In vitro Karakterisering van Histone Chaperones met behulp van Analytische, Pull-Down en Chaperoning Assays
Summary
Dit protocol beschrijft een reeks methoden die analytische grootte-uitsluitingschromatografie omvatten om histon chaperone oligomerisatie en stabiliteit te bestuderen, pull-down assay om histon chaperone-histon interacties te ontrafelen, AUC om de stoichiometrie van de eiwitcomplexen te analyseren, en histon chaperoning assay om functioneel een vermeende histon chaperone in vitro te karakteriseren.
Abstract
Histoneiwitten associëren zich met DNA om het eukaryote chromatine te vormen. De basiseenheid van chromatine is een nucleosoom, bestaande uit een histon octameer bestaande uit twee kopieën van de kern histonen H2A, H2B, H3 en H4, omwikkeld door het DNA. Het octameer bestaat uit twee kopieën van een H2A/H2B-dimeer en een enkele kopie van een H3/H4-tetrameer. De sterk geladen kern histonen zijn gevoelig voor niet-specifieke interacties met verschillende eiwitten in het cellulaire cytoplasma en de kern. Histon chaperones vormen een diverse klasse van eiwitten die histonen van het cytoplasma naar de kern brengen en hun afzetting op het DNA ondersteunen, waardoor het nucleosoomassemblageproces wordt ondersteund. Sommige histon chaperones zijn specifiek voor H2A / H2B of H3 / H4, en sommige functioneren als chaperones voor beide. Dit protocol beschrijft hoe in vitro laboratoriumtechnieken zoals pull-down assays, analytische grootte-uitsluitingschromatografie, analytische ultracentrifugatie en histon chaperoning assay in tandem kunnen worden gebruikt om te bevestigen of een bepaald eiwit functioneel is als een histon chaperone.
Introduction
Nucleosomen samengesteld uit DNA- en histoneiwitten vormen de structurele eenheid van chromatine en reguleren verschillende kritieke cellulaire gebeurtenissen. Nucleosomen worden dynamisch geherpositioneerd en gehermodelleerd om DNA toegankelijk te maken voor verschillende processen zoals replicatie, transcriptie en vertaling 1,2. Histonen die zeer basaal zijn, hebben de neiging om te interageren met zure eiwitten in het cellulaire milieu of ondergaan aggregatie, wat leidt tot verschillende cellulaire defecten 3,4,5. Een groep speciale eiwitten genaamd histon chaperones helpen het transport van histonen van het cytoplasma naar de kern en voorkomen afwijkende histon-DNA-aggregatiegebeurtenissen 6,7. Fundamenteel slaan de meeste histon chaperones histonen op en brengen ze over op DNA op fysiologische ionische sterkte, waardoor de vorming van nucleosomenwordt bevorderd 8,9. Sommige histon chaperones hebben een duidelijke voorkeur voor de histon oligomeren H2A/H2B of H3/H410.
Histon chaperones worden gekenmerkt op basis van hun vermogen om nucleosomen te assembleren afhankelijk of onafhankelijk van DNA-synthese11. Chromatine assembly factor-1 (CAF-1) is bijvoorbeeld afhankelijk, terwijl histonregulator A (HIRA) onafhankelijk is van DNA-synthese12,13. Evenzo is de nucleoplasminefamilie van histon chaperones betrokken bij spermachromatine-decondensatie en nucleosoomassemblage14. De nucleosoomassemblage-eiwit (NAP) familieleden vergemakkelijken de vorming van nucleosoomachtige structuren in vitro en zijn betrokken bij de shuttling van histonen tussen cytoplasma en nucleus15. Nucleoplasmineen en NAP-familie-eiwitten zijn beide functionele histon chaperones, maar delen geen structurele kenmerken. In wezen staat geen enkel structureel kenmerk de classificatie van een eiwit als een histon chaperone16 toe. Het gebruik van functionele en biofysische assays samen met structurele studies werken het beste bij het karakteriseren van histon chaperones.
Dit werk beschrijft biochemische en biofysische methoden om een eiwit te karakteriseren als een histon chaperonne die nucleosoomassemblage helpt. Eerst werd analytische grootte-uitsluitingschromatografie uitgevoerd om de oligomere status en stabiliteit van histon chaperones te analyseren. Vervolgens werd een pull-down assay uitgevoerd om de drijvende krachten en het competitieve karakter van histone chaperone-histone interacties te bepalen. De hydrodynamische parameters van deze interacties konden echter niet nauwkeurig worden berekend met behulp van analytische grootte-uitsluitingschromatografie vanwege de vorm van het eiwit en zijn complexen die hun migratie door de kolom beïnvloeden. Daarom werd analytische ultracentrifugatie gebruikt, die macromoleculaire eigenschappen in de oplossing biedt, waaronder nauwkeurig molecuulgewicht, de stoichiometrie van interactie en de vorm van de biologische moleculen. Eerdere studies hebben uitgebreid gebruik gemaakt van in vitro histon chaperoning assay om histon chaperones zoals yScS11617, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120 functioneel te karakteriseren. Histon chaperoning assay werd ook gebruikt om de eiwitten functioneel te karakteriseren als histon chaperones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit werk demonstreert en valideert een uitgebreide reeks protocollen voor de biochemische en biofysische karakterisering van een vermeende histon chaperonne. Hierin werden recombinant tot expressie gebrachte en gezuiverde NAP-familie-eiwitten, AtNRP1 en AtNRP2, en het N-terminale nucleoplasminedomein van AtFKBP53 gebruikt om de protocollen te demonstreren. Dezelfde reeks experimenten zou heel goed kunnen worden gebruikt om de functionele kenmerken van voorheen niet-gekarakteriseerde histon chaperones van elk organisme af…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De extramurale subsidies aan Dileep Vasudevan van de Science and Engineering Research Board, government of India [CRG/2018/000695/PS] en het Department of Biotechnology, Ministry of Science and Technology, Government of India [BT/INF/22/SP33046/2019], evenals de intramurale steun van het Institute of Life Sciences, Bhubaneswar worden zeer erkend. We bedanken mevrouw Sudeshna Sen en mevrouw Annapurna Sahoo voor hun hulp bij de voorbereiding van histon. De gesprekken met onze collega’s Dr. Chinmayee Mohapatra, Mr. Manas Kumar Jagdev en Dr. Shaikh Nausad Hossain worden ook erkend.
