تحليل مبسط وعالي الإنتاجية لانقباض الخلية الواحدة باستخدام اللدائن المطاطية ذات الأنماط الدقيقة
Summary
يقدم هذا العمل بروتوكولا مرنا لاستخدام تكنولوجيا الأسطح المرنة القابلة للانكماش (FLECS) ذات العلامات الفلورية في شكل ميكروويل من أجل تحديد كمي مبسط وغير مباشر لقوى الانقباض أحادية الخلية استنادا إلى الإزاحة المرئية للأنماط الدقيقة للبروتين الفلوري.
Abstract
توليد قوة الانقباض الخلوي هو سمة أساسية مشتركة بين جميع الخلايا تقريبا. هذه القوى الانقباضية ضرورية للتنمية السليمة ، وتعمل على كل من المستويات الخلوية والأنسجة ، وتنظيم الأنظمة الميكانيكية في الجسم. تعتمد العديد من العمليات البيولوجية على القوة ، بما في ذلك الحركة والالتصاق وانقسام الخلايا المفردة ، بالإضافة إلى تقلص واسترخاء أعضاء مثل القلب والمثانة والرئتين والأمعاء والرحم. نظرا لأهميته في الحفاظ على الوظيفة الفسيولوجية المناسبة ، يمكن أن يؤدي الانقباض الخلوي أيضا إلى دفع عمليات المرض عند المبالغة فيه أو تعطيله. الربو وارتفاع ضغط الدم والمخاض المبكر والتندب الليفي والمثانة غير النشطة كلها أمثلة على عمليات المرض المدفوعة ميكانيكيا والتي يمكن تخفيفها من خلال التحكم السليم في قوة الانقباض الخلوية. هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا لاستخدام تقنية جديدة لفحص الانقباض القائم على الصفائح الدقيقة تعرف باسم الأسطح القابلة للانكماش المطاطي (FLECS) ، والتي توفر تحليلا مبسطا وبديهيا لانقباض الخلية الواحدة بطريقة واسعة النطاق. هنا ، نقدم بروتوكولا تدريجيا للحصول على منحنيين من ست نقاط للجرعة والاستجابة يصفان تأثيرات اثنين من مثبطات الانقباض على تقلص خلايا العضلات الملساء الأولية للمثانة البشرية في إجراء بسيط باستخدام صفيحة دقيقة واحدة فقط من فحص FLECS ، لإظهار التقنية المناسبة لمستخدمي الطريقة. باستخدام تقنية FLECS ، يمكن لجميع الباحثين الذين لديهم مختبرات بيولوجية أساسية وأنظمة الفحص المجهري الفلوري الوصول إلى دراسة هذا النمط الظاهري الأساسي للخلية الوظيفي ولكن يصعب تحديده كميا ، مما يقلل بشكل فعال من حاجز الدخول إلى مجال بيولوجيا القوة والفحص الظاهري لقوة الخلية الانقباضية.
Introduction
القوى الميكانيكية الناتجة عن الخلايا ضرورية للوظيفة المناسبة في مختلف الأعضاء في جميع أنحاء الجسم مثل الأمعاء والمثانة والقلب وغيرها. يجب أن تولد هذه الأعضاء أنماطا مستقرة من تقلص الخلايا والاسترخاء للحفاظ على حالة الاستتباب الداخلية. يمكن أن يؤدي تقلص خلايا العضلات الملساء غير الطبيعي (SMC) إلى ظهور اضطرابات مختلفة، بما في ذلك، على سبيل المثال، خلل الحركة المعوي، الذي يتميز بأنماط غير طبيعية من تقلص العضلات الملساء المعوية1، فضلا عن الظروف البولية لفرط النشاط2 أو المثانة غير النشطة3. داخل الشعب الهوائية، يمكن أن تؤدي SMCs التي تظهر أنماط انكماش غير منتظمة إلى فرط الاستجابة الربوية4، مما قد يؤدي إلى تشديد الشعب الهوائية وتقليل تدفق الهواء من الأكسجين إلى الرئتين. وهناك حالة جسدية أخرى واسعة الانتشار، وهي ارتفاع ضغط الدم، ناجمة عن تقلبات في تقلص العضلات الملساء داخل الأوعية الدموية5. من الواضح أن آليات الانقباض داخل الخلايا والأنسجة يمكن أن تؤدي إلى أمراض تتطلب خيارات علاجية. نظرا لأن هذه الحالات تنبع بشكل لا لبس فيه من السلوكيات الانقباضية المختلة وظيفيا للخلايا ، يصبح من المنطقي والضروري قياس وظيفة انقباض الخلية نفسها ، عند فحص الأدوية المرشحة المحتملة.
