一過性発現システムを用いた哺乳類細胞における完全長ヒトハンチンチン変異体の効率的かつスケーラブルな生産

一過性発現ベクター(pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG、図1A)は、FL Q23-HTT(aa 1-3,144、Q23ナンバリングに基づく)の哺乳類細胞における迅速な産生のために操作されています。このコンストラクトは、カセットクローニングによって様々なHTT変異コンストラクトを迅速に生成し、最小限のクロマトグラフィーステップでHTTタンパク質を高品質かつ均質に精製しやすくし、タグなしFL HTTを生成するオプションを有するように設計された特徴を有する。機能のリストには1が含まれています。HTTエクソン1におけるCAGリピートを取り囲むHindIII制限消化部位は、制限酵素消化およびライゲーションによって様々な長さのpolyQストレッチを有するFL HTT変異体を生成するために使用することができる。2. FL HTTのC末端は、TEVプロテアーゼ認識部位を有するFLAGエピトープでタグ付けされており、高純度のFL HTTのワンステップアフィニティー精製およびTEVプロテアーゼ切断を使用したタグフリーFL HTTタンパク質のオプション生成。3.HEK293細胞での高発現のためのヒト細胞コドン使用のためのコドン最適化FLHTTシーケンス。pcDNA 3.1(+)ベクターは、哺乳類細胞株におけるCMVプロモーターの高い転写活性化活性を利用するための構築物のバックボーンとして使用されます。 pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAGを開始テンプレートとして使用して、2つのHindIII制限酵素部位にまたがる適切なQ長のDNA断片を合成し、テンプレート内の同じ領域を交換することにより、Q48およびQ73 FL HTT構築物を作製しました。FL HTT(aa 91-3,144)のΔExon1変異体(図1B)を、鋳型中のエクソン1領域にまたがる欠失残基を指向したプライマーを用いて作製した。PEIを用いてpcDNA3.1−Q23−HTT−TEV−FLAGを導入したHEK293細胞を、5%CO2下の5L振とうフラスコ中で増殖させた。典型的な大規模精製では、6.0 ×10 9-3.0 × 1010セルを含む2〜10 Lセルペレットを使用します。精製に進む前に、各トランスフェクションからのHTT発現レベルを、精製した組換えFLAGタグ付きHTTを標準物質として、抗FLAG抗体を第1抗体として用いた定量的ウエスタンブロッティングにより推定した。HTT発現レベルが≥2 pg HTT/細胞と推定されたペレットを精製に用いた。 FL HTTの精製は、最初に抗FLAGアフィニティー精製を行い、次にHTTに適した分離範囲を持つゲルろ過カラム上でSECを使用する2段階のカラムプロセスで構成されます(図2A;例については 材料表 を参照)。両方のステップの後、HTTは、分析SEC-MALSに基づいてクーマシーブルーおよび>65%のモノマー含有量を有するSDS-PAGEによって決定された>95%のサンプル純度で得られた。精製時間と温度の両方が最終的なHTTモノマー含有量に悪影響を与えるため、取り扱いを最小限に抑え、一貫したサンプル品質を得るために、FPLCを両方の精製ステップで使用しました。抗FLAG精製中の主要な汚染物質は、質量分析によって測定されたシャペロンHsp70でした(図2B、レーン2)。これは、Hsp70がヒト細胞株24において安定に発現するFL HTTと共精製されるという知見と一致しており、Hsp70が in vivoでのFL HTTの一般的な安定化剤であり得ることを示唆している。 Hsp70汚染は、抗FLAGアフィニティー精製ステップ中に塩化マグネシウムとATPで広範囲に洗浄することで除去できます(図2B、レーン1)。Hsp70を除去すると、FL HTTは高次オリゴマー24 を形成する傾向があり、1 mg/mL≤濃度に維持する必要があります。SEC前の濃縮ステップは、多くの場合、有意な凝集をもたらす可能性があります。したがって、ベストプラクティスは、濃縮せずに、抗FLAG精製からのピーク画分をサイズ排除カラムに直接ロードすることです。SEC後、モノマーFL HTTの最大回収率のためにサンプルを≤1 mg / mLまで濃縮しました。各精製工程から回収されたHTTの量は、定量標準として精製FL HTTを用いたクーマシーブルーまたは定量的ウエスタンブロッティングのいずれかによって推定した(表2)。記載された方法で生産された精製FL HTTタンパク質の典型的な収量は、細胞培養で約1 mg/Lですが、バッチ間のばらつき、または抗FLAG精製樹脂が複数回再利用された場合、それ(表3)をはるかに下回る可能性があります。 