Materials
| Acetic acid (glacial) | Sigma | A6283 | |
| Acrylamide | MP Biomedicals | 814326 | |
| Agarose | MP Biomedicals | 193983 | |
| AKTA Pure 25M FPLC | Cytiva | 29018226 | Instrument for protein purification |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma | A3678 | |
| An-60Ti rotor | Beckman Coulter | 361964 | Rotor for analytical ultracentrifugation |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Coomassie brilliant blue R 250 | Sigma | 1.15444 | |
| Dialysis tubing (7 kDa cut-off) | Thermo Fisher | 68700 | For dialysing protein samples |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals | 100597 | |
| DNA Loading Dye | New England Biolabs | B7025S | |
| EDTA disodium salt | MP Biomedicals | 194822 | |
| Electronic balance | Shimadzu | ATX224R | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | |
| Ethidium bromide (EtBr) | Sigma | E8751 | |
| Gel Doc System | Bio-Rad | 12009077 | For imaging gels after staining |
| Horizontal gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 1704405 | Instrument for agarose gel electrophoresis |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma | 320331 | |
| Imidazole | MP Biomedicals | 102033 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
| Micropipettes | Eppendorf | Z683779 | For pipetting of micro-volumes |
| Mini-PROTEAN electrophoresis system | Bio-Rad | 1658000 | Instrument for SDS-PAGE |
| N,N-methylene-bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800172 | |
| Nano drop | Thermo Fisher | ND-2000 | For measurement of protein and DNA concentrations |
| Ni-NTA agarose | Invitrogen | R901-15 | Resin beads for pull-down assay |
| Optima AUC analytical ultracentrifuge | Beckman Coulter | B86437 | Instrument for analytical ultracentrifugation |
| pH Meter | Mettler Toledo | MT30130863 | |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Plasmid isolation kit | Qiagen | 27104 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 1.07393 | |
| pUC19 | Thermo Fisher | SD0061 | Plasmid for supercoiling assay |
| Refrigerated high-speed centrifuge | Thermo Fisher | 75002402 | |
| SDS-PAGE protein marker | Bio-Rad | 1610317 | |
| SEDFIT | Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis | ||
| SEDNTERP | Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein | ||
| SigmaPrep Spin Columns | Sigma | SC1000 | For pull-down assay |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | S9888 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | MP Biomedicals | 102918 | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | 28990944 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
| Superdex 75 Increase 10/300 GL | Cytiva | 29148721 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
| TEMED | Sigma | 1.10732 | |
| Topoisomerase I | Inspiralis | WGT102 | Enzyme used in plasmid supercoiling assay |
| Tris base | Merck | T1503 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Urea | MP Biomedicals | 191450 | |
| Water bath | Nüve | NB 5 | For heat treatment of protein samples |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma | M6250 |
References
- Hübner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. Chromatin organization and transcriptional regulation. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).
- Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
- Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae. EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).
- Prado, F., Aguilera, A. Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability. Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).
- Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission. Cell. 44 (1), 43-52 (1986).
- Groth, A., et al. Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress. Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).
- Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).
- Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
- Akey, C. W., Luger, K. Histone chaperones and nucleosome assembly. Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).
- De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
- Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).
- Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development. EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).
- Ray-Gallet, D., et al. HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis. Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).
- Frehlick, L. J., Eirín-López, J. M., Ausió, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).
- Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).
- Elsässer, S. J., D’Arcy, S. Towards a mechanism for histone chaperones. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).
- Rodríguez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract. Nucleic Acids Research. 32 (13), 111 (2004).
- Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones. Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).
- Huang, S., et al. Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).
- Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).
- Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).
- Scofield, B. T. K. H. . Protein Electrophoresis. , (2012).
- Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. Dialysis and concentration of protein solutions. Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).
- Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. Journal of Visualized Experiments. (33), e1530 (2009).
- Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation. Bio-protocol. 10 (10), 3625 (2019).
- Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Current Protocols in Protein Science. , (2013).
- Schuck, P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).
- Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1. Molecules. 24 (12), 2258 (2019).
- Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA. Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).
- Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).
- Newman, E. R., et al. Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).
- Edlich-Muth, C., et al. The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins. Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).
- Franco, A., et al. Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition. Scientific Reports. 9 (1), 9487 (2019).
- Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone. FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).
- Graziano, G. Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3. Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).
- Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
- Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).
- Avvakumov, N., Nourani, A., Côté, J. Histone chaperones: Modulators of chromatin marks. Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).
- Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. Chaperoning histones during DNA replication and repair. Cell. 140 (2), 183-195 (2010).
- Chu, X., et al. Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B. PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).
- Heidarsson, P. O., et al. Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome. bioRxiv. , (2020).