إدراكا للحاجة إلى أدوات لدراسة قوة الانقباض الخلوي ، تم تطوير العديد من طرق فحص الانكماش الكمي من قبل الباحثين الأكاديميين بما في ذلك الفحص المجهري لقوة الجر (TFM) 6 ، و TFM7 المجهري ، ومقايسات الجل العائم 8 ، والمقايسات المجهرية المطاطية 9. وقد استخدمت هذه التقنيات في شكل طبق واحد وكذلك شكل متعدد الصحون في العديد من الدراسات وحتى تم اقتراحها لقياسات القوة ثلاثية الأبعاد10،11،12،13،14. في حين أن هذه التقنيات قد مكنت من إجراء أبحاث رائدة في المجال الواسع لبيولوجيا قوة الخلية ، فقد اقتصرت جميعها إلى حد كبير على المختبرات التي تمتلك قدرات وموارد محددة ، على وجه الخصوص: القدرة على تصنيع ركائز TFM ، والقدرة على تطبيق خوارزميات معقدة وغير بديهية بشكل صحيح لحل خرائط إزاحة TFM ، وأنظمة الفحص المجهري الدقيقة نسبيا التي يمكنها تسجيل الصور الملتقطة قبل وبعد إزالة العينات من المرحلة (لتفكك الخلايا). وبالتالي ، بالنسبة للباحث غير المدرب ، يمكن أن يكون حاجز الدخول لاستخدام هذه الأساليب مرتفعا جدا نظرا لمجموعة واسعة من المتطلبات لتطبيق هذه التقنيات. بالإضافة إلى ذلك، فإن دقة التصوير المطلوبة للعديد من التقنيات الحالية (أهداف 40x أو أكثر) يمكن أن تحد بشكل كبير من الإنتاجية التجريبية، في حين أن تقنيات القياس السائبة يمكن أن تخفي مساهمات الخلايا المتطرفة وتمنع اكتشاف اختلافات انقباضية أكثر اعتدالا. ومن الجدير بالذكر أنه على حد علم المؤلفين، فإن نهج فحص الجل العائم منخفض الإنتاجية وشبه الكمي هو الوحيد الذي نضج بما فيه الكفاية ليصبح متاحا للباحثين (انظر الشكل 1).
الشكل 1: المخطط العام لطريقة تقنية FLECS . (أ) يتم الالتزام بالخلايا بالأنماط الدقيقة للبروتين اللاصق التي يتم تضمينها تساهميا في طبقة مرنة رقيقة مدعومة بالزجاج. (ب) عرض علوي لمختلف أشكال الأنماط الدقيقة المحتملة وانفجار خلية تتقلص على شكل نمط مجهري على شكل حرف “X”. (ج) تراكب الأنماط الدقيقة الفلورية وصور تباين الطور للخلية المتعاقدة. (د) صور زمنية لخلية متعاقدة واحدة. أشرطة المقياس = 25 ميكرومتر. تم تكييف هذا الرقم بإذن من بوشكارسكي وآخرون15. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
بعد التطورات الحديثة في التكنولوجيا الدقيقة ، طور المؤلفون تقنية قائمة على الصفائح الدقيقة تمكن من إجراء قياسات كمية لتقلص الخلية الواحدة في مئات الآلاف من الخلايا تسمى FLECS (الأسطح القابلة للانكماش المطاطي الموسومة بالفلورسنت) 15،16،17،18،19،20 ، كبديل ل TFM. في هذا النهج ، يتم تضمين الأنماط الدقيقة للبروتين الفلورسنت في الأفلام اللينة التي تشوه وتتقلص عندما تطبق الخلايا قوى الجر عليها ، بطريقة بديهية وقابلة للقياس. الأهم من ذلك ، أن الأنماط الدقيقة للبروتين تقيد موضع الخلية وشكلها ومنطقة انتشارها ، مما يؤدي إلى ظروف اختبار موحدة. تسمح هذه القياسات البسيطة بناء على تغييرات الأبعاد الخاصة بها فقط ، والتي يتم حلها بشكل كبير مكانيا حتى في صور التكبير 4x. تتضمن هذه الطريقة وحدة تحليل صور قائمة على المتصفح وتمكن من التحليل المباشر لقوة الخلايا الانقباضية دون الحاجة إلى إجراءات معالجة دقيقة أو تسجيل علامات ائتمانية ، بحيث يجب أن تكون قابلة للتشغيل من قبل أي باحث لديه مرفق أساسي لزراعة الخلايا ومجهر فلورسنت بسيط مع تكبير منخفض (الشكل 2 ). تم تصميم هذه التكنولوجيا ، الجاهزة على الرف والمتاحة تجاريا ، مع وضع المستخدم النهائي في الاعتبار وتهدف إلى تقليل حاجز الدخول أمام أي عالم مختبر لدراسة بيولوجيا القوة الخلوية.
