل. أظهرت المفاتيح 33B ، وبدرجة أقل ، 47B زيادة في امتصاص OD570 في غياب الحمض النووي الريبي المستهدف ، مما يشير إلى أن هذه المفاتيح تمتلك بعض النشاط أو التسرب في الخلفية (الشكل 3B ، C) – وهي سمة غير مرغوب فيها في مستشعر مرشح لأنها يمكن أن تقلل من النوعية. لتحديد المستشعر الذي يحتوي على أعلى نسبة إشارة تشغيل / إيقاف بشكل أكثر وضوحا ، تم حساب تغيير الطي لامتصاص OD570 (انظر قسم المعلومات التكميلية 5) ورسمه (الشكل 4). من هذا التحليل ، من الواضح أن المفتاح 27B هو المستشعر الذي يتمتع بأفضل أداء مع نسبة تشغيل / إيقاف تبلغ حوالي 60. ثم تم تقييم حساسية مفتاح تثبيت إصبع القدم الأعلى أداء (27B) من خلال تحديد أقل تركيز للحمض النووي الريبي المطلوب لتنشيط مفتاح تثبيت إصبع القدم عندما يقترن بتفاعل NASBA. يوضح الرسم البياني أن مستشعرات زيكا الأفضل أداء يمكنها اكتشاف الحمض النووي الريبي بتركيزات منخفضة تصل إلى 1.24 جزيء لكل ميكرولتر (أي ما يعادل ~ 2 aM; الشكل 5). بعد تحديد المفتاح 27B والتحقق من صحته ، تم توزيع مواد المستشعر على أعضاء الفريق في ريسيفي في ولاية بيرنامبوكو في البرازيل. وفي البرازيل، تم تقييم دقة التشخيص السريري لمنصة تشخيص فيروس زيكا باستخدام عينات من مرضى فيروس زيكا، بالتوازي مع RT-qPCR للمقارنة. للتحقق من صحة منصة تشخيص Zika الورقية ، تم استخدام قارئ الألواح المحمول ، وهو قادر على احتضان وقراءة الإخراج اللوني لأجهزة الاستشعار الورقية. يستخدم تغير اللون من الأصفر إلى الأرجواني لتحديد عينة إيجابية ، بينما تظل العينة السالبة صفراء (الشكل 6). هناك خيار إضافي لتصور النتائج الناتجة عن قارئ اللوحة المحمول (الشكل 8) وهو رسم الاستجابة اللونية لكل تفاعل ورقي بمرور الوقت. تم اختبار العينات في ثلاث نسخ واعتبرت العينات التي تجاوزت العتبة (الخط الأحمر المحدد على 1) إيجابية ، بينما اعتبرت العينات التي تقل عن العتبة سلبية (الشكل 6 والشكل 7). وأخيرا، لتقييم ومقارنة الأداء السريري لمستشعر مفتاح تثبيت إصبع القدم Zika مع الطريقة القياسية الذهبية الحالية لتشخيص عدوى فيروس زيكا، تم اختبار جميع عينات المرضى بالتوازي مع RT-qPCR. واختبر مخطط التضخيم لعينتين تمثيليتين من المرضى في ثلاث نسخ للكشف عن فيروس زيكا بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل بالنسخ العكسي (الشكل 9). تعتبر العينات إيجابية عندما تكون قيمة عتبة الدورة (Ct) ≤38 ؛ يشير الخط الأحمر إلى عينة إيجابية ويشير الخط الأزرق إلى عينة سلبية لفيروس زيكا. الشكل 2: رحلان كهربائي جل Agarose لتقييم جودة منتجات PCR. يتم تحليل منتجات PCR على هلام أغاروز 1٪ في 1X TAE ، يعمل عند 80 فولت لمدة 90 دقيقة. يشير النطاق الواضح الواحد عادة إلى رد فعل ناجح. حارة 1: 1 كيلو بايت سلم الحمض النووي ؛ الممرات 2-4: 27B تبديل الحمض النووي ، 33B الزناد الحمض النووي ، و 47B الزناد الحمض النووي ، على التوالي. تمثل الأرقام الموجودة على الجانب الأيسر حجم النطاق بالبت bp. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 3: النماذج الأولية لثلاثة مفاتيح تثبيت لمستشعرات زيكا الورقية. تم قياس أداء ثلاثة مستشعرات لمفتاح تثبيت إصبع القدم RNA الورقي عند 37 درجة مئوية لأكثر من 130 دقيقة. يحتوي كل رسم بياني على مسارين ، أحدهما يمثل التحكم في التبديل فقط ، بينما يمثل الآخر المفتاح والمشغل. تمثل الرسوم البيانية الثلاثة البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام مستشعرات مفتاح تثبيت القدم 27B (A) و 33B (B) و 47B (C). تمثل أشرطة الخطأ الخطأ القياسي للمتوسط (SEM) من ثلاث نسخ متماثلة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 4: يتم تحديد المستشعرات عالية الأداء عن طريق حساب تغير الطي في الامتصاص عند 570 نانومتر. يتم حساب تغيير الطي (أو الحد الأقصى لنسبة التشغيل / الإيقاف) عن طريق قياس نسبة الامتصاص (OD570) عند 130 دقيقة بين التحكم في المفتاح فقط ، والمفتاح بالإضافة إلى فحص CFPS للتشغيل. تمثل أشرطة الخطأ SEM من ثلاث نسخ متماثلة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 5: تقييم حساسية المفتاح الأفضل أداء. في المختبر يتم معايرة الحمض النووي الريبي Zika المنسوخ في تفاعلات NASBA. بعد حضانة 1 ساعة ، تمت إضافة التفاعلات إلى تفاعلات PURExpress الخالية من الخلايا على الأقراص الورقية بنسبة 1: 7. يتم رسم تغيير الطي بعد 130 دقيقة عند 37 درجة مئوية. وقد استنسخ هذا الرقم من24. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 6: صفحة التقاط قارئ لوحة محمولة محملة ببيانات الصورة الملتقطة. يوضح هذا الشكل صورة نموذجية للصورة النهائية التي تم التقاطها بواسطة قارئ الألواح المحمول أثناء عملية جمع البيانات. يظهر طابع التاريخ/الوقت الأصلي في أعلى الصورة. يشير اللون الأصفر إلى التحكم أو ردود الفعل السلبية ، ويشير اللون الأرجواني إلى رد فعل إيجابي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 7: وضع تحليل البيانات. على اليسار ، يختار المستخدمون مجموعات البيانات التي يرغبون في رسمها ؛ ثم يتم عرض الرسوم البيانية على اليمين بألوان فريدة لكل عينة أو مجموعة تحكم. يعمل الخط الأحمر المتقطع كعتبة لتحديد العينات الإيجابية والسلبية. تعتبر العينات التي تم اختبارها في ثلاث نسخ والتي تتجاوز العتبة إيجابية ، بينما تعتبر العينات التي تقل عن العتبة سلبية. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري (SD) من ثلاث نسخ متماثلة. يشير Ctrl 1 إلى Ctrl 5 إلى عناصر التحكم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 8. بلوم ، قارئ لوحة محمول. يعمل قارئ الألواح المحمول هذا كمختبر في صندوق ويعمل كقارئ لوحة يتم التحكم في درجة حرارته لاحتضان التفاعلات اللونية ومراقبتها. يمكن أن يوفر هذا الجهاز المحمول قياسات كمية وعالية الإنتاجية لأجهزة استشعار زيكا الورقية في الموقع. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 9: مخطط RT-qPCR لتضخيم عينتين من المرضى تم اختبارهما في ثلاث نسخ للكشف عن فيروس زيكا. تعتبر العينات موجبة عندما تكون قيمة عتبة الدورة (Ct) ≤38. يعمل الخط الأحمر المنقط كعتبة لتحديد العينات الإيجابية والسلبية. يشير التتبع الأحمر إلى عينة موجبة ، ويشير التتبع الأزرق إلى عينة سالبة. تمثل قيمة ΔRn (دلتا Rn) الحجم الطبيعي لإشارة التألق المكتشفة بواسطة أداة RT-qPCR لجميع العينات التي تم اختبارها. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. ملف البروتوكول التكميلي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف. الأرقام التكميلية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذه الأرقام.

