Summary

В пробирке Характеристика гистоновых шаперонов с использованием аналитических, вытягивающих и шаперонных анализов

Published: December 29, 2021
doi:

Summary

Этот протокол описывает набор методов, которые включают аналитическую хроматографию с исключением размера для изучения олигомеризации и стабильности гистонов-шаперонов, анализ вытягивания для разгадки взаимодействий гистон-шаперон-гистон, AUC для анализа стехиометрии белковых комплексов и анализ гистонового шаперонирования для функциональной характеристики предполагаемого гистонового шаперона in vitro.

Abstract

Гистоновые белки связываются с ДНК с образованием эукариотического хроматина. Основной единицей хроматина является нуклеосома, состоящая из гистонового октамера, состоящего из двух копий основных гистонов H2A, H2B, H3 и H4, обернутых вокруг ДНК. Октамер состоит из двух копий димера H2A/H2B и одной копии тетрамера H3/H4. Высокозаряженные гистоны ядра склонны к неспецифическим взаимодействиям с несколькими белками в клеточной цитоплазме и ядре. Гистоновые шапероны образуют разнообразный класс белков, которые переносят гистоны из цитоплазмы в ядро и помогают их отложению на ДНК, тем самым помогая процессу сборки нуклеосом. Некоторые гистоновые шапероны специфичны для H2A/H2B или H3/H4, а некоторые функционируют как шапероны для обоих. Этот протокол описывает, как лабораторные методы in vitro , такие как вытягивающие анализы, аналитическая хроматография с исключением размера, аналитическое ультрацентрифугирование и анализ гистонов, могут быть использованы в тандеме для подтверждения того, функционирует ли данный белок в качестве гистонового шаперона.

Introduction

Нуклеосомы, состоящие из ДНК и гистоновых белков, образуют структурную единицу хроматина и регулируют несколько критических клеточных событий. Нуклеосомы динамически репозиционируются и реконструируются, чтобы сделать ДНК доступной для различных процессов, таких как репликация, транскрипция и трансляция 1,2. Гистоны, которые являются очень основными, либо имеют тенденцию взаимодействовать с кислыми белками в клеточной среде, либо подвергаются агрегации, что приводит к различным клеточным дефектам 3,4,5. Группа выделенных белков, называемых гистоновыми шаперонами, помогает транспорту гистонов из цитоплазмы в ядро и предотвращает аберрантные события агрегации гистон-ДНК 6,7. По сути, большинство гистоновых шаперонов хранят и переносят гистоны на ДНК с физиологической ионной силой, тем самым способствуя образованию нуклеосом 8,9. Некоторые гистоновые шапероны имеют определенное предпочтение гистоновым олигомерам H2A/H2B или H3/H410.

Гистоновые шапероны характеризуются на основе их способности собирать нуклеосомы, зависимые или независимые от синтеза ДНК11. Например, фактор сборки хроматина-1 (CAF-1) зависит, в то время как гистоновый регулятор A (HIRA) не зависит от синтеза ДНК12,13. Аналогичным образом, семейство нуклеоплазминов гистоновых шаперонов участвует в деконденсации хроматина сперматозоидов и сборке нуклеосом14. Члены семейства нуклеосомных сборочных белков (NAP) способствуют образованию нуклеосомоподобных структур in vitro и участвуют в перемещении гистонов между цитоплазмой и ядром15. Нуклеоплазмины и белки семейства NAP являются функциональными гистоновыми шаперонами, но не имеют общих структурных особенностей. По сути, ни одна структурная особенность не позволяет классифицировать белок как гистоновый шаперон16. Использование функциональных и биофизических анализов наряду со структурными исследованиями лучше всего подходит для характеристики гистоновых шаперонов.