الشكل 2: مخطط لشكل لوحة 24 بئرا لفحص انقباض الخلية الواحدة. تم استخدام هذا التنسيق في التجارب الموضحة هنا والموضحة في جزء الفيديو من المقالة. أشرطة المقياس = 25 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
في هذا العمل ، نقدم بروتوكولا لتطبيق تنسيق لوحة البئر 24 لمنصة FLECS Technology لتحديد آثار الأدوية المعدلة بالقوة على الانقباض الخلوي في خلايا العضلات الملساء الأولية للمثانة. يمكن تكييف هذا البروتوكول للأغراض العامة وتعديله حسب الحاجة لمراعاة مختلف الجداول الزمنية الأخرى وأنواع الخلايا وظروف العلاج ذات الأهمية ، وتوسيع نطاقه للإجابة على أسئلة أخرى في بيولوجيا القوة.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر هذه الطريقة المبسطة لقياس الانكماش كميا في مئات الآلاف من الخلايا في وقت واحد في ظل ظروف معالجة مختلفة واستخدام أدوات الفحص المجهري القياسية فقط بديلا يمكن الوصول إليه ل TFM التقليدي للباحثين لدراسة بيولوجيا القوة الخلوية. نظرا لأن التكنولوجيا المقدمة توفر عرضا مرئيا لتقلص الخلية من خلال تحليل التغيرات في الأنماط الدقيقة الفلورية ذات الشكل المنتظم ، فإن حجم الانكماش الذي تنتجه أي خلية معينة مفهوم بشكل حدسي – كلما كان النمط المجهري أصغر ، زادت قوة الانقباض التي تمارسها الخلية.
ومن الجدير بالذكر أنه من خلال توفير السيطرة على عوامل مثل الشكل ومنطقة الانتشار وجزيء الالتصاق الذي يضم الأنماط الدقيقة (جميع العوامل المعروفة بتنظيم انقباض الخلايا22،23،24) ، فإن التكنولوجيا المقدمة تقضي بشكل منهجي على المتغيرات الإضافية التي قد تربك تفسيرات دراسات تقلص الخلايا.
في هذه التجربة ، تم استخدام صلابة 10 كيلو باسكال في الجل وتم استخدام نمط مجهري 70 ميكرومتر (طول قطري) يتكون من الكولاجين من النوع الرابع. إلى جانب هذه المعلمات ، يمكن استبدال الجزيء اللاصق بالعديد من الكولاجين والفيبرونيكتين والجيلاتين والمصفوفة الأخرى خارج الخلية (ECM). يمكن ضبط صلابة الجل إلى 0.1 كيلو باسكال ، وحتى في نطاق MPa. يمكن تصميم هندسة micropattern de novo لتكون أي شكل مع الحد الأدنى من حجم الميزة من ~ 5 ميكرومتر. يتم فصل هذه المعلمات ويمكن تحسينها بشكل مستقل لسياق بيولوجي معين.