Discussion

يمكن للنظام الورقي المدمج الموصوف هنا أن يجلب التشخيص الجزيئي ذي الصلة سريريا ، مع أداء يمكن مقارنته وظيفيا ب RT-qPCR ، إلى نقطة الحاجة⁶. الأهم من ذلك ، بالنسبة للإعدادات عن بعد ، يمكن أن يؤدي توفر التشخيصات في الموقع إلى تقليل الوقت اللازم للنتائج من أيام إلى ساعات. تسليط الضوء على قابلية برمجة هذا النهج ، يمكن استخدام خط الأنابيب الذي تم وصفه للكشف عن أي هدف ممرض تقريبا. لقد قمنا بإقران الأدوات الجزيئية بقارئ لوحات محمول مصمم لهذا الغرض ، وهو مضغوط ومتوافق مع تشغيل البطارية (8-9 ساعات) ويوفر تحليلا للبيانات على متن الطائرة لتمكين التطبيقات الموزعة. في أعمال أخرى ، قمنا بالتحقق من صحة الأجهزة المدمجة ومنصة تشخيص فيروس زيكا مع 268 عينة من المرضى ، بالتوازي مع RT-qPCR ، ووجدنا دقة تشخيصية تبلغ 98.5٪ ²⁴. هدفنا مجتمعة هو تمكين نقل التكنولوجيا لهذه المنصة إلى الباحثين بحيث يمكن إعادة توظيفها وتحسينها من قبل المجتمع لتلبية الاحتياجات التشخيصية غير الملباة.

تم دمج عملية تصميم مفتاح إصبع القدم في السيليكو وأتمتتها في خط أنابيب يمكن تقسيمه إلى ثلاث مراحل. تولد المرحلة الأولى مجموعة من تصميمات مفاتيح تثبيت القدم التي تهجن إلى التسلسل المستهدف بزيادات واحدة في النوكليوتيدات. تفحص المرحلة الثانية الهيكل الثانوي وتوافر مفتاح تثبيت القدم وتزيل المستشعرات ذات كودونات التوقف المبكر داخل الإطار. ثم يتم تنفيذ وظيفة التسجيل التي تأخذ في الاعتبار عوامل متعددة (على سبيل المثال ، مستوى العيب في مفتاح تثبيت إصبع القدم ، وتوافر مفتاح تثبيت القدم ، وإمكانية الوصول إلى الموقع المستهدف) لتحديد تصميمات مفتاح تثبيت إصبع القدم الأعلى بناء على الدرجات الإجمالية. في المرحلة النهائية ، يتم إنشاء قائمة بالتسلسلات لتصميمات مفتاح إصبع القدم العلوي ومشغلات الهدف المقابلة لها. يجب فحص تسلسلات أجهزة الاستشعار العلوية للتأكد من خصوصيتها مقابل النسخ البشري والجينومات الفيروسية ذات الصلة الوثيقة باستخدام NCBI / Primer-BLAST²⁵. ومن أفضل الممارسات أيضا فحص المواقع المستهدفة لأجهزة الاستشعار لحفظ التسلسل في جينوم فيروس زيكا للتأكد من أن أجهزة الاستشعار ستوفر كشفا واسعا وقويا. تم تطوير عدة إصدارات من برنامج تصميم مفتاح تثبيت القدم وتسمح خوارزمية التصميم للمستخدمين بإنشاء نسختين ، إما السلسلة A 6 أو مفاتيح تثبيت إصبع القدم^من السلسلة B⁶. في هذه المقالة ، كان التركيز على تصميم مفتاح إصبع القدم من السلسلة B.