В этой работе описываются биохимические и биофизические методы характеристики белка как гистонового шаперона, который помогает сборке нуклеосом. Сначала была проведена аналитическая размерно-эксклюзионная хроматография для анализа олигомерного статуса и стабильности гистоновых шаперонов. Затем был проведен вытягивающий анализ для определения движущих сил и конкурентного характера взаимодействий гистон-шаперон-гистон. Однако гидродинамические параметры этих взаимодействий не могут быть точно рассчитаны с помощью аналитической размерно-эксклюзионной хроматографии из-за формы белка и его комплексов, которые влияют на их миграцию через столб. Поэтому было использовано аналитическое ультрацентрифугирование, которое обеспечивает макромолекулярные свойства в растворе, которые включают точную молекулярную массу, стехиометрию взаимодействия и форму биологических молекул. В прошлых исследованиях широко использовался анализ гистонов in vitro для функциональной характеристики гистоновых шаперонов, таких как yScS11617, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120. Анализ гистонового шаперонирования также использовался для функциональной характеристики белков как гистоновых шаперонов.

Protocol

1. Аналитическая размерно-эксклюзионная хроматография для выяснения олигомерного статуса и стабильности гистоновых шаперонов Анализ олигомерного статуса гистоновых шапероновУравновешивайте колонку аналитической эксклюзионной хроматографии (SEC) объемом 24 мл с об?…

Representative Results

Рекомбинантный N-концевой нуклеоплазминовый домен белка FKBP53 из Arabidopsis thaliana был подвергнут аналитическому SEC. Пиковый объем элюирования был построен против стандартной кривой, чтобы определить его олигомерное состояние. Результаты анализа SEC показали, что домен существует в виде п?…

Discussion

Эта работа демонстрирует и подтверждает всеобъемлющий набор протоколов для биохимической и биофизической характеристики предполагаемого гистонового шаперона. При этом для демонстрации протоколов использовали рекомбинантно экспрессированные и очищенные белки семейства NAP, AtNRP1 и AtNR…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Заочные гранты Дилипу Васудевану от Совета по научным и инженерным исследованиям правительства Индии [CRG/2018/000695/PS] и Департамента биотехнологии Министерства науки и технологий правительства Индии [BT/INF/22/SP33046/2019], а также внутренняя поддержка со стороны Института наук о жизни Бхубанешвара. Мы благодарим г-жу Судешну Сен и г-жу Аннапурну Саху за их помощь в приготовлении гистонов. Приветствуются также дискуссии с нашими коллегами д-ром Чинмайи Мохапатрой, г-ном Манасом Кумаром Джагдевым и д-ром Шейхом Наусадом Хоссейном.