تم التحقق من صحة هذه التقنية على نطاق واسع لتكون متوافقة مع أنواع الخلايا شديدة اللصق والانقباض من النمط الظاهري الوسيط بما في ذلك أنواع مختلفة من خلايا العضلات الملساء (المثانة البشرية الأولية ، الأمعاء ، القصبة الهوائية ، الشعب الهوائية ، الرحم ، الأبهري ، والشرايين) ، والخلايا الجذعية الوسيطة وذريتها المتمايزة ، والخلايا الليفية المختلفة (الرئوية والجلدية والقلبية) ، والخلايا الليفية العضلية ، والخلايا البطانية. بالإضافة إلى ذلك ، ستنتج البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية أيضا قوة بلعمة كبيرة قابلة للقياس على الأنماط الدقيقة ، خاصة إذا كان النمط الدقيق يتكون من أوبسونين معروف. يمكن أيضا فحص خطوط السرطان المختلفة باستخدام الطريقة.
قد تشكل هذه الطريقة بعض التحديات للاستخدام مع الخلايا التي تكون إما صغيرة نسبيا مثل الخلايا التائية والعدلات ، أو أنواع الخلايا ذات النمط الظاهري الظهاري في الغالب. السبب الرئيسي لذلك هو أن الطريقة تعتمد على الالتصاق القوي والانتشار الكامل للخلايا عبر النمط المجهري من أجل توليد إشارة الانقباض القابلة للقياس. الخلايا التي ترتبط بشكل ضعيف ، أو ترتبط ببعضها البعض ، أو لا تنتشر تماما لن تنتج إشارات انقباضية قابلة للقياس. يمكن تخفيف هذه السلوكيات ، النادرة نسبيا ، عن طريق ضبط حجم النمط الدقيق ليكون أصغر ، أو باستخدام جزيئات لاصقة بديلة داخل الأنماط الدقيقة التي من شأنها تعزيز الالتصاق والانتشار بشكل أفضل في تلك الخلايا.
يجب على مستخدمي التكنولوجيا تقييم مختلف التركيبات المتوسطة المحتملة لزراعة الخلايا بعناية لنوع الخلية الخاص بهم ، حيث أن المكونات المختلفة وعوامل النمو ومستويات المصل وحساسيات الأس الهيدروجيني قد تؤدي إلى سلوكيات متغيرة في خلايا مختلفة. يجب أن يسبق تحسين البروتوكول توسيع نطاق أي سير عمل تجريبي ، ويجب أن تكون مكونات الوسائط دائما جديدة ومعقمة ومتسقة مع الدفعات السابقة.
في نهاية المطاف، إذا لم تكن دقة الخلية الواحدة ضرورية لأهداف المستخدم، أو إذا كان نوع الخلية المستهدفة لديه الحد الأدنى من القدرة على الانتشار، فقد تكون TFM التقليدية مناسبة بنفس القدر أو أكثر لمثل هذه التجارب. هدف المؤلفين وأملهم هو أن توفر هذه الأداة وسيلة إضافية لعلماء الأحياء الخلوية لدراسة الانكماش الخلوي ، لا سيما في سياق شاشات الأدوية الظاهرية الآلية عالية الإنتاجية.
خاصة بالاستخدامات المستقبلية في شاشات الأدوية ، يمكن استخدام لوحات إنتاجية أعلى مثل لوحة FLECS ذات 384 بئرا. في مثل هذه الصفائح ، يمكن لأهداف 4x على العديد من المجاهر التقاط بئر واحد كامل في مجال رؤيتها ، مما يضمن التقاط جميع الاستجابات الانقباضية الخلوية. باستخدام نظام تصوير عالي الإنتاجية ، يمكن تصوير لوحة كاملة من 384 بئرا في حوالي 5 دقائق ، مما يجعل هذا النظام أسرع بشكل كبير من الخيارات الأخرى ، وبالتالي ، مناسب لاكتشاف الأدوية ذات النمط الظاهري عالي الإنتاجية. في الواقع ، يقوم المؤلفون بشكل روتيني بتشغيل شاشات الأدوية الأسبوعية على حوالي 50 384 بئرا (يبلغ مجموعها أكثر من 19000 بئر) باستخدام الأتمتة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم إجراء العمل المختبري بدعم من مورد الفحص الجزيئي المشترك بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (MSSR) حيث ترعى Forcyte الأنشطة البحثية ، وحاضنة Magnify في معهد California NanoSystems Institute (CNSI) ، حيث Forcyte Biotechnologies، Inc. هي شركة مقيمة. سيمنح المؤلفون إمكانية الوصول إلى وحدة تحليل FLECS Biodock.ai لجميع الباحثين الأكاديميين عند الطلب. ساهم L.H. و I.P. بالتساوي في هذا العمل.