بعد تخليق الحمض النووي التجاري ، يمكن تجميع مفاتيح إصبع القدم بسرعة ، ثم اختبارها عن طريق إجراء فحص أولي مقابل تسلسل الزناد المستهدف الاصطناعي الذي يتوافق مع مناطق قصيرة (200-300 nt) من الجينوم المستهدف. لفحص أداء المستشعرات القائمة على مفتاح تثبيت أصابع القدم ، من المثالي إضافة التسلسل المستهدف في شكل الحمض النووي الريبي. في هذه المقالة ، تم تحديد الخطوات المطلوبة لإضافة الحمض النووي الريبي المشغل المنسوخ في المختبر . ومع ذلك ، إذا كان ذلك متاحا ، يمكن استخدام قوالب الجينوم كاملة الطول مثل مستخلصات الحمض النووي الريبي الفيروسي الكمي أو جينومات أو معايير الحمض النووي الريبي الاصطناعية التجارية. يعد استخدام جينومات الحمض النووي الريبي كاملة الطول لفحص مفتاح إصبع القدم الأولي مفيدا لأنه يمكن أن يوضح ما إذا كانت العوامل الإضافية ، مثل البنية الثانوية للحمض النووي الريبي ، ستؤثر على أداء المستشعر. لتحسين نسبة التشغيل / الإيقاف للمفاتيح المرشحة ، يمكن معايرة الحمض النووي لمفتاح إصبع القدم في التفاعل الخالي من الخلايا. يمكن أن تعمل هذه الخطوة أيضا على تحديد مفاتيح تثبيت القدم عالية الأداء (تضخيم الطي ، أو نسبة تشغيل / إيقاف عالية) وحذف مفاتيح تثبيت القدم المتسربة (إشارة عالية في حالة عدم وجود الحمض النووي الريبي المستهدف) من خطوات توصيف المصب.

لتحسين حد الكشف عن مرشحي تبديل أصابع القدم الأفضل أداء ، يتم استخدام NASBA لزيادة التركيزات ذات الصلة سريريا من الحمض النووي الريبي الفيروسي Zika المستهدف إلى مستوى يمكن اكتشافه بواسطة مفاتيح إصبع القدم⁶. يتم فحص مجموعات مختلفة من مجموعات التمهيدي الأمامية والخلفية لتحديد أفضل مجموعات مفاتيح NASBA التمهيدي ومفاتيح تثبيت أصابع القدم لتمكين الكشف عند التركيزات ذات الصلة سريريا. بمجرد تحديد مجموعة التمهيدي المثالية ومجموعة مفاتيح تثبيت القدم ، يتم نقل الفحص إلى التحقق السريري. من المهم ملاحظة أن مفتاح تثبيت القدم ومراحل فحص NASBA يمكن أن تكون كثيفة العمالة والموارد ، وبالتالي فإن تطوير الاختبار هو الأنسب لمواقع البحث ذات الموارد الجيدة. على الرغم من أننا لم نطبق أتمتة العمليات ، فمن المحتمل أن يؤدي ذلك إلى تسريع دورة التصميم والبناء والاختبار التكرارية³². لحسن الحظ ، يمكن أن يكون وقت الاستجابة من تصميم المستشعر واختباره إلى النشر قصيرا بشكل ملحوظ (أقل من أسبوع) ، مما يجعل هذه الاستراتيجية مثالية للمواقف الحرجة من حيث الوقت ، مثل تفشي الأوبئة⁶.