Materials

Acetic acid (glacial) Sigma A6283
Acrylamide MP Biomedicals 814326
Agarose MP Biomedicals 193983
AKTA Pure 25M FPLC Cytiva 29018226 Instrument for protein purification
Ammonium persulfate (APS) Sigma A3678
An-60Ti rotor Beckman Coulter 361964 Rotor for analytical ultracentrifugation
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
Chloroform Sigma C2432
Coomassie brilliant blue R 250 Sigma 1.15444
Dialysis tubing (7 kDa cut-off) Thermo Fisher 68700 For dialysing protein samples
Dithiothreitol (DTT) MP Biomedicals 100597
DNA Loading Dye New England Biolabs B7025S
EDTA disodium salt MP Biomedicals 194822
Electronic balance Shimadzu ATX224R
Ethanol Sigma E7023
Ethidium bromide (EtBr) Sigma E8751
Gel Doc System Bio-Rad 12009077 For imaging gels after staining
Horizontal gel electrophoresis apparatus Bio-Rad 1704405 Instrument for agarose gel electrophoresis
Hydrochloric acid (HCl) Sigma 320331
Imidazole MP Biomedicals 102033
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M8266
Micropipettes Eppendorf Z683779 For pipetting of micro-volumes
Mini-PROTEAN electrophoresis system Bio-Rad 1658000 Instrument for SDS-PAGE
N,N-methylene-bis-acrylamide MP Biomedicals 800172
Nano drop Thermo Fisher ND-2000 For measurement of protein and DNA concentrations
Ni-NTA agarose Invitrogen R901-15 Resin beads for pull-down assay
Optima AUC analytical ultracentrifuge Beckman Coulter B86437 Instrument for analytical ultracentrifugation
pH Meter Mettler Toledo MT30130863
Phenol Sigma P4557
Plasmid isolation kit Qiagen 27104
Proteinase K Sigma-Aldrich 1.07393
pUC19 Thermo Fisher SD0061 Plasmid for supercoiling assay
Refrigerated high-speed centrifuge Thermo Fisher 75002402
SDS-PAGE protein marker Bio-Rad 1610317
SEDFIT Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis
SEDNTERP Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein
SigmaPrep Spin Columns Sigma SC1000 For pull-down assay
Sodium acetate Sigma S2889
Sodium chloride (NaCl) Merck S9888
Sodium dodecyl sulfate (SDS) MP Biomedicals 102918
Superdex 200 Increase 10/300 GL Cytiva 28990944 Column for analytical size-exclusion chromatography
Superdex 75 Increase 10/300 GL Cytiva 29148721 Column for analytical size-exclusion chromatography
TEMED Sigma 1.10732
Topoisomerase I Inspiralis WGT102 Enzyme used in plasmid supercoiling assay
Tris base Merck T1503
Tween-20 Sigma P1379
Urea MP Biomedicals 191450
Water bath Nüve NB 5 For heat treatment of protein samples
β-mercaptoethanol (β-ME) Sigma M6250

References

  1. Hübner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. Chromatin organization and transcriptional regulation. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).
  2. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  3. Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae. EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).
  4. Prado, F., Aguilera, A. Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability. Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).
  5. Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission. Cell. 44 (1), 43-52 (1986).
  6. Groth, A., et al. Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress. Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).
  7. Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).
  8. Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
  9. Akey, C. W., Luger, K. Histone chaperones and nucleosome assembly. Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).
  10. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
  11. Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).
  12. Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development. EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).
  13. Ray-Gallet, D., et al. HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis. Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).
  14. Frehlick, L. J., Eirín-López, J. M., Ausió, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).
  15. Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).
  16. Elsässer, S. J., D’Arcy, S. Towards a mechanism for histone chaperones. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).
  17. Rodríguez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract. Nucleic Acids Research. 32 (13), 111 (2004).
  18. Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones. Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).
  19. Huang, S., et al. Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).
  20. Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).
  21. Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).
  22. Scofield, B. T. K. H. . Protein Electrophoresis. , (2012).
  23. Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. Dialysis and concentration of protein solutions. Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).
  24. Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. Journal of Visualized Experiments. (33), e1530 (2009).
  25. Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation. Bio-protocol. 10 (10), 3625 (2019).
  26. Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Current Protocols in Protein Science. , (2013).
  27. Schuck, P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).
  28. Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1. Molecules. 24 (12), 2258 (2019).
  29. Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA. Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).
  30. Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).
  31. Newman, E. R., et al. Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).
  32. Edlich-Muth, C., et al. The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins. Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).
  33. Franco, A., et al. Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition. Scientific Reports. 9 (1), 9487 (2019).
  34. Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone. FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).
  35. Graziano, G. Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3. Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).
  36. Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
  37. Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).
  38. Avvakumov, N., Nourani, A., Côté, J. Histone chaperones: Modulators of chromatin marks. Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).
  39. Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. Chaperoning histones during DNA replication and repair. Cell. 140 (2), 183-195 (2010).
  40. Chu, X., et al. Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B. PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).
  41. Heidarsson, P. O., et al. Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome. bioRxiv. , (2020).

Play Video

Cite This Article
Bobde, R. C., Saharan, K., Baral, S., Gandhi, S., Samal, A., Sundaram, R., Kumar, A., Singh, A. K., Datta, A., Vasudevan, D. In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays. J. Vis. Exp. (178), e63218, doi:10.3791/63218 (2021).

View Video