Materials
| Bladder smooth muscle cell culture | Sciencell | #4310 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560 | |
| Cell culture media | Thermofisher | 11765054 | Ham's F12 medium supplemented with 10% FBS and 1% p/s |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 7201432 | |
| Conical Tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Culture flask | Fisher Scientific | FB012941 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Fisher Scientific | D1284 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-31 | |
| Fluorescent microscope | Molecular Devices | ImageXpress Confocal | |
| Forcyte-manufactured 24-well plate | Forcyte Biotechnologies | 24-HC4R-X1-QB12 | |
| Hoescht 3342 Live Nuclear Stain | Thermofisher | 62249 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP39920 |
References
- Ohama, T., Hori, M., Ozaki, H. Mechanism of abnormal intestinal motility in inflammatory bowel disease: How smooth muscle contraction is reduced. Journal of Smooth Muscle Research. 43 (2), 43-54 (2007).
- Peyronnet, B., et al. A comprehensive review of overactive bladder pathophysiology: On the way to tailored treatment. European Urology. 75 (6), 988-1000 (2019).
- Aldamanhori, R., Osman, N. I., Chapple, C. R. Underactive bladder: Pathophysiology and clinical significance. Asian Journal of Urology. 5 (1), 17-21 (2018).
- Sanderson, M. J., Delmotte, P., Bai, Y., Perez-Zogbhi, J. F. Regulation of airway smooth muscle cell contractility by Ca2+ signaling and sensitivity. Proceedings of the American Thoracic Society. 5 (1), 23-31 (2008).
- Brozovich, F. V., et al. Mechanisms of vascular smooth muscle contraction and the basis for pharmacologic treatment of smooth muscle disorders. Pharmacological Reviews. 68 (2), 476-532 (2016).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
- Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: an approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).
- Rokhzan, R., et al. high-throughput measurements of cell contraction and endothelial barrier function. Laboratory Investigation. 99 (1), 138-145 (2019).
- Park, C. Y., et al. High-throughput screening for modulators of cellular contractile force. Integrative Biology. 7 (10), 1318-1324 (2015).
- Kaylan, K. B., Kourouklis, A. P., Underhill, G. H. A high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces. Journal of Visualized Experiments. (121), e55362 (2017).
- Huang, Y., et al. Traction force microscopy with optimized regularization and automated Bayesian parameter selection for comparing cells. Scientific Reports. 9, 539 (2019).
- Franck, C., Maskarinec, S. A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Three-dimensional traction force microscopy: A new tool for quantifying cell-matrix interactions. PLOS ONE. 6, 17833 (2011).
- Pushkarsky, I., et al. Elastomeric sensor surfaces for high-throughput single-cell force cytometry. Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).
- Pushkarsky, I. FLECS technology for high-throughput single-cell force biology and screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 16 (1), 7-11 (2017).
- Koziol-White, C. J., et al. Inhibition of PI3K promotes dilation of human small airways in a rho kinase-dependent manner. British Journal of Pharmacology. 173 (18), 2726-2738 (2016).
- Orfanos, S., et al. Obesity increases airway smooth muscle responses to contractile agonists. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 315 (5), 673-681 (2018).
- Tseng, P., Pushkarsky, I., Carlo, D. D. Metallization and biopatterning on ultra-flexible substrates via dextran sacrificial layers. PLOS ONE. 9, 106091 (2014).
- Yoo, E. J., et al. Gα12 facilitates shortening in human airway smooth muscle by modulating phosphoinositide 3-kinase-mediated activation in a RhoA-dependent manner. British Journal of Pharmacology. 174 (4), 4383-4395 (2017).
- MacGlashan, D., Vilariño, N. Polymerization of actin does not regulate desensitization in human basophils. Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 627-637 (2009).
- Hocking, D. C., Sottile, J., Langenbach, K. J. Stimulation of integrin-mediated cell contractility by fibronectin polymerization. Journal of Biological Chemistry. 275 (14), 10673-10682 (2000).
- Tolić-Nørrelykke, I. M., Wang, N. Traction in smooth muscle cells varies with cell spreading. Journal of Biomechanics. 38 (7), 1405-1412 (2005).
- Ye, G. J. C., et al. The contractile strength of vascular smooth muscle myocytes is shape dependent. Integrative Biology. 6 (2), 152-163 (2014).