حتى بعد تطوير جهاز استشعار حيوي ذو حساسية ذات صلة سريريا ، هناك تحديات تقنية تحتاج إلى معالجة. نظرا لأن هذا البروتوكول يتضمن التشغيل اليدوي وهو إجراء متعدد الخطوات ، فهناك خطر التلوث المتبادل بين العينات. نحن نبذل قصارى جهدنا للحد من هذا الخطر من خلال الممارسة المعملية الدقيقة. في تجربة سريرية حديثة ل 268 عينة من المرضى ، لم نواجه أي مشاكل في التلوث. ومع ذلك ، فهو اعتبار مهم²⁴. مع وضع ذلك في الاعتبار ، يظل البروتوكول مقايسة مختبرية ويتطلب مستخدما ماهرا يتقن تقنيات البيولوجيا الجزيئية المناسبة. هناك اعتبار إضافي للنشر وهو عزل الحمض النووي الريبي من عينات المرضى. هنا نصف عزل الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعات استخراج الحمض النووي القائمة على العمود. ومع ذلك ، في أعمال أخرى ، أظهرنا طريقة تحلل الغليان الفعالة والبسيطة (95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة) لمعالجة عينات المرضى منخفضة العبء⁶. تقضي هذه الاستراتيجية تقريبا على التكلفة المرتبطة باستخراج الحمض النووي الريبي وتتجنب استخدام مجموعات استخراج الحمض النووي القائمة على العمود ، والتي يمكن أن تشكل تحديا لوجستيا في البيئات منخفضة الموارد أو مشكلات سلسلة التوريد أثناء الأزمات ، مثل جائحة COVID-19³³.

كما رأينا خلال جائحة COVID-19 ، يمكن أن تكون الأدوات المستخدمة لإجراء RT-qPCR نفسها بمثابة عنق الزجاجة وتحد من وصول المريض إلى الاختبار. يؤدي هذا العامل ، وهو أيضا مالي إلى حد كبير ، إلى وضع اختبار مركزي يمكن أن يحد من الوصول إلى التشخيص. فعلى سبيل المثال، خلال فاشية زيكا في 2015/2016، لم يكن هناك سوى خمسة مختبرات مرجعية وطنية متاحة في البرازيل، مما تسبب في تأخير اختبار المرضى. دون النظر في الفائدة المحتملة من وفورات الحجم ، فإن التكلفة الحالية للسلع لقارئ اللوحات المحمولة هي ~ 500 دولار أمريكي ، والتي حتى لو زادت خمسة أضعاف لحساب العمالة والهامش التجاري ، لا تزال توفر أداة ميسورة التكلفة. يقارن هذا جيدا بأدوات RT-qPCR التي تتراوح تكلفتها من 15,000 دولار إلى 90,000 دولار أمريكي³⁴ دولارا أمريكيا. علاوة على ذلك ، تبلغ التكلفة المقدرة لكل اختبار للاختبار الخالي من الخلايا في أمريكا اللاتينية حوالي 5.48 دولارا أمريكيا ، في حين أن تكلفة اختبار RT-qPCR في البرازيل كانت ~ 10-11 دولارا أمريكيا في وقت تفشي زيكا³⁶. بالإضافة إلى تكلفة المعدات ، فإن قارئ الألواح المحمول له بصمة صغيرة (20 سم³) ، وتحليل تلقائي ، وتحميل البيانات إلى السحابة عبر الإنترنت ، ويمكن تشغيله على طاقة البطارية. تعمل هذه الميزات على توسيع الإعدادات المحتملة بشكل كبير حيث يمكن نشر الاختبار وتوسع في الوقت نفسه عدد المرضى الذين يمكن خدمتهم.