FL HTTの過剰発現は、タンパク質22の断片化をもたらし得る。ここに記載の方法で製造されたFL Q23-HTTは、SDS PAGEによって350 kDaの正しいMWを有する単一バンドとして分離され、クマシーG250または銀染色のいずれかによって染色された(図2C)。ウェスタンブロッティングにより、FL Q23-HTTは、N末端、C末端、およびいくつかの中間ドメインのエピトープに対して産生された抗体と反応し、追加のフラグメント関連バンドは観察されず、タンパク質が有意な検出可能な切断なしに単離されたことを示しています(図3A)。FL HTTポリQ長バリアントQ23、Q48、およびQ73は、ウェスタンブロットで予想どおりに反応し、Q長の増加と相関するpolyQ指向性mAb MW1のシグナルが次第に強くなりました:Q23-HTT<Q48-HTT<Q73-HTT(図3B)。N末端エクソン1を標的とする抗体MW1およびMAB549でプローブした場合、ΔExon1-HTT(aa 91-3,144)のシグナルは観察されませんでした(図3B)。 SEC-MALSを用いて、精製HTTタンパク質の凝集状態および分子量を解析した。サンプルは、UV、MALS、およびdRI検出器によって監視される分析SECによって分析されました。SEC-MALSから得られる絶対モル質量は、分子の形状に依存しない33,34;したがって、SEC-MALSは、モノマー画分とオリゴマー画分がよく分離されている場合、MWの偏りのない推定値を提供します。テストしたHPLCカラムの中で、SECカラム(材料表を参照)は、HTTモノマーとダイマーの間で十分な分離能を示し、モル質量を区別できました(図4)。タンパク質濃度はdRI検出により決定した。FL HTTの屈折率増分(dn / dc)は、SEDFITソフトウェア35によって計算された0.1853mL / gです。ΔExon1 HTT(91-3,144)、FL Q23、Q48、およびQ73 HTT(1-3,144)についても同様の分析SEC溶出パターンが観察され、それぞれがマイナーダイマーおよびオリゴマーピークを持つ主要なモノマーピークで構成されています(表4)。単量体形態について計算されたMWは、理論MWよりも大きい。これはおそらく、高次オリゴマーピークからの種の重複と、HTTタンパク質が高次オリゴマーの形成を避けるために低濃度に維持されるため、弱いdRIシグナルに起因するエラーが原因です。精製されたFL HTT変異体のいくつかのバッチのUVピークを統合することにより、polyQ長と凝集体プロファイルとの間に明確な相関は観察されませんでした(表4)。 分析SECに加えて、FL HTTオリゴマー状態を特徴付けるための補完的な方法として使用できるかどうかを判断するために、従来のネイティブPAGEを実施しました。高次オリゴマーは、界面活性剤を含まないネイティブバッファーを使用して3〜8%トリスアセテートゲルを介して分離されました。SECから精製されたFL HTTは、オリゴマー化状態に対応する複数のバンドを示した(図5A)。最も低いバンドは、天然マーカー480 kDaと720 kDaの間に位置し、昆虫細胞から精製されたFL HTTについて報告された以前の結果と同様でした22。しかし、HTTモノマーは、従来のネイティブPAGEを使用した場合、最も豊富なバンドではなく、結果は分析SEC-MALSによって決定された凝集プロファイルと相関していません。FL HTT36、37、38に存在するいくつかの疎水性パッチ、特にHAP40とFL HTT25との間の疎水性界面は、ゲル内の移動中の高次オリゴマーの形成に寄与する可能性があります。これは、疎水性領域が界面活性剤または安定化タンパク質間相互作用の非存在下で互いに相互作用することが知られているためである。HTTの疎水性特性と一致して、FL HTTは、SEC精製ステップ中にCHAPSの非存在下で、増加する量の高次オリゴマー画分を形成します。 疎水性パッチ39を含む膜タンパク質および大きなタンパク質複合体の研究に広く使用されているBlue Native PAGEを、従来のネイティブPAGEと比較した。精製HTTは、Blue Native PAGE上に3つの主要なバンドを示し、推定MWは643、927、および1070 kDa(図5B)で、それぞれHTTの単量体種、二量体種、および三量体種を表す可能性が高い。モノマーバンドは、Blue Native PAGEで最も豊富なバンドであり、同じサンプルの分析SECプロファイルによく対応しています。Blue Native PAGEによるHTTモノマーのMWの過大評価は、対応する分子量マーカー11、23、25に対してより遅い移動を引き起こすHTTの独特の中空球状構造または疎水性領域に起因する可能性がある。