حتى الآن ، فإن منصات E. coli CFPS التجارية الأكثر شيوعا هي أنظمة S30 و PURE³⁷. ومع ذلك، فإن أحد الاعتبارات الرئيسية في تحسين فرص الحصول على وسائل التشخيص في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل هو التوافر المحلي المحدود لهذه الكواشف. خطوة مهمة نحو حل هذا التحدي هي تطوير إنتاج CFPS المحلي. حقق مختبر Federici مؤخرا تقدما كبيرا نحو تطوير منصة غير تجارية لتنفيذ أجهزة استشعار قائمة على مفتاح تثبيت القدم في الأنظمة الخالية من الخلايا القائمة على المحللة ، حيث وصلت إلى 2.7 fM LOD مع فيروس زيكا RNA¹⁴. لا يسمح هذا الإنجاز فقط بصنع الكواشف في بلد الاستخدام ، وتجنب التعريفات الجمركية على الواردات والتأخير ، ولكن تكاليف العمالة تتدرج أيضا إلى المعدلات المحلية وبالتالي يمكن تخفيض التكلفة الإجمالية بشكل كبير. في العمل الذي حددته مجموعة Federici ، كانت تكلفة إنتاج تفاعل تعبير CFPS (5 ميكرولتر) في تشيلي 6.9 سنتا (دولارا أمريكيا)35,38 ، مما يوفر حافزا مزدوجا (تحسين الخدمات اللوجستية والتكلفة) لتنفيذ الأنظمة القائمة على المحللين ^35,38.

ويمكن أن يحقق وضع الاختبار المقارن بتفاعل البوليميراز المتسلسل بالتحليل العكسي في شبكات التشخيص الموزعة مزايا كبيرة مقارنة بالممارسات الحالية التي تعتمد على نقل العينات إلى مرافق مركزية للتفاعل متعدد التسلسلات بالتفاعل مع تفاعل البوليميراز المتسلسل بالتكرار. وفي المناطق المحيطة بالمدن، حيث تتركز حالات زيكا، تؤدي المسافة المادية بين المريض ومرفق التشخيص إلى إبطاء التشخيص وزيادة خطر عدم وصول النتائج إلى المريض في الوقت المناسب سريريا. ويحدونا الأمل في أن يسهم العمل المقدم هنا في تمكين مجتمع البحوث، من خلال نقل المعرفة، من إنشاء تكنولوجيات حيوية لا مركزية وأجهزة محمولة لصحة الإنسان والزراعة والرصد البيئي.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون جميع أعضاء مختبرات Green و Pardee و Pena وكذلك جميع المؤلفين المشاركين للمخطوطات السابقة المتعلقة بالعمل الذي تم الكشف عنه في هذه المخطوطة. تم دعم S.J.R.D.S. من خلال زمالة الدكتوراه برعاية مؤسسة العلوم والتكنولوجيا في بيرنامبوكو (FACEPE) ، البرازيل ، الرقم المرجعي IBPG-1321-2.12 / 18 ، ويتم دعمه حاليا من خلال زمالة ما بعد الدكتوراه برعاية جامعة تورنتو ، كندا. P.B. مدعوم بجائزة William Knapp Buckley من كلية الصيدلة بجامعة تورنتو. تم دعم M.K. من قبل مبادرة الطب الدقيق (PRiME) في رقم الزمالة الداخلية بجامعة تورنتو PRMF2019-002. تم دعم هذا العمل من خلال أموال إلى K.P من برنامج كراسي البحث الكندية (الملفات 950-231075 و 950-233107) ، وصندوق إدارة المشاريع البحثية الرئيسية بجامعة تورنتو ، وبرنامج منح مؤسسة CIHR (201610FDN-375469) ، و LP و A.A.G. و K.P من خلال منحة فريق CIHR / IDRC: برنامج فيروس زيكا الكندي اللاتيني / الأمريكي الكاريبي (FRN: 149783) ، وكذلك عن طريق الأموال المقدمة إلى K.P. من مركز أبحاث التنمية الدولية الكندي (المنحة 109434-001) من خلال فرصة التمويل السريع للبحوث الكندية لعام 2019 لفيروس كورونا الجديد (COVID-19). تم دعم هذا العمل أيضا بأموال إلى A.A.G. من جائزة الباحث الجديد للجنة البحوث الطبية الحيوية في أريزونا (ADHS16-162400) ، ومؤسسة غيتس (OPP1160667) ، وجائزة المبتكر الجديد لمدير المعاهد الوطنية للصحة (1DP2GM126892) ، وجائزة NIH R21 (1R21AI136571-01A1) إلى K.P./A.A.G ، وزمالة Alfred P. Sloan (FG-2017-9108). تم إنشاء الشكل 1 مع Biorender.com بموجب ترخيص أكاديمي ل K.P.