全体として、FL Q23-HTT、FL Q48-HTT、FL Q73-HTT、およびΔExon1-HTTは、分子量の違いによりタンパク質バンドの移動にわずかな違いがあるだけで、類似したブルーネイティブPAGEプロファイルを持っています。 精製タンパク質の品質の追加チェックとして、TEVプロテアーゼで処理することにより、C末端FLAGタグをFL HTTから除去することができます。タンパク質分解切断後、4つの抗体を用いたウェスタンブロットによりサンプルを分析し、FLAGタグの除去を確認し、HTT分解を検出しました。抗FLAG M2およびHTTのN末端、中間ドメイン、およびC末端にエピトープを有する3つのハンチンチン特異的抗体に対する免疫反応性は、FLAGタグの除去に成功し、HTT特異的分解産物は示されなかった(補足図S1)。 図 1: 全長 HTT 式の構成。 (A)全長Q23 HTT をコドン最適化し、pcDNA3.1(+)プラスミドにクローニングした。HTTの3’末端にフラグエピトープとTEVプロテアーゼ切断部位をタグ付けして、タグフリーHTTタンパク質を生成しました。ポリグルタミンストレッチとプロリンリッチドメインは、カセットクローニング( Q48 およびQ73)を使用して追加のCAGリピートを挿入し、異なるpolyQ長のHTTバリアントを生成するために、隣接するHindIII制限エンドヌクレアーゼサイトで操作されました。(b)ΔExon1コンストラクトを鋳型としてpcDNA3.1-Q23-HTTを用いてPCR変異誘発を行った。HTTの残基91〜3,144は、発現のためにΔExon1構築物中に残った。略語: HTT = ハンチンチン;CMV =サイトメガロウイルス;Q23 =ポリグルタミンストレッチ;PRD = プロリンリッチドメイン;TEV = タバコエッチングウイルス切断部位。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2:HTTの大規模精製 。 (A)FPLCカラム上のアンチフラグ精製全長Q23-HTTのSECプロファイル。Q23-HTTの高次オリゴマー、二量体、およびモノマーピークが標識されています。モノマーを含む画分を最終HTTサンプルとして回収した。(B)精製Q23-HTTのSDS-PAGEにATP/マグネシウム洗浄ステップ(レーン1)またはATP/マグネシウム洗浄を行わないと、Hsp70共溶出(レーン2)が得られます。(C)クーマシーブルーG-250または銀染色で染色されたSDS-PAGE上の最終精製全長HTTバリアント。略語: FL = 全長;HTT = ハンチンチン;SEC = サイズ排除クロマトグラフィー;FPLC =高速タンパク質液体クロマトグラフィー;O =オリゴマー;D =二量体;M =モノマー;SDS-PAGE = ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動;Hsp70 =ヒートショックタンパク質70。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3:精製HTT変異体のウェスタンブロット分析 。 (a)精製したFL Q23-HTTをSDS-PAGE上で実行し、PVDFメンブレンに移した。一次抗体および相互作用するエピトープは、レーン1、α-FLAG M2、FLAGタグです。レーン2、MAB5492、HTT aa。1-82;レーン3、MAB5490、HTT aa 115-129;レーン4、MAB2166、HTT aa 181-810;レーン5、MAB3E10、HTT aa 1,171-1,177;レーン6、MAB4E10、HTT aa 1,844-2,131;レーン7、MAB2168、HTT aa 2,146-2,541;レーン8、MAB8A4、HTT aa 2,703-2,911。(B)1 μgの精製FL HTT変異体をSDS-PAGE上で実行し、PVDFに移し(左)、複製したSDSゲルを実行し、クマシーブルーで染色しました(右)。一次抗体および相互作用するエピトープは、行1、MW1、拡張PolyQリピートです。行 2, MAB2166, HTT aa 181-810;行3、MAB5492、HTT aa 1-82。略語:FLL Q23-HTT =23個のグルタミン残基を含む完全長ハンチンチンタンパク質;SDS-PAGE = ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動;WB = ウェスタンブロット;M =マーカー;PVDF =ポリフッ化ビニリデン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図4:全長HTTのSEC-MALS分析。 精製した全長Q23-HTTをUPLCカラムで溶出しました。予測されるモノマー、ダイマー、およびオリゴマーのピーク位置が示されます。分子量は、モノマー、二量体、および三量体のピークについて計算し、 表5に列挙した。Q48、Q73、およびΔExon1 HTTについても同様の溶出プロファイルが観察され、各精製でモノマー、ダイマー、オリゴマーの含有量はさまざまです。略語: SEC-MALS = 多角度光散乱によるサイズ排除クロマトグラフィー;UV =紫外線;LS =光散乱;MW =分子量;Q23-HTT = 23個のグルタミン残基を含むハンチンチンタンパク質;M =モノマー;D =二量体;O =オリゴマー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図5:クリアネイティブPAGEまたはブルーネイティブPAGEゲルを使用した精製HTTの特性評価。 SECからのネイティブマーカーおよび見かけのモノマーQ23-HTTは、非変性PAGEシステム(A)およびブルーネイティブPAGEシステム(B)の3〜8%トリスアセテートゲル上で分離されました。略語: FL = 全長;Q23-HTT = 23個のグルタミン残基を含むハンチンチンタンパク質;PAGE = ポリアクリルアミドゲル電気泳動;M =マーカー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 歩 名前 組成 6.1.1 バッファ A 50 mM トリス、500 mM NaCl、5% v/v グリセロール、5 mM EDTA、0.01% v/v Tween-20、pH 8.0。 6.1.2 溶解バッファー 50 mM トリス、500 mM NaCl、5% v/v グリセロール、5 mM EDTA、および 1x プロテアーゼ阻害剤カクテル 6.1.4.2 バッファ A 50 mM トリス、500 mM NaCl、5% v/v グリセロール、5 mM EDTA、0.01% v/v Tween-20、pH 8.0。 6.1.4.3 バッファ B 50 mMトリス;500ミリリットルキロカロリー;5 mM MgCl2;5%v / vグリセロール;0.01% V/V トゥイーン-20, pH 8.0 6.1.4.4 バッファ C 20 mMトリス;200ミリリットルキロカロリー;5 mM MgCl2;5 mM ATP;0.01% V/V トゥイーン-20;5%V / Vグリセロール、pH 8.0 6.1.4.5 バッファ D 50 mMトリス;500 mM NaCl;5%v / vグリセロール;5 mM EDTA;0.5% w/v チャプス, pH 8.0 6.1.4.6 溶出バッファー 50 mMトリス;500 mM NaCl;5%v / vグリセロール;0.5%(チャップス付き)0.2 mg/mL DYKDDDDKペプチド、pH 8.0 6.1.6 再生成バッファ 0.1 M グリシン塩酸塩、pH 3.5;0.01% V/V トゥイーン-20 6.2.1 SEC バッファ 50 mM トリス, 500 mM NaCl, 5% v/v グリセロール, 0.5% w/v CHAPS, 1 mM TCEP 7.3 SEC-MALS バッファ 50 mM HEPES, pH 7.2, 500 mM NaCl, 5% v/v グリセロール, 0.5% w/v CHAPS 8.7 脱染液 40%V/Vメタノールおよび7%V/V酢酸 9.4.2 クーマシー染色液 0.01% w /v クーマシー G250, 50% v/v/ メタノール, 10% v/v 酢酸 9.5.1 固定ソリューション 50% v/v メタノール、10% v/v 酢酸、ホルムアルデヒド 50 μL/100 mL 溶液 表1:バッファーと溶液の組成 ステップス HTT濃度 (ミリグラム/ミリリットル) 総容量(mL) HTT含有量(ミリグラム) 細胞あたりのHTT収量(pg/細胞) % 利回り 上澄み 0.1792 220 39.4 4.4 100 アンチフラッグ 1.524 8.6 13.1 1.47 33.4 秒 0.91 3.9 3.54 0.4 9.1 表2:pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-Flagをトランスフェクトした2 L HEK293ペレットからのHTT収率。 略語:FL Q23-HTT =23個のグルタミン残基を含む完全長ハンチンチンタンパク質;TEV =タバコエッチングウイルス切断部位;SEC = サイズ排除クロマトグラフィー。 