Materials

384 well plate covers – aluminum	Sarstedt	95.1995	Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader
384 well plate covers – transparent	Sarstedt	95.1994	Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader
384 well plates	VWR	CA11006-180	2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification
Agarose	BioShop Canada	AGA001.500	Gel electrophoresis
BSA	BioShop Canada	ALB001.500	Blocking agent for the Whatman filter paper
Cell free reactions	New England Biolabs	E6800L	PURExpress
CPRG	Roche	10884308001	Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside
Disposable Sterile Biopsy Punches	Integra Miltex	23233-31	Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate
DNAse I	Thermo Scientific	K2981	Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction
DNAse I Kit	Thermo Scientific	74104	DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA
dNTPs	New England Biolabs	N0446S	Used for PCRs
electrophoresis system	Bio-Rad	1704487	Used to run the agarose gels
Gel imaging station	Bio-Rad	1708265	ChemiDoc XRS+ Imaging System
IVT kit	New England Biolabs	E2040S	Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening
Nanodrop One	Thermo Scientific	ND-ONE-W	Used for determining nucleic acid concentrations
NASBA kit	Life Sciences Advanced Technologies	NWK-1	Isothermal amplification reaction components
Nuclease free H20	invitrogen	10977015	Added to reaction mixes
PAGE electrophoresis system	Biorad	1658001FC	Used to cast and run polyacrylamide gels
pCOLADuet-LacZ DNA	Addgene	75006	https://www.addgene.org/75006/
Phusion polymerase/reactioin buffer	New England Biolabs	M0530L	Used for PCRs
Plate reader	BioTek	BioTek NEO2	Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2
Primers	Integrated DNA Technologies		Custom oligo synthesis
Q5 polymerase/reaction buffer	New England Biolabs	M0491L	Used for PCRs
Qiagen PCR Puriifcation Kit	QIAGEN	27106	QIAprep Spin Miniprep Kit
RNA loading dye	New England Biolabs	B0363S	2X RNA loading dye
RNA Purification Kit	QIAGEN	EN0521	QIAamp Viral RNA extraction kit
RNase inhibitor	New England Biolabs	M0314S	Used to prevent contamination of RNases A, B, and C
RT-qPCR kit	QIAGEN	208352	QuantiNova Probe RT-PCR Kit
SYBR Gold	Invitrogen S11494	S11494	PAGE gel stain for nucleic acids
TAE Buffer	BioShop Canada	TAE222.4	Gel electrophoresis buffer
Thermal Cycler	Applied Biosystems	4484073	Used for temperature cycling and incubating reactions
Whatman 42 filter paper	GE Healthcare	1442-042	Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics

References

Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, 73-79 (2006).
Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, 107-144 (2008).
Faria, N. R., et al. Mobile real-time surveillance of Zika virus in Brazil. Genome Medicine. 8 (1), 97 (2016).
Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
Pardee, K., et al. Rapid, low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
Duyen, T. T. M., et al. Paper-based colorimetric biosensor for antibiotics inhibiting bacterial protein synthesis. Journal of Bioscience and Bioengineering. 123 (1), 96-100 (2017).
Jung, J. K., et al. Cell-free biosensors for rapid detection of water contaminants. Nature Biotechnology. 38 (12), 1451-1459 (2020).
Yang, Y. H., et al. Cell-free Escherichia coli-based system to screen for quorum-sensing molecules interacting with quorum receptor proteins of streptomyces coelicolor. Applied and Environmental Microbiology. 75 (19), 6367 (2009).
Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment. Synthetic Biology. 3 (1), (2018).
Park, S., Lee, J. W. Detection of coronaviruses using RNA toehold switch sensors. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1-13 (2021).
Amalfitano, E., et al. A glucose meter interface for point-of-care gene circuit-based diagnostics. Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).
Nguyen, P. Q., et al. Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection. Nature Biotechnology. 39 (11), 1366-1374 (2021).
Pellinen, T., Huovinen, T., Karp, M. A cell-free biosensor for the detection of transcriptional inducers using firefly luciferase as a reporter. Analytical Biochemistry. 330 (1), 52-57 (2004).
Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTRβ-specific endocrine disruptors. Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).
Salehi, A. S. M., et al. Biosensing estrogenic endocrine disruptors in human blood and urine: A RAPID cell-free protein synthesis approach. Toxicology and Applied Pharmacology. 345, 19-25 (2018).
Voyvodic, P. L., et al. Plug-and-play metabolic transducers expand the chemical detection space of cell-free biosensors. Nature Communications. 10 (1), 1-8 (2019).
Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).
Gräwe, A., et al. A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs. PLOS One. 14 (3), 0210940 (2019).
Green, A. A., Silver, P. A., Collins, J. J., Yin, P. Toehold Switches: De-Novo-Designed Regulators of Gene Expression. Cell. 159 (4), 925-939 (2014).
Craw, P., Balachandran, W. Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review. Lab on a Chip. 12 (14), 2469-2486 (2012).
Zyrina, N. V., Antipova, V. N. Nonspecific Synthesis in the Reactions of Isothermal Nucleic Acid Amplification. Biochemistry (Moscow). 86 (7), 887-897 (2021).
Takahashi, M. K., et al. A low-cost paper-based synthetic biology platform for analyzing gut microbiota and host biomarkers. Nature Communications. 9 (1), 1-12 (2018).
Karlikow, M., et al. Field validation of the performance of paper-based tests for the detection of the Zika and chikungunya viruses in serum samples. Nature Biomedical Engineering. 6 (3), 246-256 (2022).
Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 44 (1), 7-19 (2016).
. BLAST: Basic Local Alignment Search Tool Available from: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2022)
Deiman, B., Van Aarle, P., Sillekens, P. Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA). Molecular Biotechnology. 20 (2), 163-179 (2002).
Zadeh, J. N., Wolfe, B. R., Pierce, N. A. Nucleic acid sequence design via efficient ensemble defect optimization. Journal of Computational Chemistry. 32 (3), 439-452 (2011).
JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2021).
Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerging Infectious Diseases. 14 (8), 1232 (2008).
Walsh, D. I., et al. Standardizing automated DNA assembly: Best practices, metrics, and protocols using robots. SLAS Technology. 24 (3), 282 (2019).
Silva, S. J. R., de Magalhães, J. J. F., de Pena, L. Simultaneous circulation of DENV, CHIKV, ZIKV and SARS-CoV-2 in Brazil: An inconvenient truth. One Health. 12, 100205 (2021).
Kimura, S., Fujinaga, K., Sekiya, T. PCR machine. Tanpakushitsu kakusan koso. Protein, Nucleic Acid, Enzyme. 41 (5), 514-517 (1996).
Arce, A., et al. Decentralizing cell-free RNA sensing with the use of low-cost cell extracts. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 727584 (2021).
Silva, S. J. R., Pardee, K., Balasuriya, U. B. R., Pena, L. Development and validation of a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of ZIKV in patient samples from Brazil. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
Shimizu, Y. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
Lavickova, B., Maerkl, S. J. A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system. ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Jaenes, K., Ribeiro da Silva, S. J., Vigar, J. R. J., Wu, K., Norouzi, M., Bayat, P., Karlikow, M., Cicek, S., Guo, Y., Green, A. A., Pena, L., Pardee, K. Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics. J. Vis. Exp. (184), e63223, doi:10.3791/63223 (2022).

Automatically Generated