HTT サンプル HTT収量 (mg/L) 平均純度(%) ティッカー A280 1 FL DEx1-HTT (N=3) 0.67-1.30 0.69-1.18 99.3 2 FL Q23-HTT (N=3) 0.25-0.92 0.28-0.98 96.9 3 FL Q48-HTT (N=3) 0.28-1.15 0.38-1.16 97.4 4 FL Q73-HTT (N=3) 0.58-1.05 0.57-0.97 98.8 表3:4つのFL HTT変異体精製のタンパク質収率およびそれらの最終純度の要約。 略語:FLL HTT =完全長ハンチンチンタンパク質。 HTT サンプル ある D M FL Q23-HTT 4.2-6.9% 18.7-29.3% 66.5-76.0% FL Q48-HTT 4.0-9.4% 10.6-17.8% 73.6-85.4% FL Q73-HTT 2.0-14.0% 16.9-24.6% 65.1-81.1% 表4:精製からのFL HTT変異体の代表的な凝集体、二量体、およびモノマー含有量の要約。 略語:FL HTT =完全長ハンチンチンタンパク質;A = 集計;D =二量体;M =モノマー;SEC = サイズ排除クロマトグラフィー。 補足図S1:TEVプロテアーゼ消化後のウェスタンブロット解析。 精製したFL Q23-HTTおよびFL Q48-HTTをSDS-PAGE上で実行し、PVDFメンブレンに移し、TEV消化後のウェスタンブロッティングで分析しました。使用した一次抗体は、抗フラグM2(フラグタグ)、MAB5492(HTT aa 1-82)、MAB3E10(HTT aa 997-1,276)、およびMAB2168(HTT aa 2,146-2,541)でした。レーン1、タンパク質標準;レーン2、Q23-HTT-TEVフラグ;レーン3、Q48-HTT-TEVフラグ;レーン4、Q23-HTT-TEV-フラグをTEVプロテアーゼで1:5で処理し、4°Cで一晩処理します。レーン5、Q48-HTT-TEV-フラグをTEVプロテアーゼで1:5で処理し、4°Cで一晩処理しました。 略語:FL HTT =完全長ハンチンチンタンパク質;SDS-PAGE = ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動;TEV =タバコエッチングウイルス;PVDF =ポリフッ化ビニリデン。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図S2:凍結融解サイクルを受けたFL HTT変異体のSEC-MALS分析。 精製したQ23-HTT(A)およびQ48-HTT(B)を-80°Cで凍結し、室温で最大6回解凍しました。次に、最初の凍結融解および6回目の凍結融解サイクル後のQ23-HTTおよびQ48-HTTをSEC-MALSによって分析した。モノマー分率のわずかな減少と二量体および高次オリゴマー画分の増加は、凍結融解サイクルを繰り返した後の光散乱によって観察されました。予測されるモノマー、ダイマー、および高次オリゴマーのピーク位置が示されます。略語:FL HTT =完全長ハンチンチンタンパク質;O =オリゴマー;D =二量体;M =モノマー;SEC-MALS = 多角度光散乱によるサイズ排除クロマトグラフィー。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図S3:凍結融解サイクルを受けたFL HTT変異体のSDSページ。 精製したQ23-HTT(レーン2-7)およびQ48-HTT(レーン9-14)を-80°Cで凍結し、室温で最大6回解凍しました。Q23-HTTおよびQ48-HTTのアリコートは、各凍結融解サイクルの後に保存され、次いでSDS PAGEによって分析された。凝集物または分解生成物の増加は観察されなかった。サンプルは、バンドデンシトメトリーによって安定で>95%純粋であると見なされました。略語:FL HTT =完全長ハンチンチンタンパク質;SDS-PAGE = ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ファイル1:FPLC 15 mLアンチフラグHTTスクリプト。 略語 = FPLC = 高速タンパク質液体クロマトグラフィー;HTT =ハンチンチンタンパク質。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ファイル 2: FPLC SEC_MALS HTT スクリプト。 略語: SEC-MALS = 多角度光散乱によるサイズ排除クロマトグラフィー;FPLC =高速タンパク質液体クロマトグラフィー;HTT =ハンチンチンタンパク質。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。